Summary
Denne protokol giver en kombinationsstrategi af to urter til behandling af skadede PC12-celler. Protokollen giver en reference til optimering af den bedste applikationstilstand for traditionel kinesisk medicin (TCM).
Abstract
I lyset af fordelene ved kombinationen af traditionel kinesisk medicin (TCM) til behandling af cerebral iskæmi undersøgte vi forskellene i effekt og mekanisme mellem præparatkombinationen og komponentkombinationen for at udforske de to urtekombinationsstrategier til behandling af skadede PC12-celler. Koboltchlorid (CoCl2) kombineret med et glukosefrit medium blev anvendt til at inducere oxidativ skade på PC12-celler. Derefter blev den optimale kombination af Astragalus mongholicus (Ast) og Erigeron breviscapus (Eri ) injektion valgt og kombineret efter ensartede designmetoder efter screening af deres sikre og effektive koncentration på PC12-celler. Endvidere omfatter den screenede komponentkombination 10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin og 75 μM chlorogen syre i to urter. Derefter blev MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescens og Western blot-analyse brugt til at evaluere effektiviteten og mekanismen af præparatkombinationen og komponentkombinationen på skadede PC12-celler. Resultaterne viste, at den optimale præparationskombination til cellepro-overlevelse var Ast-injektion og Eri-kapsel med en koncentration på 6:1,8 (μM). Komponentkombinationen (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin og 75 μM chlorogen syre) var mere effektiv end præparatkombinationen. Begge kombinationer reducerede bemærkelsesværdigt apoptotisk hastighed, fluorescensintensiteten af caspase-3 og intracellulære reaktive iltarter (ROS) niveau; i mellemtiden opregulerede de ekspressionsniveauerne for p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax og Nrf2. Disse virkninger var mere tydelige i komponentkombinationen. Afslutningsvis kan begge kombinationer hæmme skaden induceret af CoCl2 kombineret med et glukosefrit medium på PC12-celler og dermed fremme celleoverlevelse. Imidlertid kan effektiviteten af komponentkombinationen i forhold til præparatkombinationen skyldes dens stærkere regulering af PI3K / Akt / Nrf2-signalvejen relateret til oxidativ stress og apoptose.
Introduction
Kronisk cerebral iskæmi, forårsaget af cerebral hypoperfusion, er en almindelig sygdom hos midaldrende og ældre mennesker1. Som en langsigtet okkult iskæmi sygdom, kan det føre til progressiv eller vedvarende neurologisk dysfunktion. De vigtigste patologiske mekanismer omfatter celleapoptose og oxidativ skade, hvilket fører til progressiv eller vedvarende neurologisk dysfunktion; Dette er det patologiske grundlag for Alzheimers sygdom, vaskulær demens og andre sygdomme og påvirker patienternes livskvalitet alvorligt. Der er dog stadig mangel på ideelle lægemidler i moderne medicin til behandling af kronisk cerebral iskæmi2. Samtidig er kombinationen af Astragalus mongholicus (Ast) og Erigeron breviscapus (Eri ) blevet anvendt i vid udstrækning i den kliniske praksis med traditionel kinesisk medicin (TCM)4. Kombinationsstrategien er bemærkelsesværdigt forbedret med hensyn til at fremme genopretningen af nervefunktionen efter cerebral iskæmi, hvilket er bedre end for et enkelt lægemiddel; Der er imidlertid store forskelle i doseringsforholdet i kombinationen af de to lægemidler4. De effektive komponenter og virkningsmekanismer er ikke veldefinerede, hvilket er det centrale spørgsmål, der begrænser dets kliniske anvendelse.
Tidligere undersøgelser har vist den synergistiske virkning af præparatkombinationen af Ast-injektion og Eri-injektion til behandling af cerebral iskæmi hos rotter. Det kan opregulere ekspressionen af p-Akt-protein og nedregulere ekspressionen af Bcl-2-associeret dødspromotor (BAD) protein5,6, som er et af B-lymfoblastoma 2 (Bcl-2) familieproteinerne og har den virkning at fremme apoptose. Det materielle grundlag og mekanismen for dets synergistiske virkning er imidlertid ikke klart. Endvidere blev skadesmodellen af PC12-celler etableret medCoCl2 kombineret glukosefrit medium, og den optimale komponentkombination i Ast og Eri er blevet screenet og defineret7.
I denne undersøgelse screenes de effektive doser af Ast og Eri ved hjælp af den skadede PC12-cellemodel. Den optimale kombination af de to lægemidler screenes ved hjælp af denne model kombineret med den homogene designmetode. Cellemodellen bruges til yderligere at evaluere forskellen i virkningerne og mekanismerne af præparatkombinationen og komponentkombinationen i skadede PC12-celler. Denne strategi sigter mod at undersøge beskyttelseseffekten og reguleringsmekanismen for de to typer kombinationer på skadede PC12-celler gennem PI3K / Akt / Nrf2-signalvejen for at bestemme den bedste kombinationstilstand. Denne undersøgelse giver en reference til optimering af den bedste applikationstilstand for TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagens
- Forbered det komplette substrat ved at tilsætte 90 ml DMEM-medium med højt sukkerindhold, 10 ml føtalt bovint serum (FBS) og 1 ml penicillin-streptomycinopløsning i en 125 ml steril dyrkningskolbe. Hele substratet blandes og opbevares ved 4 °C under lukkede forhold.
