Summary
该协议提供了两种草药的组合策略来治疗受伤的PC12细胞。该方案为优化中药最佳应用模式提供了参考。
Abstract
针对中药联合治疗脑缺血的优势，我们研究了制剂组合和成分组合在疗效和机制上的差异，以探讨两种中药联合治疗损伤PC12细胞的策略。氯化钴（CoCl2）与无葡萄糖培养基结合诱导PC12细胞的氧化损伤。然后，选择 蒙古黄 芪（Ast）和 短黄芪 （Eri）注射液的最佳组合，在筛选其在PC12细胞上安全有效浓度后，按照统一的设计方法进行组合。此外，筛选的组分组合包括两种草药中的10μM黄芪甲苷A、40μM黄芩苷和75μM绿原酸。然后，采用MTT、膜联蛋白V-FITC/PI、免疫荧光和蛋白质印迹分析，评价制剂组合和组分组合对损伤PC12细胞的疗效和机制。结果表明，细胞促存活的最佳制备组合是Ast注射液和Eri胶囊，浓度为6：1.8（μM）。组分组合（10 μM黄芪甲苷A、40 μM黄芩苷和75 μM绿原酸）比制剂组合更有效。两种组合均显著降低细胞凋亡速率、半胱天冬酶-3的荧光强度和细胞内活性氧（ROS）水平;同时，他们上调了p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax和Nrf2的表达水平。这些影响在组件组合中更为明显。总之，两种组合都可以抑制CoCl2 与无糖培养基联合对PC12细胞诱导的损伤，从而促进细胞存活。然而，组分组合相对于制备组合的效率可能是由于其对与氧化应激和细胞凋亡相关的PI3K/Akt/Nrf2信号通路的更强调节。
Introduction
慢性脑缺血，由脑灌注不足引起，是中老年人常见病1。作为一种长期隐匿性缺血性疾病，可导致进行性或持续性神经功能障碍。主要病理机制包括细胞凋亡和氧化损伤，导致进行性或持续性神经功能障碍;这是阿尔茨海默病、血管痴呆等疾病的病理基础，严重影响患者的生活质量。然而，现代医学中仍然缺乏治疗慢性脑缺血的理想药物2。同时， 蒙古黄芪 （Ast）和 短黄芪 （Eri）的组合已广泛应用于中医（TCM）的临床实践中4。联合策略在促进脑缺血后神经功能恢复方面有明显改善，优于单一药物;但是，两种药物组合的剂量比例存在较大差异4。其有效成分和作用机制尚不明确，是制约其临床应用的关键问题。
已有研究证明了Ast注射液和Eri注射液制剂组合治疗大鼠脑缺血的协同作用。它可以上调p-Akt蛋白的表达，下调Bcl-2相关死亡启动子（BAD）蛋白5，6的表达，Bcl-2是B淋巴母细胞瘤2（Bcl-2）家族蛋白之一，具有促进细胞凋亡的作用。但其协同效应的物质基础和机制尚不清楚。此外，利用CoCl2组合无糖培养基建立了PC12细胞的损伤模型，筛选并定义了Ast和Eri的最佳成分组合7。
在这项研究中，通过使用受伤的PC12细胞模型筛选Ast和Eri的有效剂量。利用该模型结合均质设计方法筛选两种药物的最佳组合。细胞模型用于进一步评估制备组合和组分组合在受伤PC12细胞中的作用和机制的差异。该策略旨在通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路探索两类组合对损伤PC12细胞的保护作用和调控机制，以确定最佳组合模式。本研究为优化中药最佳应用模式提供参考。
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Protocol
1. 试剂的制备
- 通过在 125 mL 无菌培养瓶中加入 90 mL DMEM 高糖培养基、10 mL 胎牛血清 （FBS） 和 1 mL 青霉素-链霉素溶液来制备完整培养基。混合完整的培养基，并在封闭条件下储存在4°C。
- 通过在 10 mL DMEM 无糖培养基（完全溶解）中加入 0.02 g CoCl 2 粉末（准确称量）来制备 CoCl2 溶液，以获得 8.4 mM 储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤溶液，密封，并将其储存在4°C避光。
注意：CoCl2 不稳定，应储存在密封容器中，避光;CoCl2 溶液的有效期为7天。 - 准备三氢盐缓冲盐溶液（TBST）。
- 准确称取8克氯化钠、0.2克氯化钾和3克三碱。将它们加入 1 L 烧杯中，然后加入 1，000 mL RO 水以溶解混合物。
