Summary
Dit protocol biedt een combinatiestrategie van twee kruiden om gewonde PC12-cellen te behandelen. Het protocol biedt een referentie voor het optimaliseren van de beste toepassingsmodus van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM).
Abstract
Met het oog op de voordelen van de combinatie van traditionele Chinese geneeskunde (TCM) bij de behandeling van cerebrale ischemie, bestudeerden we de verschillen in de werkzaamheid en het mechanisme tussen de bereidingscombinatie en de componentcombinatie om de twee kruidencombinatiestrategie te verkennen om gewonde PC12-cellen te behandelen. Kobaltchloride (CoCl2) in combinatie met een glucosevrij medium werd gebruikt om oxidatieve schade aan PC12-cellen te induceren. Vervolgens werd de optimale combinatie van Astragalus mongholicus (Ast) en Erigeron breviscapus (Eri) injectie geselecteerd en gecombineerd volgens uniforme ontwerpmethoden na screening van hun veilige en effectieve concentratie op PC12-cellen. Verder omvat de gescreende componentencombinatie 10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarine en 75 μM chlorogeenzuur in twee kruiden. Vervolgens werden MTT, Annexin V-FITC/PI, immunofluorescentie en Western blot-analyse gebruikt om de werkzaamheid en het mechanisme van de preparaatcombinatie en de componentcombinatie op gewonde PC12-cellen te evalueren. De resultaten toonden aan dat de optimale voorbereidingscombinatie voor celpro-overleving Ast-injectie en Eri-capsule was met een concentratie van 6:1,8 (μM). De componentencombinatie (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarine en 75 μM chlorogeenzuur) was werkzamer dan de bereidingscombinatie. Beide combinaties verminderden opmerkelijk de apoptotische snelheid, de fluorescentie-intensiteit van caspase-3 en het intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) -niveau; ondertussen verhoogden ze de expressieniveaus van p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax en Nrf2. Deze effecten waren duidelijker in de componentencombinatie. Kortom, beide combinaties kunnen de verwonding veroorzaakt door CoCl2 in combinatie met een glucosevrij medium op PC12-cellen remmen, waardoor de celoverleving wordt bevorderd. De efficiëntie van de componentcombinatie ten opzichte van de bereidingscombinatie kan echter te wijten zijn aan de sterkere regulatie van de PI3K / Akt / Nrf2-signaleringsroute gerelateerd aan oxidatieve stress en apoptose.
Introduction
Chronische cerebrale ischemie, veroorzaakt door cerebrale hypoperfusie, is een veel voorkomende ziekte bij mensen van middelbare leeftijd en ouderen1. Als een langdurige occulte ischemieziekte, kan het leiden tot progressieve of aanhoudende neurologische disfunctie. De belangrijkste pathologische mechanismen omvatten celapoptose en oxidatieve schade, wat leidt tot progressieve of aanhoudende neurologische disfunctie; dit is de pathologische basis van de ziekte van Alzheimer, vasculaire dementie en andere ziekten en heeft ernstige gevolgen voor de kwaliteit van leven van patiënten. Er is echter nog steeds een gebrek aan ideale medicijnen in de moderne geneeskunde om chronische cerebrale ischemie te behandelen2. Tegelijkertijd is de combinatie van Astragalus mongholicus (Ast) en Erigeron breviscapus (Eri) op grote schaal gebruikt in de klinische praktijk van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM)4. De combinatiestrategie is opmerkelijk verbeterd in het bevorderen van het herstel van de zenuwfunctie na cerebrale ischemie, wat beter is dan die van een enkel medicijn; er zijn echter grote verschillen in de doseringsverhouding in de combinatie van de twee geneesmiddelen4. De effectieve componenten en het werkingsmechanisme zijn niet goed gedefinieerd, wat het belangrijkste probleem is dat de klinische toepassing ervan beperkt.
Eerdere studies hebben het synergetische effect aangetoond van de combinatie van Ast-injectie en Eri-injectie bij de behandeling van cerebrale ischemie bij ratten. Het kan de expressie van p-Akt-eiwit upreguleren en de expressie van Bcl-2 associated death promoter (BAD) -eiwit 5,6 downreguleren, een van de B-lymfoblastoom 2 (Bcl-2) familie-eiwitten en heeft het effect van het bevorderen van apoptose. De materiële basis en het mechanisme van het synergetische effect zijn echter niet duidelijk. Verder is het letselmodel van PC12-cellen vastgesteld met CoCl2 gecombineerd glucosevrij medium en is de optimale componentencombinatie in Ast en Eri gescreend en gedefinieerd7.