- Forbered CoCl 2-opløsningen ved at tilsætte 0,02 g CoCl2-pulver (nøjagtigt afvejet) i 10 ml DMEM sukkerfrit medium (opløst fuldstændigt) for at opnå en 8,4 mM stamopløsning. Opløsningen filtreres med et 0,22 μm bakteriefilter, forsegles og opbevares ved 4 °C væk fra lys.
BEMÆRK: CoCl2 er ustabil og skal opbevares i en lufttæt beholder, beskyttet mod lys; gyldighedsperioden for CoCl2-opløsningen er 7 dage. - Forbered Tris-Hcl bufret saltopløsning (TBST).
- Væg nøjagtigt 8 g natriumchlorid, 0,2 g kaliumchlorid og 3 g Tris-base. Tilsæt dem i et 1 L bægerglas, og tilsæt derefter 1.000 ml RO-vand for at opløse blandingen.
- pH-værdien justeres til 7,4, der tilsættes 1 ml Tween 20, og blandingen grundigt for at opnå TBST-opløsningen.
BEMÆRK: Tween 20 fungerer som et overfladeaktivt middel til at reducere den uspecifikke binding af antistoffer til antigener og fungerer bedst ved 0,1% koncentration.
- Der fremstilles MTT-opløsning (3-(4,5-dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromidsalt) ved at veje 0,1 g MTT-pulver i 20 ml PBS-opløsning for at opnå en 5 mg/ml stamopløsning. Opløsningen filtreres med et 0,22 μm bakteriefilter, forsegles og opbevares ved 4 °C væk fra lys, sat på standby.
BEMÆRK: MTT-pulver er ustabilt og absorberer let fugt, så det skal opbevares på et lukket og tørt sted væk fra lys. MTT-opløsningen udløber efter 7 dage. MTT har en kræftfremkaldende virkning, så undgå direkte kontakt med huden. - Forbered Eri-kapselopløsningen ved at fjerne kapselskallen og nøjagtigt veje 0,18 g af indholdet i 10 ml DMEM sukkerfrit medium for at fremstille en 100 μM stamopløsning (baseret på koncentrationen af scutellarin). Opløsningen filtreres med et 0,2 μm bakteriefilter, forsegles og opbevares i en lufttæt beholder ved 4 °C.
BEMÆRK: Scutellarin er den vigtigste aktive ingrediens i Erigeron breviscapus. Koncentrationen af scutellarin i kapslerne er ved HPLC-UV bestemt til 2,56 mg/g, dvs. 5,54 μmol/g8. Koncentrationen af præparatet beregnes ud fra scutellarinkoncentrationen. Dette er praktisk til evaluering af præparatets og komponentens farmakologiske aktivitet. - Forbered opløsningen af Ast-injektionen ved at tilsætte 5 ml injektion og 5 ml sukkerfrit DMEM-medium i et 15 ml sterilt centrifugeglas for at fremstille en 60 μM stamopløsning (baseret på koncentrationen af astragalosid A). Opløsningen filtreres gennem et 0,2 μm bakteriefilter, og den opbevares i en lufttæt beholder ved 4 °C.
BEMÆRK: Injektionsvolumen er 10 ml hver, og koncentrationen af astragalosid A i injektionen er ved HPLC-ELSD bestemt til 0,094 mg/ml (dvs. 120 μM)9. Forberedelsen skal udføres i et biosikkerhedsskab og betjenes på en lystæt måde hele vejen igennem. Volumenet af injektionsopløsningen og det sukkerfrie medium skal måles nøjagtigt og blandes godt. - Forbered astragalosid A-opløsning ved nøjagtigt at veje 7,85 mg astragalosid A-standard og opløse den fuldstændigt i 2 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at fremstille en 5.000 μM stamopløsning. Det filtreres med et 0,22 μm bakteriefilter og opbevares lufttæt ved 4 °C.
BEMÆRK: Astragalosid A-pulver er uopløseligt i det sukkerfrie medium. Ved fremstilling af opløsningen opløses den med den passende mængde DMSO for at holde den endelige eksperimentelle koncentration af DMSO under 0,1% for at sikre ingen cytotoksicitet. - Forbered scutellarinopløsningen ved at veje 11,56 mg scutellarinstandard nøjagtigt og opløs den fuldstændigt med 5 ml sukkerfrit DMEM-medium for at fremstille en 5.000 μM stamopløsning. Det filtreres med et 0,22 μm bakteriefilter og opbevares lufttæt ved 4 °C.
- Forbered chlorogensyreopløsningen ved at veje 8,86 mg chlorogensyrestandard nøjagtigt og opløs den fuldstændigt med 5 ml sukkerfrit DMEM-medium for at fremstille en 5.000 μM stamopløsning. Det filtreres med et 0,22 μm bakteriefilter og opbevares lufttæt ved 4 °C.