- 将pH调节至7.4，加入1mL吐温20，充分混合，得到TBST溶液。
注意：吐温20可作为表面活性剂减少抗体与抗原的非特异性结合，在0.1%浓度下效果最佳。
- 通过在 20 mL PBS 溶液中称取 0.1 g MTT 粉末以获得 5 mg/mL 储备溶液来制备 MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四唑溴化盐）溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤溶液，密封，并将其储存在4°C远离光线，待命。
注意：MTT粉末不稳定，容易吸收水分，因此应存放在密闭干燥处避光。MTT 解决方案将在 7 天后过期。MTT具有致癌作用，因此请避免直接接触皮肤。 - 通过去除胶囊外壳并准确称取 10 mL DMEM 无糖培养基中的 0.18 g 内容物来制备 Eri 胶囊溶液，以制备 100 μM 储备溶液（基于黄芩的浓度）。用0.2μm细菌过滤器过滤溶液，密封，并将其储存在4°C的密封容器中。
注意：黄芩素是短黄芩的主要活性成分。胶囊中黄芩素的浓度已通过HPLC-UV测定为2.56mg / g，即5.54μmol/ g8。制剂的浓度根据黄芩苷浓度计算。这便于评估制剂和组分的药理活性。 - 通过在 15 mL 无菌离心管中加入 5 mL 进样液和 5 mL 无糖 DMEM 培养基来制备 Ast 注射液，以制备 60 μM 储备溶液（基于黄芪甲苷 A 的浓度）。通过0.2μm细菌过滤器过滤溶液，并将其储存在4°C的密封容器中。
注意：每次进样体积为10mL，注射液中黄芪甲苷A的浓度已通过HPLC-ELSD确定为0.094mg / mL（即120μM）9。制备工作应在生物安全柜中进行，并在整个过程中以防光方式操作。注射液和无糖培养基的体积应准确测量并充分混合。 - 通过准确称取7.85 mg黄芪甲苷A标准品并将其完全溶解在2 mL二甲基亚砜（DMSO）中制备黄芪甲苷A溶液，以制备5，000 μM储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤，并将其密封储存在4°C。
注意：黄芪甲苷A粉末不溶于无糖培养基。制备溶液时，用适量的DMSO溶解，使DMSO的终实验浓度保持在0.1%以下，以确保无细胞毒性。 - 通过准确称取11.56mg黄芩素标准品并用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解来制备黄芩蛋白溶液，以制备5，000μM储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤，并将其密封储存在4°C。
- 通过准确称取8.86mg绿原酸标准品并用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解来制备绿原酸溶液，制备5，000 μM储备溶液。用0.22μm细菌过滤器过滤，并将其密封储存在4°C。
注意：绿原酸粉末不稳定，容易吸水。应密封保存于4°C避光;称重过程中应尽量减少暴露时间。
2. 细胞活力测定
- 获取 PC12 细胞并在补充有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 中培养。
注意：在本研究中，细胞是从中国科学院获得的。PC12细胞是具有神经内分泌细胞一般特征的贴壁细胞，广泛应用于神经生理学和神经药理学。 - 在补充有5%CO 2的培养箱中在37°C下培养细胞，并每2-3 天传代培养一次。在所有实验中使用传代4-8处的细胞。
- 细胞培养
- 用1mL胰蛋白酶（0.25%）处理对数生长期（70%-80%细胞汇合）的PC12细胞，并在显微镜下观察细胞。当细胞变圆时，通过加入 3 mL 的完整培养基停止胰蛋白酶消化。
- 将细胞转移到无菌的15mL离心管中，并以840× g 离心细胞5分钟。弃去上清液，用完全培养基重悬，并将细胞悬液转移到 1.5 mL 微量离心管中。然后使用流式细胞仪计数细胞数。
- 启动流式细胞术软件，在计数设置中选择细胞溶液的相应稀释倍数，从1.5 mL微量离心管中加载细胞样品后单击 密度图 。