In deze studie worden de effectieve doses Ast en Eri gescreend met behulp van het gewonde PC12-celmodel. De optimale combinatie van de twee geneesmiddelen wordt gescreend met behulp van dit model in combinatie met de homogene ontwerpmethode. Het celmodel wordt gebruikt om het verschil in de effecten en mechanismen van de voorbereidingscombinatie en de componentcombinatie in gewonde PC12-cellen verder te evalueren. Deze strategie is gericht op het onderzoeken van het beschermende effect en het regulerende mechanisme van de twee soorten combinaties op gewonde PC12-cellen via de PI3K / Akt / Nrf2-signaalroute om de beste combinatiemodus te bepalen. Deze studie biedt een referentie voor het optimaliseren van de beste toepassingsmodus van TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagens
- Bereid het volledige medium door 90 ml DMEM-hoog suikermedium, 10 ml foetaal runderserum (FBS) en 1 ml penicilline-streptomycine-oplossing toe te voegen in een steriele kweekkolf van 125 ml. Meng het volledige medium en bewaar bij 4 °C onder gesloten omstandigheden.
- Bereid CoCl2-oplossing door 0,02 g CoCl2-poeder (nauwkeurig gewogen) toe te voegen in 10 ml DMEM-suikervrij medium (volledig opgelost) om een voorraadoplossing van 8,4 mM te verkrijgen. Filtreer de oplossing met een bacterieel filter van 0,22 μm, sluit deze af en bewaar deze op 4 °C afstand van licht.
OPMERKING: CoCl2 is onstabiel en moet worden opgeslagen in een luchtdichte container, beschermd tegen licht; de geldigheidsduur van de CoCl2-oplossing is 7 dagen. - Bereid Tris-Hcl gebufferde zoutoplossing (TBST).
- Weeg nauwkeurig 8 g natriumchloride, 0,2 g kaliumchloride en 3 g Tris-base. Voeg ze toe aan een bekerglas van 1 l en voeg vervolgens 1.000 ml RO-water toe om het mengsel op te lossen.
- Stel de pH in op 7,4, voeg 1 ml Tween 20 toe en meng grondig om de TBST-oplossing te verkrijgen.
OPMERKING: Tween 20 werkt als een oppervlakteactieve stof om de niet-specifieke binding van antilichamen tegen antigenen te verminderen en werkt het beste bij een concentratie van 0,1%.
- Bereid MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2)-2,5-difenyltetrazoliumbromidezout) oplossing door 0,1 g MTT-poeder in 20 ml PBS-oplossing te wegen om een stamoplossing van 5 mg/ml te verkrijgen. Filtreer de oplossing met een bacterieel filter van 0,22 μm, sluit deze af en bewaar deze op 4 °C afstand van licht, geplaatst op stand-by.
OPMERKING: MTT-poeder is onstabiel en absorbeert gemakkelijk vocht, dus het moet op een gesloten en droge plaats worden bewaard, weg van licht. De MTT-oplossing verloopt na 7 dagen. MTT heeft een carcinogeen effect, dus vermijd direct contact met de huid. - Bereid de Eri-capsuleoplossing door het omhulsel van de capsule te verwijderen en nauwkeurig 0,18 g van het gehalte in 10 ml DMEM-suikervrij medium te wegen om een 100 μM-stamoplossing te bereiden (gebaseerd op de concentratie scutellarine). Filtreer de oplossing met een bacterieel filter van 0,2 μm, sluit deze af en bewaar deze in een luchtdichte verpakking bij 4 °C.
OPMERKING: Scutellarine is het belangrijkste actieve ingrediënt in Erigeron breviscapus. De concentratie van scutellarine in de capsules is bepaald door HPLC-UV op 2,56 mg/g, d.w.z. 5,54 μmol/g8. De concentratie van het preparaat wordt berekend op basis van de scutellarineconcentratie. Dit is handig voor het evalueren van de farmacologische activiteit van het preparaat en de component. - Bereid de oplossing van de Ast-injectie door 5 ml injectie en 5 ml suikervrije DMEM-media toe te voegen aan een steriele centrifugebuis van 15 ml om een stamoplossing van 60 μM te bereiden (gebaseerd op de concentratie van astragaloside A). Filtreer de oplossing door een bacterieel filter van 0,2 μm en bewaar deze in een luchtdichte container bij 4 °C.