BEMÆRK: Klorogent syrepulver er ustabilt og absorberer let vand. Det skal forsegles og opbevares ved 4 °C væk fra lys; Eksponeringstiden bør minimeres under vejning.
2. Analyse af cellelevedygtighed
- Få PC12-celler og dyrk dem i DMEM suppleret med 10% FBS, 100 E / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
BEMÆRK: I denne undersøgelse opnås cellerne fra det kinesiske videnskabsakademi. PC12-celler er klæbende celler, der har de generelle egenskaber ved neuroendokrine celler og anvendes i vid udstrækning i neurofysiologi og neurofarmakologi. - Cellerne dyrkes ved 37 °C i en inkubator suppleret med 5% CO 2 og subkultureres hver2 .-3. dag. Brug celler i passager 4-8 til alle eksperimenter.
- Cellekultur
- Behandl PC12-celler i den logaritmiske vækstfase (70% -80% cellesammenløb) med 1 ml trypsin (0,25%) og observer cellerne under et mikroskop. Når cellerne bliver runde, stoppe trypsin fordøjelsen ved at tilføje 3 ml af hele medium.
- Overfør cellerne til et sterilt 15 ml centrifugerør og centrifuger cellerne ved 840 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, resuspenderes med hele substratet, og cellesuspensionen overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Tæl derefter antallet af celler ved hjælp af et flowcytometer.
- Start flowcytometrisoftwaren, vælg det tilsvarende fortyndingsmultiplum af celleopløsningen i tælleindstillingen, og klik på densitetsdiagram efter indlæsning af celleprøven fra 1,5 ml mikrocentrifugerøret.
- Cirkel cellepopulationen væk fra X-aksen og Y-aksen, højreklik på datatabellen under figuren, og vælg X, Y, Antal og Abs-antal. Dataene under Abs-tælling i datatabellen giver celletællingsresultatet.
- Cellekoncentrationen justeres til 1 x 10 5 celler/ml, 100 μL/brønd podes i plader med 96 huller, og der dyrkes ved 37 °C og5 % CO2 i en inkubator i 24 timer.
- Screening af sikre koncentrationer af to lægemidler på normale PC12-celler
- Kulturér cellerne som beskrevet i trin 2.1-2.2. Supernatanten kasseres, og de normale celler behandles med forskellige slutkoncentrationer af Ast-injektion (4, 8, 12, 16, 20 og 24 μM) og Eri-kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 og 20 μM). Behandl seks replikate brønde i hver gruppe i 24 timer.
BEMÆRK: Lægemidlerne tilsættes til medierne for at opnå den endelige koncentration af lægemidlet (nævnt i trin 2.4.1), og derefter tilsættes et lige stort volumen medier til hver brønd. Ved opsugning af supernatanten skal pipettespidsen placeres forsigtigt mod brøndvæggen for at undgå at komme i kontakt med cellerne i bunden af brønden. Når du tilføjer forskellige opløsninger, skal du tilføje dem forsigtigt og hurtigt langs kanterne af brøndene og være opmærksom, når du skifter pipettepistolhovedet for at undgå at påvirke de eksperimentelle resultater. - Supernatanten kasseres, der tilsættes 120 μl MTT-opløsning (1 mg/ml) til hvert hul, og cellerne inkuberes i 4 timer ved 37 °C.
- Efter inkubationen kasseres supernatanten igen, og der tilsættes 150 μL DMSO til hvert hul. Ryst pladen i 10 minutter med en hastighed på 240 gange/min (antal vandrette vibrationer pr. minut) ved hjælp af en hvirveloscillator.
- Absorbansen af hver prøve måles ved 490 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Beregn cellelevedygtigheden (%), som er absorbansen af den behandlede gruppe/absorbansen af normal gruppen (kontrol) x 100.
BEMÆRK: Sørg for, at MTT-løsningen er inden for gyldighedsperioden; Hvis farven er ændret (til mørkegrøn), kan den ikke bruges. Ved test af absorbansen af celler skal der indstilles en blind brønd (dyrkningsmedium og MTT uden celler eller lægemidler) for at eliminere interferens fra andre reagenser. Et volumen på 150 μL DMSO tilsættes til hvert hul og rystes i 10 minutter for at opløse de blålilla krystaller bedre. Absorbansen bør detekteres så hurtigt som muligt for at sikre, at resultaterne er nøjagtige.
- Kulturér cellerne som beskrevet i trin 2.1-2.2. Supernatanten kasseres, og de normale celler behandles med forskellige slutkoncentrationer af Ast-injektion (4, 8, 12, 16, 20 og 24 μM) og Eri-kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 og 20 μM). Behandl seks replikate brønde i hver gruppe i 24 timer.
- Screening af effektive koncentrationer af to lægemidler på skadede PC12-celler
- Cellerne dyrkes i 24 timer som nævnt i trin 2.1-2.2, supernatanten kasseres, og cellerne behandles derefter med 20 μL/hul CoCl2( 0,4 mM) kombineret med det sukkerfrie substrat.