- 将细胞群圈出远离 X 轴和 Y 轴，右键单击图下方的数据表，然后选择 X、Y、计数和 Abs 计数。数据表中 Abs Count 下的数据给出了细胞计数结果。
- 将细胞浓度调节至1 x 10 5个细胞/ mL，在96孔板中接种100μL /孔，并在培养箱中以37°C和5 %CO2 培养24小时。
- 筛选正常PC12细胞上两种药物的安全浓度
- 按照步骤2.1-2.2中所述培养细胞。弃去上清液，并用不同终浓度的Ast注射液（4，8，12，16，20和24μM）和Eri胶囊（0.625，1.25，2.5，5，10和20μM）处理正常细胞。处理每组的六个重复孔24小时。
注意：将药物加入培养基中以达到药物的最终浓度（在步骤2.4.1中提到），然后将等体积的培养基加入到每个孔中。吸出上清液时，移液器吸头应轻轻地靠在孔壁上，以避免接触孔底部的细胞。添加不同溶液时，沿孔边缘轻柔快速地添加，更换移液器枪头时要注意，以免影响实验结果。 - 弃去上清液，向每个孔中加入120μLMTT溶液（1mg / mL），并将细胞在37°C孵育4小时。
- 孵育后，再次弃去上清液，并向每个孔中加入 150 μL DMSO。使用涡旋振荡器以240次/分钟（每分钟水平振动次数）的速度摇动板10分钟。
- 使用酶标仪测量每个样品在490nm处的吸光度。计算细胞活力（%），即处理组的吸光度/正常组（对照）的吸光度x 100。
注意：确保 MTT 解决方案在有效期内;如果颜色已更改（变为深绿色），则无法使用。测试细胞吸光度时，应设置空白孔（培养基和MTT，不含细胞或药物）以消除其他试剂的干扰。向每个孔中加入150μL的DMSO体积并摇动10分钟以更好地溶解蓝紫色晶体。应尽快检测吸光度，以确保结果的准确性。
- 按照步骤2.1-2.2中所述培养细胞。弃去上清液，并用不同终浓度的Ast注射液（4，8，12，16，20和24μM）和Eri胶囊（0.625，1.25，2.5，5，10和20μM）处理正常细胞。处理每组的六个重复孔24小时。
- 筛选损伤PC12细胞上两种药物的有效浓度
- 如步骤2.1-2.2所述将细胞培养24小时，弃去上清液，然后用20μL /孔的CoCl2 （0.4mM）结合无糖培养基处理细胞。
- 用100μL /孔的Ast注射液（终浓度为2，6，8，10和12μM）或100μL的Eri胶囊（最终浓度为1，2，3，4和5μM）在37°C下同时处理细胞24小时。向对照组加入 120 μL/孔的完全培养基。
注意：CoCl2 诱导细胞缺氧条件。 - 通过MTT方法测量每个样品的吸光度，并按照前面的步骤2.4.2和2.4.3中所述计算细胞活力。
- 基于均质设计方法的两种药物最优组合筛选
注：在获得黄芪注射液和短囊的有效浓度范围后，采用统一设计方法U 7（7 4）表得到两种药物的六种不同组合。阿斯特注射：Eri胶囊：1）2：2.6微米，2）4：5微米，3）6：1.8微米，4）8：4.2微米，5）10：1微米和6）12：3.4微米。- 如上所述在步骤2.3.1中培养细胞，并如上所述用六比例浓度的Ast注射液：Eri胶囊处理受伤的PC12细胞。
- 处理细胞24小时并计算细胞活力，如前面的步骤2.4.2和2.4.3中所述。
- 两种最佳组合对损伤PC12细胞的保护作用评价
注意：在获得最佳制备组合（Ast注射液：6：1.8μM的Eri胶囊）和最佳组分组合7 （10μM黄芪甲苷A，40μM黄芩苷和75μM绿原酸）后，进行进一步评估以检查它们对受伤PC12细胞的保护作用。- 如上所述在步骤2.3.1中培养细胞，并用上述NOTE中讨论的两种类型的药物组合治疗受伤的PC12细胞。
- 处理细胞24小时并计算细胞活力，如前面的步骤2.4.2和2.4.3中所述。
3. 膜联蛋白 V-FITC/PI 测定细胞凋亡率
- 将PC12细胞接种在浓度为1.3 x 105 个细胞/孔的12孔板中，并在37°C下培养24小时。
- 细胞分组：对照组、模型组和两种药物组合。向对照组添加 1.2 mL/孔的完全培养基，向模型组添加 1.2 mL/孔含有 0.4 mM CoCl 2 的培养基，并向含有 0.4 mM CoCl 2 的两种组合中各添加1.2 mL/孔。将细胞在37°C下再孵育24小时。