OPMERKING: Het injectievolume is elk 10 ml en de concentratie van astragaloside A in de injectie is door HPLC-ELSD bepaald op 0,094 mg/ml (d.w.z. 120 μM)9. De bereiding moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast en overal op een lichtdichte manier worden bediend. Het volume van de injectieoplossing en het suikervrije medium moeten nauwkeurig worden gemeten en goed worden gemengd. - Bereid astragaloside A-oplossing door nauwkeurig 7,85 mg astragaloside A-standaard te wegen en volledig op te lossen in 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om een 5.000 μM-stamoplossing te bereiden. Filtreer het met een bacteriefilter van 0,22 μm en bewaar het luchtdicht bij 4 °C.
OPMERKING: Astragaloside A poeder is onoplosbaar in het suikervrije medium. Los bij het bereiden van de oplossing op met de juiste hoeveelheid DMSO om de uiteindelijke experimentele concentratie DMSO onder 0,1% te houden om geen cytotoxiciteit te garanderen. - Bereid de scutellarine-oplossing door 11,56 mg scutellarine standaard nauwkeurig te wegen en volledig op te lossen met 5 ml suikervrij DMEM-medium om een 5.000 μM stockoplossing te bereiden. Filtreer het met een bacteriefilter van 0,22 μm en bewaar het luchtdicht bij 4 °C.
- Bereid de chlorogeenzuuroplossing door 8,86 mg chlorogeenzuur standaard nauwkeurig te wegen en volledig op te lossen met 5 ml suikervrij DMEM-medium om een 5.000 μM stamoplossing te bereiden. Filtreer het met een bacteriefilter van 0,22 μm en bewaar het luchtdicht bij 4 °C.
OPMERKING: Chlorogeenzuurpoeder is onstabiel en absorbeert gemakkelijk water. Het moet worden verzegeld en opgeslagen op een afstand van 4 °C van licht; de blootstellingstijd moet tijdens het wegen tot een minimum worden beperkt.
2. Bepaling van de levensvatbaarheid van de cel
- Verkrijg PC12-cellen en kweek ze in DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine.
OPMERKING: In deze studie worden de cellen verkregen van de Chinese Academie van Wetenschappen. PC12-cellen zijn hechte cellen die de algemene kenmerken van neuro-endocriene cellen hebben en worden veel gebruikt in de neurofysiologie en neurofarmacologie. - Kweek de cellen bij 37 °C in een incubator aangevuld met 5% CO2 en kweek ze om de 2-3 dagen. Gebruik cellen bij passages 4-8 voor alle experimenten.
- Celkweek
- Behandel PC12-cellen in de logaritmische groeifase (70% -80% celconfluentie) met 1 ml trypsine (0,25%) en observeer de cellen onder een microscoop. Wanneer de cellen rond worden, stop dan de trypsinevertering door 3 ml van het volledige medium toe te voegen.
- Breng de cellen over in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 840 x g . Gooi het supernatant weg, resuspenseer met het volledige medium en breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Tel vervolgens het aantal cellen met behulp van een flowcytometer.
- Start de flowcytometriesoftware, selecteer het overeenkomstige verdunningsmultiple van de celoplossing in de telinstelling en klik op Dichtheidsdiagram na het laden van het celmonster uit de microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Omcirkel de celpopulatie weg van de X-as en Y-as, klik met de rechtermuisknop op de gegevenstabel onder de afbeelding en selecteer X, Y, Count en Abs Count. De gegevens onder Abs Count in de gegevenstabel geven het celtellingsresultaat.
- Pas de celconcentratie aan op 1 x 105 cellen/ml, ent 100 μL/put in 96-wellplaten en kweek bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator gedurende 24 uur.
- Screening van veilige concentraties van twee geneesmiddelen op normale PC12-cellen
- Kweek de cellen zoals beschreven in stap 2.1-2.2. Gooi het supernatant weg en behandel de normale cellen met verschillende eindconcentraties astinjectie (4, 8, 12, 16, 20 en 24 μM) en Eri-capsule (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 en 20 μM). Behandel zes replicatieputten van elke groep gedurende 24 uur.