- Behandl samtidig cellerne med 100 μL/hul Ast-injektion (slutkoncentrationer er 2, 6, 8, 10 og 12 μM) eller 100 μL Eri-kapsel (slutkoncentrationer er 1, 2, 3, 4 og 5 μM) ved 37 °C i yderligere 24 timer. Der tilsættes 120 μL/hul komplet substrat til kontrolgruppen.
BEMÆRK: CoCl2 inducerer hypoxiske tilstande i cellerne. - Hver prøves absorbans måles ved hjælp af MTT-metoden, og cellelevedygtigheden beregnes som beskrevet tidligere i trin 2.4.2 og 2.4.3.
- Screening af den optimale kombination af to lægemidler baseret på den homogene designmetode
BEMÆRK: Efter opnåelse af det effektive koncentrationsområde for Astragalus-injektionen og breviscapus-kapslen blev tabellen med ensartet designmetode U 7 (7 4) anvendt til at opnå seks forskellige kombinationer af de to lægemidler. Ast-injektion:Eri-kapsel: 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM og 6)12:3,4 μM.- Dyrk cellerne som beskrevet ovenfor i trin 2.3.1, og behandl de skadede PC12-celler med seks proportionskoncentrationer af Ast-injektion:Eri-kapsel som nævnt ovenfor.
- Cellerne behandles i 24 timer, og cellelevedygtigheden beregnes som beskrevet tidligere i trin 2.4.2 og 2.4.3.
- Evaluering af den beskyttende virkning af to optimale kombinationer på skadede PC12-celler
BEMÆRK: Efter opnåelse af den optimale præparationskombination (Ast-injektion: Eri-kapsel på 6: 1,8 μM) og den optimale komponentkombination7 (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin og 75 μM chlorogensyre) udføres yderligere evaluering for at kontrollere deres beskyttende virkninger på skadede PC12-celler.- Dyrk cellerne som beskrevet ovenfor i trin 2.3.1, og behandl de skadede PC12-celler med de to typer kombinationer af lægemidler som diskuteret i noten ovenfor.
- Cellerne behandles i 24 timer, og cellelevedygtigheden beregnes som beskrevet tidligere i trin 2.4.2 og 2.4.3.
3. Bilag: V-FITC/PI-assay for apoptoserate
- PC12-cellerne frøs i en plade med 12 huller i en koncentration på 1,3 x 105 celler/brønd, og dyrk dem ved 37 °C i 24 timer.
- Gruppér cellerne: kontrolgruppe, modelgruppe og to kombinationer af lægemidler. Der tilsættes 1,2 ml/hul komplet substrat til kontrolgruppen, der tilsættes 1,2 ml/hul medier indeholdende 0,4 mM CoCl 2 til modelgruppen, og der tilsættes 1,2 ml/hul af hver af de to kombinationer, der indeholder 0,4 mM CoCl2. Cellerne inkuberes ved 37 °C i yderligere 24 timer.
- Efter lægemiddelbehandling behandles cellerne med 250 μL / hul trypsin, overføres cellerne i et 15 ml centrifugerør og centrifugeres ved 840 xg i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten kasseres, og pellets resuspenderes i 500 μl bindingsbuffer.
- Inkuber cellerne i mørke med 5 μL Annexin V-FITC og 10 μL propidiumiodid (PI) i 15 minutter ved RT, og kontroller derefter for apoptose ved flowcytometri. Angiv tre replikationsfelter i hver gruppe.
BEMÆRK: Det trypsin, der anvendes i denne test, kan ikke indeholde EDTA, fordi EDTA er et metalionchelateringsmiddel, der konkurrerer med annexin V for at binde calciumioner og påvirker affiniteten af annexin til PI. Når apoptose opstår, vender phosphoserin, oprindeligt på indersiden af cellemembranen, udad til celleoverfladen, og Annexin V-FITC binder selektivt til phosphoserin uden for membranen for at vise grøn fluorescens. - Klik på Automatisk kompensation i menuen Start, vælg FITC, PE, PerCP og APC i Vælg kanal, og vælg Kompensation ved: Højde. Klik på OK i det statistiske element: median. Med den samme celletællingsmetode, der er nævnt i trin 2.3.2, skal du indsamle celleprøverne, klikke på tæthedskortet og sætte en cirkel om den effektive cellepopulation.
- Med FITC-fluorescens som X-akseparameter og andre fluorescensparametre som Y-akseparameter skal du oprette et tæthedskort. Klik på kompensationsmatrix i Start-menuen og koefficient i overløbsmatrixen. Tæthedskortoplysningerne vises til analyse af apoptosehastigheden.
- Inkuber cellerne i mørke med 5 μL Annexin V-FITC og 10 μL propidiumiodid (PI) i 15 minutter ved RT, og kontroller derefter for apoptose ved flowcytometri. Angiv tre replikationsfelter i hver gruppe.
4. Immunofluorescens påvisning af caspase-3 generation
- PC12-cellerne sås på dæksedler med en massefylde på 8 x 104 celler/dækslip, og læg dem i plader med 24 brønde ved 37 °C i 24 timer. Gruppér cellerne som nævnt ovenfor i trin 3.2; Opret tre replikerede følgesedler for hver gruppe.