- 药物治疗后，用 250 μL/孔胰蛋白酶处理细胞，将细胞转移到 15 mL 离心管中，并在室温 （RT） 下以 840 xg 离心 5 分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于500μL结合缓冲液中。
- 在室温下用 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 10 μL 碘化丙啶 （PI） 在黑暗中孵育细胞 15 分钟，然后通过流式细胞术检查细胞凋亡。在每组中设置三个重复孔。
注意：本测试中使用的胰蛋白酶不能含有EDTA，因为EDTA是一种金属离子螯合剂，与膜联蛋白V竞争结合钙离子并影响膜联蛋白对PI的亲和力。当细胞凋亡发生时，原本位于细胞膜内侧的磷酸丝氨酸向外转向细胞表面，膜联蛋白V-FITC选择性地与膜外的磷丝氨酸结合，显示绿色荧光。 - 单击“开始”菜单中的“自动补偿”，在“选择”通道中选择“FITC”、“PE”、“PerCP”和“APC”，然后选择“高度补偿”。在统计项目：中位数中单击确定。使用步骤2.3.2中提到的相同细胞计数方法，收集细胞样本，单击密度图，然后圈出有效细胞群。
- 使用 FITC 荧光作为 X 轴参数，将其他荧光参数作为 Y 轴参数，创建密度图。单击“开始”菜单中的“补偿矩阵”和“溢出矩阵中的系数”。显示密度图信息以分析细胞凋亡率。
- 在室温下用 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 10 μL 碘化丙啶 （PI） 在黑暗中孵育细胞 15 分钟，然后通过流式细胞术检查细胞凋亡。在每组中设置三个重复孔。
4. 半胱天冬酶-3生成的免疫荧光检测
- 将PC12细胞以8 x 104个细胞 /盖玻片的密度接种到盖玻片上，并将它们放入37°C的24孔板中24小时。按照上述步骤3.2中提到的对单元格进行分组;为每个组设置三个复制盖玻片。
- 药物治疗后，用PBS（37°C）冲洗盖玻片两次，每次5分钟，用4%多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.5%Triton X-100透化20分钟。
- 再次冲洗细胞，并在室温下用10%山羊血清封闭1小时。
- 将每个盖玻片与200μL一抗半胱天冬酶-3（细胞凋亡的关键执行蛋白）孵育，在1x TBST中以1：250的浓度稀释，在4°C下过夜。 用 1x TBST（每次 3 次，每次 3 分钟）洗涤，并与 200 μL 二抗（1x TBST 中的 1：300 稀释液）在黑暗中的室温下孵育 1 小时。
注意：荧光很容易淬灭;因此，在二抗孵育后，载玻片应远离光线。一抗和二抗应储存在4°C避光。 - 向盖玻片（检测细胞核）中加入 300 μL DAPI （0.5 μg/mL） 10 分钟，并用 1x TBST 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
- 在荧光显微镜下观察盖玻片并捕获图像10。使用成像软件对荧光强度进行统计分析。
注意：使用的载玻片和盖玻片应清洁无菌。染色时，注意染色液的pH值、浓度、温度，避免荧光淬灭。荧光显微镜应至少提前15分钟打开以预热汞灯，并在再次打开之前关闭30分钟。获取图像时，同一批次实验中同一染料的曝光参数应保持一致，以确保结果的准确性。
5. ROS水平的免疫荧光测定
- 如步骤4.1中所述培养和处理细胞。
- 药物治疗后，用PBS洗涤每个盖玻片3分钟，并与400μLDCFH-DA（10μM）在37°C孵育20分钟。
注意：DCFH-DA是氧化应激的通用指标。它具有细胞膜通透性，无荧光。一旦进入细胞，它被酯酶水解产生2'，7'-二氯二氢荧光素（DCFH），然后迅速氧化产生强荧光产物。 - 用无血清DMEM再次洗涤细胞（每次两次，每次3分钟），并在荧光显微镜下加入荧光淬灭剂后立即观察盖玻片。通过成像软件计算相对荧光强度。
注意：加载DCFH-DA探头后，请务必清洁未进入电池的残留探头，否则背景会变高。
6. Nrf2、p-Akt、Akt、Bcl-2 和 Bax 11，12 蛋白表达的蛋白质印迹检测