OPMERKING: De geneesmiddelen worden aan de media toegevoegd om de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel te bereiken (vermeld in stap 2.4.1) en vervolgens wordt een gelijk volume media aan elke put toegevoegd. Bij het aanzuigen van het supernatant moet de pipetpunt voorzichtig tegen de putwand worden geplaatst om te voorkomen dat contact wordt gemaakt met de cellen aan de onderkant van de put. Voeg ze bij het toevoegen van verschillende oplossingen voorzichtig en snel toe langs de randen van de putten en let op bij het vervangen van de pipetpistoolkop om te voorkomen dat de experimentele resultaten worden beïnvloed. - Gooi het supernatant weg, voeg 120 μL MTT-oplossing (1 mg/ml) toe aan elk putje en incubeer de cellen gedurende 4 uur bij 37 °C.
- Gooi na de incubatie het supernatant opnieuw weg en voeg 150 μL DMSO toe aan elk putje. Schud de plaat gedurende 10 minuten met een snelheid van 240 maal/min (aantal horizontale trillingen per minuut) met behulp van een vortexoscillator.
- Meet de absorptie van elk monster bij 490 nm met behulp van een microplaatlezer. Bereken de levensvatbaarheid van de cel (%), dat is de absorptie van de behandelde groep/absorptie van normaal de groep (controle) x 100.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de MTT-oplossing binnen de geldigheidsperiode valt; als de kleur is veranderd (in donkergroen), kan deze niet worden gebruikt. Bij het testen van de absorptie van cellen moet een blanco put (kweekmedium en MTT, zonder cellen of geneesmiddelen) worden ingesteld om de interferentie van andere reagentia te elimineren. Een volume van 150 μL DMSO wordt aan elke put toegevoegd en gedurende 10 minuten geschud om de blauwpaarse kristallen beter op te lossen. De absorptie moet zo snel mogelijk worden gedetecteerd om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen.
- Kweek de cellen zoals beschreven in stap 2.1-2.2. Gooi het supernatant weg en behandel de normale cellen met verschillende eindconcentraties astinjectie (4, 8, 12, 16, 20 en 24 μM) en Eri-capsule (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 en 20 μM). Behandel zes replicatieputten van elke groep gedurende 24 uur.
- Screening van effectieve concentraties van twee geneesmiddelen op gewonde PC12-cellen
- Kweek de cellen gedurende 24 uur zoals vermeld in stap 2.1-2.2, gooi het supernatant weg en behandel de cellen vervolgens met 20 μL /put coCl2 (0,4 mM) in combinatie met het suikervrije medium.
- Behandel de cellen gelijktijdig met 100 μL/put astinjectie (de eindconcentraties zijn 2, 6, 8, 10 en 12 μM) of 100 μL Eri-capsule (de eindconcentraties zijn 1, 2, 3, 4 en 5 μM) bij 37 °C gedurende nog eens 24 uur. Voeg 120 μL/putje volledig medium toe aan de controlegroep.
OPMERKING: CoCl2 induceert hypoxische aandoeningen in de cellen. - Meet de absorptie van elk monster met behulp van de MTT-methode en bereken de levensvatbaarheid van de cel zoals eerder beschreven in de stappen 2.4.2 en 2.4.3.
- Screening van de optimale combinatie van twee geneesmiddelen op basis van de homogene ontwerpmethode
OPMERKING: Na het verkrijgen van het effectieve concentratiebereik van de Astragalus-injectie en breviscapuscapuscapsule, werd de tabel met uniforme ontwerpmethode U7 (74) gebruikt om zes verschillende combinaties van de twee geneesmiddelen te verkrijgen. Astinjectie:Eri-capsule: 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM en 6)12:3,4 μM.- Kweek de cellen zoals hierboven beschreven in stap 2.3.1 en behandel de gewonde PC12-cellen met zes proportionele concentraties Ast-injectie:Eri-capsule zoals hierboven vermeld.
- Behandel de cellen gedurende 24 uur en bereken de levensvatbaarheid van de cel zoals eerder beschreven in de stappen 2.4.2 en 2.4.3.