- Efter medicinsk behandling skylles dæksedlerne to gange med PBS (37 °C) i 5 minutter hver, fikseres med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og permeabiliseres med 0,5% Triton X-100 i 20 minutter ved RT.
- Skyl cellerne igen og bloker dem med 10% gedeserum i 1 time ved RT.
- Hvert dæksel inkuberes med 200 μL primært antistof caspase-3 (et vigtigt udøvende protein af apoptose) fortyndet i en koncentration på 1:250 i 1x TBST natten over ved 4 °C. Der vaskes med 1x TBST (tre gange i 3 minutter hver), og inkuberes med 200 μL sekundært antistof (1:300 fortynding i 1x TBST) i 1 time ved RT i mørke.
BEMÆRK: Fluorescensen slukkes let; Efter inkubation af det sekundære antistof skal diasene således holdes væk fra lys. De primære og sekundære antistoffer skal opbevares 4 °C væk fra lys. - Tilsæt 300 μL DAPI (0,5 μg/ml) til dæksedlerne (for at detektere kernerne) i 10 minutter og vask cellerne tre gange med 1x TBST i 5 minutter hver.
- Overhold dæksedlerne under fluorescensmikroskopet og tag billeder10. Udfør statistisk analyse af fluorescensintensiteten ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: De anvendte dias og dæksedler skal være rene og sterile. Ved farvning skal du være opmærksom på farvningsopløsningens pH, koncentration og temperatur og undgå fluorescensdæmpning. Det fluorescerende mikroskop skal tændes mindst 15 minutter i forvejen for at forvarme kviksølvlampen og slukkes i 30 minutter, før det tændes igen. Ved optagelse af billeder skal eksponeringsparametrene for det samme farvestof i samme batch af eksperimenter være konsistente for at sikre nøjagtigheden af resultaterne.
5. Immunofluorescensanalyse af ROS-niveau
- Kulturér og behandl cellerne som beskrevet i trin 4.1.
- Efter medicinsk behandling vaskes hver dæksel tre gange med PBS i 3 minutter og inkuberes med 400 μL DCFH-DA (10 μM) ved 37 °C i 20 minutter.
BEMÆRK: DCFH-DA er en universel indikator for oxidativ stress. Det har cellemembranpermeabilitet og ingen fluorescens. Når det kommer ind i cellen, hydrolyseres det af esterase for at producere 2',7'-dichlordihydrofluorescein (DCFH) og oxideres derefter hurtigt for at producere et stærkt fluorescerende produkt. - Vask cellerne igen med serumfri DMEM (to gange i 3 minutter hver), og observer straks dækslet efter tilsætning af fluorescensdæmpningsmidlet under fluorescensmikroskopet. Beregn den relative fluorescensintensitet ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: Når du har indlæst DCFH-DA-sonden, skal du sørge for at rengøre den resterende sonde, der ikke kommer ind i cellen, ellers bliver baggrunden høj.
6. Western blot-påvisning af proteinekspression af Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 og Bax11,12
- PC12-celler podes i plader med 6 huller i en koncentration på 1 x 106 celler/brønd og dyrkes ved 37 °C i 24 timer. Gruppér og behandl cellerne som nævnt i trin 4.1, og sæt tre replikate brønde i hver gruppe.
- Efter lægemiddelbehandling i 24 timer vaskes cellerne tre gange med PBS i 5 minutter hver og inkuberes på is i 30 minutter i forberedt lysisbuffer. Efter lysis centrifugeres cellerne i 20 minutter ved 16 000 x g og 4 °C, og supernatanterne opsamles.
- Detekter proteinkoncentrationen og juster i henhold til instruktionerne gennem Bradford-analysen. Prøverne fortyndes og denatureres ved 100 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Lysisbufferen består af fosfatasehæmmer, proteasehæmmer og RIPA-lysat i et volumenforhold på 1:1:50. I kontrolgruppen kræves 200 μL/brønd lysisbuffer, og 100 μL/brønd lysisbuffer kræves i de øvrige grupper. Generelt er proteinkoncentrationerne af kontrol-, model- og to typer kombinationsgrupper henholdsvis 0,45 mg / ml, 0,25 mg / ml og 0,32-0,39 mg / ml; deres proteinkoncentrationer efter fortynding med belastningsbufferen er henholdsvis 0,36, 0,2 og 0,256-0,312 mg / ml. - For at detektere proteiner med forskellige molekylvægte skal du indlæse 25 μg protein i hver bane, køre en 12% SDS-PAGE-elektroforese og overføre gelen til PVDF-membraner.
BEMÆRK: Under fremstillingen af SDS-gel skal den blandes fuldt ud uden bobler eller uopløselige partikler; Ellers kan der forekomme ujævne eller uregelmæssige bånd. Når du overfører membranerne, skal du sikre dig, at der ikke er bobler mellem PVDF-membranen og gelen; Ellers vises hvide pletter i strimlen. Derudover skal dette trin udføres ved lave temperaturer, og isposen skal skiftes hvert 30. minut. - Bloker membranerne med 5% fedtfri mælk i 1,5 time ved RT og inkuber med 5 ml af de tilsvarende primære antistoffer (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 og Bax 1:1.000) i 24 timer ved 4 °C. Brug β-actin (1:5.000) antistof som en intern kontrol.