- 以1 x 10 6细胞/孔的浓度接种6孔板中的PC12细胞， 并在37°C下培养24小时。如步骤4.1中所述对细胞进行分组和处理，并在每组中设置三个重复孔。
- 药物治疗24小时后，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟，并在制备的裂解缓冲液中在冰上孵育30分钟。裂解后，将细胞在16，000× g 和4°C下离心20分钟并收集上清液。
- 检测蛋白质浓度并通过布拉德福德测定根据说明进行调整。稀释样品并在100°C下变性10分钟。
注意：裂解缓冲液由磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和RIPA裂解物组成，体积比为1：1：50。对照组需要200 μL/孔裂解缓冲液，其他组需要100 μL/孔裂解缓冲液。通常，对照组、模型组和两类组合组的蛋白质浓度分别为0.45 mg/mL、0.25 mg/mL和0.32-0.39 mg/mL;用上样缓冲液稀释后的蛋白质浓度分别为0.36、0.2和0.256-0.312 mg/mL。 - 要检测具有不同分子量的蛋白质，请在每个泳道中上样 25 μg 蛋白质，运行 12% SDS-PAGE 电泳，然后将凝胶转移到 PVDF 膜上。
注意：在制备SDS凝胶的过程中，必须充分混合，没有气泡或不溶性颗粒;否则，可能会出现不均匀或不规则的条带。转印膜时，请确保PVDF膜和凝胶之间没有气泡;否则，条带中会出现白点。此外，此步骤必须在低温下进行，并且应每30分钟更换一次冰袋。 - 用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1.5小时，并与5mL相应的一抗（Nrf 2 1：1，000，Akt 1：2，000，p-Akt 1：2，000，Bcl-2 1：5，000和Bax 1：1，000）在4°C孵育24小时。 使用β-肌动蛋白（1：5，000）抗体作为内部对照。
- 用TBST洗涤膜（三次，每次10分钟），然后在室温下与5mL二级HPR偶联抗体（1：5，000）孵育2小时。
注意：抗体的稀释比例不应随意改变，膜应严格按照要求用TBST充分洗涤，以避免条带的背景色太黑。 - 最后，再次用TBST洗涤膜，并用化学发光HRP底物（按照制造商的说明）处理以进行蛋白质条带检测。使用化学发光成像系统捕获图像，并使用成像软件量化蛋白质的灰度值，β-肌动蛋白作为比较内部对照。
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Representative Results
Ast注射液和Eri胶囊的最佳组合的筛选如图1所示。Ast注射液和Eri胶囊在正常PC12细胞上的细胞存活率如图1A所示。浓度大于12μM的Ast注射液（图1A）和浓度大于5μM的Eri胶囊（图1A）的细胞活力低于95%，表明最大无毒浓度分别为12μM和5μM。它们的细胞毒性大于单独使用的黄芪甲苷A和黄芩苷。Ast注射液和Eri胶囊对CoCl2诱导的损伤PC12细胞的活力如图1B，C所示。与模型组相比，Ast注射液在6-12 μM浓度范围内可提高损伤PC12细胞的存活率（p < 0.05或p < 0.01），浓度为2-5 μM的Eri胶囊可提高存活率（p < 0.05或p < 0.01）。AST注射液和Eri胶囊的比例为10：1，8：4.2和6：1.8μM可以显着增加损伤PC12细胞的活力（p <0.01）（图1D）。6：1.8 μM的比例表现出最高的细胞活力，表明与最佳组分组合相比，它是最佳的制备组合和药理活性。
两种组合对损伤PC12细胞的保护作用的评估如图2所示。与模型组相比，两种组合的细胞活力显著提高（p < 0.001），组分组合优于制备组合（图2A）。这表明组分组合比制剂组合更能促进细胞存活。通过流式细胞术测试细胞凋亡率（图2B，C）。与正常组相比，模型组早期、晚期和总凋亡细胞的百分比显著较高（p < 0.01或p < 0.001）。与模型组相比，治疗组各分期凋亡细胞百分比显著降低（p < 0.05或p < 0.01，或p < 0.001）。各组半胱天冬酶-3蛋白表达的荧光强度如图2D，E所示。与正常组相比，模型组半胱天冬酶-3的荧光强度显著较高。与模型组相比，各处理组半胱天冬酶-3的荧光强度显著降低（p < 0.001或p < 0.01），组分组合组的荧光强度相对低于制剂组合组。这些结果表明，该细胞模型能够诱导细胞凋亡，且组分组合的抗凋亡效果优于制剂组合。