- Membranerne vaskes med TBST (tre gange i 10 minutter hver), og inkuberes derefter med 5 ml sekundære HPR-konjugerede antistoffer (1:5.000) ved RT i 2 timer.
BEMÆRK: Fortyndingsforholdet mellem antistofferne bør ikke ændres vilkårligt, og membranerne skal vaskes med TBST tilstrækkeligt i nøje overensstemmelse med kravene for at undgå, at båndets baggrundsfarve bliver for sort. - Til sidst vaskes membranen med TBST igen, og den behandles med kemiluminescerende HRP-substrat (i henhold til producentens anvisninger) til detektion af proteinbånd. Tag billederne ved hjælp af kemiluminescensbilleddannelsessystemet, og kvantificer proteinernes grå værdier ved hjælp af billeddannelsessoftwaren med β-actin som den komparative interne kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screeningen af den optimale kombination af Ast-injektion og Eri-kapsel er vist i figur 1. Celleoverlevelsesraten for Ast-injektion og Eri-kapsel på de normale PC12-celler er vist i figur 1A. Cellelevedygtigheden var lavere end 95 % ved Ast-injektion ved koncentrationer større end 12 μM (figur 1A) og Eri-kapsel ved koncentrationer større end 5 μM (figur 1A), hvilket indikerer, at den maksimale ikke-toksiske koncentration var henholdsvis 12 μM og 5 μM. Deres cytotoksicitet var større end for astragalosid A, og scutellarin anvendt alene. Levedygtigheden af Ast-injektion og Eri-kapsel på de skadede PC12-celler induceret af CoCl2 er vist i figur 1B,C. Sammenlignet med modelgruppen kunne Ast-injektion forbedre overlevelsesraten for de skadede PC12-celler i koncentrationsområdet 6-12 μM (p < 0,05 eller p < 0,01), og Eri-kapsler ved koncentrationen på 2-5 μM kunne forbedre overlevelsesraten (p < 0,05 eller p < 0,01). Ast-injektion og Eri-kapsel i forholdet 10: 1, 8: 4.2 og 6: 1.8 μM kan signifikant øge levedygtigheden af skade-PC12-cellerne (p < 0.01) (figur 1D). Forholdet 6:1,8 μM udviste den højeste cellelevedygtighed, hvilket indikerer, at det er den optimale præparationskombination og farmakologiske aktivitet sammenlignet med den bedste komponentkombination.
Evalueringen af de beskyttende virkninger af to slags kombinationer på de skadede PC12-celler er vist i figur 2. Sammenlignet med modelgruppen blev cellelevedygtigheden af de to kombinationer signifikant fremmet (p < 0,001), og komponentkombinationen var bedre end præparationskombinationen (figur 2A). Dette tyder på, at komponentkombinationen kan fremme celleoverlevelse bedre end præparatkombinationen. Apoptosehastigheden blev testet ved flowcytometri (figur 2B, C). Sammenlignet med den normale gruppe var procentdelene af tidlige, sene og totale apoptotiske celler signifikant højere i modelgruppen (p < 0,01 eller p < 0,001). Sammenlignet med modelgruppen var procentdelene af apoptotiske celler på hvert trin signifikant lavere i behandlingsgrupperne (p < 0,05 eller p < 0,01 eller p < 0,001). Fluorescensintensiteten af caspase-3 proteinekspression i hver gruppe er vist i figur 2D,E. Sammenlignet med den normale gruppe var fluorescensintensiteten af caspase-3 signifikant højere i modelgruppen. Sammenlignet med modelgruppen var fluorescensintensiteten af caspase-3 signifikant lavere i hver behandlingsgruppe (p < 0,001 eller p < 0,01 ) og var relativt lavere i komponentkombinationsgruppen end præparatkombinationsgruppen. Disse resultater tyder på, at cellemodellen kan inducere apoptose, og komponentkombinationens anti-apoptoseeffekt er bedre end præparatkombinationens.
Western blot detekterede p-Akt, Akt, Bcl-2 og Bax proteinekspression (figur 3). Sammenlignet med normalgruppen var ekspressionsniveauerne for p-Akt/Akt og Bcl-2/Bax signifikant lavere i modelgruppen (p < 0,01 eller p < 0,001 ). Sammenlignet med modelgruppen var ekspressionen af p-Akt/Akt og Bcl-2/Bax signifikant højere i de to kombinationer (p < 0,05 eller p < 0,01 eller p < 0,001), specifikt højere i komponentkombinationen. Resultaterne tyder på, at komponentkombinationen er bedre end præparatkombinationen til at fremme celleoverlevelse, hvilket er relateret til den stærkere anti-apoptoseeffekt, der produceres ved opregulering af Akt / Bcl-2 / Bax signalvejen.
Fluorescensen af DCFH kan måles med et fluorescensmikroskop for at bestemme niveauet af ROS i cellerne (figur 4A, B). Som vist i figur 4A var fluorescensen næsten usynlig i de normale celler, og fluorescensen i modelgruppen blev signifikant forbedret. Fluorescensen i begge kombinationer blev signifikant reduceret sammenlignet med modelgruppen. Som vist i figur 4B var den relative fluorescensintensitet signifikant svagere i hver behandlingsgruppe sammenlignet med modelgruppen (p < 0,001). Fluorescens havde en tendens til at falde i komponentkombinationsgruppen sammenlignet med præparatkombinationsgruppen, hvilket indikerer, at cellemodellen kan fremkalde oxidativ skade. Den antioxidative skadevirkning af komponentkombinationen er bedre end præparatkombinationens.
Western blot detekterede ekspressionen af Nrf2-proteinet (figur 4C). Sammenlignet med normalgruppen blev ekspressionen af Nrf2 signifikant reduceret i modelgruppen (p < 0,05). Sammenlignet med modelgruppen var ekspressionen af Nrf2-protein signifikant højere i behandlingsgrupperne (p < 0,01 eller p < 0,05), specifikt højere i komponentkombinationsgruppen (figur 4D). Dette tyder på, at komponentkombinationen er bedre end præparatkombinationen til at fremme celleoverlevelse, hvilket er relateret til den stærkere antioxidantskade, der produceres ved opregulering af Nrf2-signalvejen.
Afslutningsvis kunne komponentkombinationen (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin og 75 μM chlorogen syre) fremme overlevelsen af skadede celler bedre end præparatkombinationen (6 μM Ast-injektion og 1,8 μM Eri-kapsel) gennem stærkere regulering af signalveje relateret til apoptose og oxidativ skade.
SPSS statistisk software 26.0 blev brugt til statistisk analyse, og alle data udtrykkes som middel ± standardafvigelse (SD). Til sammenligninger mellem grupper blev dataene evalueret af en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys test. p < 0,05 blev anset for at indikere en statistisk signifikant forskel.
Figur 1: Virkninger af lægemidler på levedygtigheden af normale og skadede PC12-celler. (A) Virkninger af forskellige koncentrationer af Ast-injektion og forskellige koncentrationer af Eri-kapsel på normale PC12-celler. (B) Screening af den effektive koncentration af Ast-injektion på skadede PC12-celler. (C) Screening af den effektive koncentration af Eri-kapsel på skadede PC12-celler. (D) Virkninger af kombinationer af to lægemidler i forskellige proportioner på overlevelsesraten for skadede PC12-celler. Statistiske værdier udtrykkes som gennemsnittet ± SD fra seks uafhængige eksperimenter. &&p < 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen. *p < 0,05 og **p < 0,01 sammenlignet med modelgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkninger af to kombinationer på skadede PC12-cellers overlevelse og apoptose. (A) Virkningen af komponentkombinationen og præparatkombinationen på overlevelsesraten for skadede PC12-celler. (B) Graf over apoptoserate påvist ved Annexin V-PI. (C) Statistisk histogram af apoptosehastigheden. (D) Den relative fluorescensintensitet af caspase-3-proteinekspression (400x). Skalastænger: 20 μm. (E) Statistisk histogram af fluorescensintensitet af caspase-3 proteinekspression. Statistiske værdier udtrykkes som gennemsnittet ± SD fra tre uafhængige eksperimenter, bortset fra cellelevedygtighed for seks uafhængige eksperimenter. *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001 sammenlignet med modelgruppen. ##p < 0,01 sammenlignet med præparatkombinationsgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekter af de to kombinationer på ekspressionsniveauerne for p-Akt, Akt, Bcl-2 og Bax. (A) Proteinekspression af p-Akt og Akt bestemt ved Western blot-analyse. (B) Statistisk histogram af p-Akt/Akt-forholdsstatistik i hver gruppe. C) Proteinekspression af Bcl-2 og Bax bestemt ved Western blot-analyse. D) Statistisk histogram af Bcl-2/Bax-forholdet i hver gruppe. Statistiske værdier udtrykkes som gennemsnittet ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001 sammenlignet med modelgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekt af to kombinationer på Nrf2-proteinekspression og ROS-niveauer. (A) Niveauer af ROS blev påvist ved fluorescensmikroskopi (400x). Skalastænger: 20 μm. (B) Statistisk histogram af ROS-fluorescensintensitet i hver gruppe. C) Nrf2-proteinekspression bestemt ved Western blot-analyse. D) Statistisk histogram af Nrf2-proteinekspression. Statistiske værdier udtrykkes som gennemsnittet ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001 sammenlignet med modelgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der mangler stadig ideelle lægemidler til behandling af cerebral iskæmi i moderne klinisk praksis2. Under vejledning af supplering af qi og aktivering af blodcirkulationsmetoden er Ast, Eri og andre præparater blevet anvendt i kombination i den kliniske praksis med TCM og har opnået gode omfattende fordele13,14,15. Et stort antal undersøgelser har vist, at Ast kan forbedre permeabiliteten af blod-hjerne-barrieren, øge cerebral blodgennemstrømning, forbedre nervecellernes evne til at tolerere hypoxi og modstå iltfrie radikalskader og kan forbedre neurologisk dysfunktion betydeligt16,17. Det er især velegnet til senil iskæmisk cerebrovaskulær sygdom16,17. Eri kan udvide blodkarrene, øge blodtilførslen til hjernen, fjerne ROS og reducere lipidperoxidering18,19. Imidlertid er den synergistiske virkning, farmakodynamiske komponenter og mekanismen for kombinationen af de to lægemidler stadig uklare, hvilket er et almindeligt problem, der begrænser den kliniske anvendelse af TCM.