蛋白质印迹检测p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达（图3）。与正常组相比，模型组p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax的表达水平显著降低（p < 0.01或p < 0.001）。与模型组相比，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax在两种组合中的表达显著较高（p < 0.05或p < 0.01，或p < 0.001），特别是在组分组合中更高。结果表明，该组分组合在促进细胞存活方面优于制剂组合，这与上调Akt/Bcl-2/Bax信号通路产生的更强的抗细胞凋亡作用有关。
DCFH的荧光可以通过荧光显微镜测量以确定细胞中ROS的水平（图4A，B）。如图 4A所示，荧光在正常细胞中几乎不可见，并且模型组中的荧光显着增强。与模型组相比，两种组合的荧光均显著降低。 如图4B所示，与模型组相比，各处理组的相对荧光强度明显弱（p < 0.001）。与制剂组合组相比，组分组合组的荧光有降低的趋势，表明细胞模型可诱导氧化损伤。组分组合的抗氧化损伤效果优于制剂组合。
蛋白质印迹法检测到Nrf2蛋白的表达（图4C）。与正常组相比，模型组Nrf2表达显著降低（p < 0.05）。与模型组相比，Nrf2蛋白在治疗组中的表达显着更高（p < 0.01或p < 0.05），特别是在组分组合组中更高（图4D）。这表明成分组合在促进细胞存活方面优于制剂组合，这与上调Nrf2信号通路产生的更强的抗氧化损伤有关。
总之，组分组合（10 μM黄芪甲苷A、40 μM黄芩苷和75 μM绿原酸）通过加强对细胞凋亡和氧化损伤相关信号通路的调控，比制剂组合（6 μM Ast注射液和1.8 μM Eri胶囊）更能促进损伤细胞的存活。
使用SPSS统计软件26.0进行统计分析，所有数据均表示为标准差（SD）±平均值。对于组间比较，数据通过单因素方差分析进行评估，然后是Tukey检验。 p < 0.05 被认为表示存在统计学上的显著差异。
图1：药物对正常和受伤PC12细胞活力的影响 。 （A）不同浓度的Ast注射液和不同浓度的Eri胶囊对正常PC12细胞的影响。（B）筛选Ast注射液对受伤PC12细胞的有效浓度。（C）筛选Eri胶囊对损伤PC12细胞的有效浓度。（D）两种药物不同比例组合对受损PC12细胞存活率的影响。统计值表示为六个独立实验的平均值±SD。 &&p <对照组相比为0.01。*与 模型组相比，p < 0.05 和 **p < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
图2：两种组合对受损PC12细胞存活和凋亡 的影响。 （A）组分组合和制剂组合对受损PC12细胞存活率的影响。（B）膜联蛋白V-PI检测到的细胞凋亡率图。（C）细胞凋亡率的统计直方图。（D）半胱天冬酶-3蛋白表达的相对荧光强度（400x）。比例尺：20 μm。 （E）半胱天冬酶-3蛋白表达荧光强度的统计直方图。统计值表示为三个独立实验的平均值±SD，六个独立实验的细胞活力除外。与模型 组相比，< 0.05、< 0.01 和 0.001 和 < 0.001。# #p < 0.01 与制剂组合组相比。 请点击此处查看此图的大图。
图3：两种组合对p-Akt，Akt，Bcl-2和Bax表达水平的影响 。 （A）通过蛋白质印迹分析测定p-Akt和Akt的蛋白表达。（B）每组p-Akt/Akt比率统计的统计直方图。（C）通过蛋白质印迹分析测定Bcl-2和Bax的蛋白表达。（D）每组Bcl-2/Bax比率的统计直方图。统计值表示为三个独立实验的平均值±SD。与模型 组相比，< 0.05、< 0.01 和 0.001 和 < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：两种组合对 Nrf2 蛋白表达和 ROS 水平的影响。 （A）通过荧光显微镜（400x）检测ROS水平。比例尺：20 μm。 （B）每组ROS荧光强度的统计直方图。（C）通过蛋白质印迹分析测定Nrf2蛋白表达。（D）Nrf2蛋白表达的统计直方图。统计值表示为三个独立实验的平均值±SD。与模型 组相比，< 0.05、< 0.01 和 0.001 和 < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
现代临床实践中治疗脑缺血的理想药物尚缺乏2.在补气、活血化血法的指导下，Ast、Eri等制剂在中医临床实践中联合使用，取得了良好的综合优势13、14、15。大量研究表明，Ast可以改善血脑屏障的通透性，增加脑血流量，提高神经细胞耐受缺氧和抵抗氧自由基损伤的能力，并能显著改善神经功能障碍16，17。特别适用于老年性缺血性脑血管病16、17。Eri可以扩张血管，增加大脑的血液供应，去除ROS，减少脂质过氧化18，19。然而，两种药物的协同作用、药效学成分、机制尚不明确，是制约中医药临床应用的常见问题。
慢性脑缺血的缺血缺氧环境诱导氧化应激损伤，同时激活脑细胞凋亡信号通路，促进神经元凋亡20，21。PI3K/Akt通路是经典的抗凋亡和促生存信号转导通路22，23，其中Bcl-2家族蛋白和半胱天冬酶家族是该信号通路的下游执行蛋白。磷酸化的Akt可以直接或间接调节Bcl-2家族并抑制半胱天冬酶-3下游途径的活化，从而发挥抗凋亡作用11。此外，缺氧产生的过量ROS可诱发氧化应激损伤，而磷酸化的Akt可激活Nrf2消除过量ROS以对抗氧化应激损伤12，24。因此，激活PI3K/Akt/Nrf2通路可以有效预防和控制氧化应激和细胞凋亡，从而减少缺氧缺血性脑损伤25，26。
在研究中，使用受伤的PC12细胞模型筛选制剂组合，并将该模型中的效果和机制与先前筛选的成分组合进行比较7。此外，Ast注射液和Eri胶囊的最大无毒浓度分别为12μM（用黄芪甲苷A计算）和5μM（用黄芩苷计算），而黄芩甲苷A和黄芩苷的最大无毒浓度分别为20μM和50μM，分别为7。结果表明，组分组合比制剂组合更安全，质量更可控，具有高效低毒的综合优势。
目前可用于模拟脑缺血的细胞模型主要包括物理缺氧（由OGD诱导）和化学缺氧（由Na 2 S 2 O4或CoCl 2诱导）27。其中，OGD和Na 2 S2O4损伤缺氧时间短，不适合模拟慢性缺血27。与 OGD 和其他缺氧模拟物相比，CoCl2 诱导的缺氧是最常用的缺氧模拟物之一。它可以导致ROS的持续和稳定的氧化损伤，并在不同的细胞系中产生典型的凋亡变化27。因此，在本研究中，使用CoCl 224 h模拟神经元缺氧28，29。筛选其建模浓度（0.1、0.2、0.4和0.8 mM）和有效期（1和7 d）。此外，鉴于脑缺血后不可避免地缺乏葡萄糖和氧气，无糖和缺氧环境可以更好地模拟脑缺血性损伤。本研究表明，0.4 mM CoCl2与无糖培养基联合24 h可以建立稳定可控的慢性缺氧细胞模型。在后续研究中，将使用慢性脑缺血的动物模型进一步验证成分组合在体内的治疗优势。
该细胞模型可以提高细胞凋亡率、半胱天冬酶-3荧光强度和细胞内ROS水平（图2 和 图4），可以更好地模拟慢性脑缺血的病理变化，如细胞凋亡、氧化应激等。基于该模型，发现两种类型的组合可以抑制细胞凋亡和氧化应激损伤。组分组合对促进细胞存活的效果明显优于制剂组合（图1）;两种组合都可以在不同程度上上调P-Akt/Akt、Bcl-2/Bax和Nrf2的表达水平（图3 和 图4）。特别是，组分组合对Akt/Bcl-2/Bax和Nrf2信号通路的上调有更强的影响。这些结果表明，组分组合比制剂组合能更好地抵抗细胞损伤，这与更强的抗细胞凋亡和抗氧化应激有关。
综上所述，本研究结果为两种中药材联合治疗损伤PC12细胞提供了策略，为评价和优化两种中药材联合施用模式提供了新的思路。本研究为中药活性成分组合的选择提供了参考。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
本研究由四川省科技厅重点研发项目（2020YFS0325）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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