Det iskæmiske og hypoxiske miljø med kronisk cerebral iskæmi inducerer oxidativ stressskade og aktiverer samtidig hjernecellens apoptose signalvej for at fremme neuronal apoptose20,21. PI3K/Akt-vejen er en klassisk anti-apoptotisk og pro-overlevelsessignaltransduktionsvej22,23, blandt hvilke Bcl-2-familieproteiner og caspasefamilien er de nedstrøms udøvende proteiner i denne signalvej. Phosphoryleret Akt kan direkte eller indirekte regulere Bcl-2-familien og hæmme aktiveringen af nedstrømsvejen caspase-3 og derved udøve en anti-apoptotisk virkning11. Derudover kan overskydende ROS genereret af hypoxi fremkalde oxidativ stressskade, mens phosphoryleret Akt kan aktivere Nrf2 for at eliminere overskydende ROS for at bekæmpe oxidativ stressskade12,24. Derfor kan aktivering af PI3K / Akt / Nrf2-vejen effektivt forebygge og kontrollere oxidativ stress og apoptose og derved reducere hypoxisk-iskæmisk hjerneskade25,26.
I undersøgelsen blev præparationskombinationen screenet ved hjælp af den skadede PC12-cellemodel, og effekten og mekanismen i denne model blev sammenlignet med komponentkombinationen, der tidligere var screenet7. Derudover er den maksimale ikke-toksiske koncentration af Ast-injektion og Eri-kapsel henholdsvis 12 μM (beregnet ved astragalosid A) og 5 μM (beregnet ved scutellarin), mens den maksimale ikke-toksiske koncentration af astragalosid A og scutellarin er henholdsvis 20 μM og 50 μM.7. Det viser, at komponentkombinationen er sikrere end præparatkombinationen med mere kontrollerbar kvalitet og omfattende fordele ved høj effektivitet og lav toksicitet.
De nuværende cellemodeller, der kan bruges til at simulere cerebral iskæmi, omfatter hovedsageligt fysisk hypoxi (induceret af OGD) og kemisk hypoxi (induceret afNa2S2O4eller CoCl2)27. Blandt dem har både OGD og Na 2 S2O4 skaderen kort hypoxi tid og er ikke egnede til simulering af kronisk iskæmi27. CoCl 2-induceret hypoxi er en af de mest almindeligt anvendte hypoxi-efterligninger sammenlignet med OGD og brugen af andre hypoxi-efterligninger. Det kan føre til vedvarende og stabil oxidativ skade ved ROS og producere typiske apoptotiske ændringer i forskellige cellelinjer27. Derfor blevCoCl2 i denne undersøgelse anvendt i 24 timer til at simulere neuronal hypoxi28,29. Dens modelleringskoncentration (0,1, 0,2, 0,4 og 0,8 mM) og gyldighedsperioden (1 og 7 dage) blev screenet. I betragtning af den uundgåelige mangel på glukose og ilt efter cerebral iskæmi kan det glukosefrie og hypoxiske miljø bedre simulere cerebral iskæmisk skade. Denne undersøgelse viste, at 0,4 mM CoCl2 kombineret med et glukosefrit medium i 24 timer kunne etablere en stabil og kontrollerbar kronisk hypoxisk cellemodel. I opfølgningsundersøgelsen vil dyremodellen for kronisk cerebral iskæmi blive brugt til yderligere at validere de terapeutiske fordele ved komponentkombinationen in vivo.
Denne cellemodel kan øge apoptosehastigheden, caspase-3 fluorescensintensiteten og intracellulært ROS-niveau (figur 2 og figur 4), som bedre kan simulere de patologiske ændringer af kronisk cerebral iskæmi, såsom apoptose, oxidativ stress osv. Baseret på denne model blev det konstateret, at de to typer kombinationer kan hæmme apoptose og oxidativ stressskade. Effekten af komponentkombinationen på at fremme celleoverlevelse var signifikant bedre end præparationskombinationen (figur 1); begge kombinationer kunne opregulere ekspressionsniveauerne for P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax og Nrf2 i forskellige grader (figur 3 og figur 4). Især komponentkombinationen havde en stærkere effekt på opreguleringen af Akt/Bcl-2/Bax og Nrf2 signalvejen. Disse resultater indikerer, at komponentkombinationen bedre kan modstå celleskader end præparatkombinationen, som er relateret til stærkere anti-apoptose og antioxidativ stress.
Afslutningsvis giver disse resultater en kombinationsstrategi af to urter til behandling af skadede PC12-celler og giver en ny idé til evaluering og optimering af den kombinerede applikationstilstand for to urter. Samlet set giver denne undersøgelse en reference til valg af den aktive komponentkombination af TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af centrale FoU-projekter fra Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