- Evaluatie van het beschermende effect van twee optimale combinaties op gewonde PC12-cellen
OPMERKING: Na het verkrijgen van de optimale bereidingscombinatie (Ast-injectie: Eri-capsule van 6:1,8 μM) en de optimale componentcombinatie7 (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarine en 75 μM chlorogeenzuur), wordt verdere evaluatie uitgevoerd om hun beschermende effecten op gewonde PC12-cellen te controleren.- Kweek de cellen zoals hierboven beschreven in stap 2.3.1 en behandel de gewonde PC12-cellen met de twee soorten combinaties van geneesmiddelen zoals besproken in de NOTITIE hierboven.
- Behandel de cellen gedurende 24 uur en bereken de levensvatbaarheid van de cel zoals eerder beschreven in de stappen 2.4.2 en 2.4.3.
3. Bijlage V-FITC/PI-test voor apoptose
- Zaai de PC12-cellen in een 12-well plaat in een concentratie van 1,3 x 105 cellen/put en kweek ze bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Groepeer de cellen: controlegroep, modelgroep en twee combinaties van geneesmiddelen. Voeg 1,2 ml/put van het volledige medium toe aan de controlegroep, voeg 1,2 ml/put media met 0,4 mM CoCl2 toe aan de modelgroep en voeg 1,2 ml/put toe van elk van de twee combinaties die 0,4 mM CoCl2 bevatten. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende nog eens 24 uur.
- Behandel de cellen na medicamenteuze behandeling met 250 μL/put trypsine, breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer bij 840 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 500 μL van de bindingsbuffer.
- Incubeer de cellen in het donker met 5 μL Annexin V-FITC en 10 μL propidiumjodide (PI) gedurende 15 minuten bij RT en controleer vervolgens op apoptose door flowcytometrie. Stel drie replicatieputten in elke groep in.
OPMERKING: Het trypsine dat in deze test wordt gebruikt, kan geen EDTA bevatten omdat EDTA een metaalion chelaatvormer is die concurreert met annexine V om calciumionen te binden en de affiniteit van annexine voor PI beïnvloedt. Wanneer apoptose optreedt, draait fosfosforen, oorspronkelijk aan de binnenkant van het celmembraan, naar buiten naar het celoppervlak en annexine V-FITC bindt selectief aan fosfosdrieen buiten het membraan om groene fluorescentie te vertonen. - Klik op Automatische compensatie in het menu Start , selecteer FITC, PE, PerCP en APC in het kanaal Selecteren en selecteer Compensatie op: Hoogte. Klik op OK in het statistische item: Mediaan. Met dezelfde celtelmethode die in stap 2.3.2 wordt genoemd, verzamelt u de celmonsters, klikt u op de dichtheidskaart en omcirkelt u de effectieve celpopulatie.
- Maak met FITC-fluorescentie als X-asparameter en andere fluorescentieparameters als Y-asparameter een dichtheidskaart. Klik op Compensatiematrix in het menu Start en Op Coëfficiënt in de overloopmatrix. De informatie over de dichtheidskaart wordt weergegeven voor de analyse van de apoptosesnelheid.
- Incubeer de cellen in het donker met 5 μL Annexin V-FITC en 10 μL propidiumjodide (PI) gedurende 15 minuten bij RT en controleer vervolgens op apoptose door flowcytometrie. Stel drie replicatieputten in elke groep in.
4. Immunofluorescentie detectie van caspase-3 generatie
- Zaai de PC12-cellen op coverslips met een dichtheid van 8 x 104 cellen/coverslip en plaats ze gedurende 24 uur in 24-wellplaten bij 37 °C. Groepeer de cellen zoals hierboven vermeld in stap 3.2; stel drie replica coverslips in voor elke groep.
- Spoel na medicamenteuze behandeling de coverslips tweemaal met PBS (37 °C) gedurende elk 5 minuten, fixeer ze met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten en permeabiliseer met 0,5% Triton X-100 gedurende 20 minuten bij RT.
- Spoel de cellen opnieuw af en blokkeer ze met 10% geitenserum gedurende 1 uur bij RT.
- Incubeer elke coverslip met 200 μL primair antilichaam caspase-3 (een belangrijk uitvoerend eiwit van apoptose) verdund in een concentratie van 1:250 in 1x TBST, 's nachts bij 4 °C. Wassen met 1x TBST (drie keer gedurende 3 minuten elk) en incuberen met 200 μL secundair antilichaam (1:300 verdunning in 1x TBST) gedurende 1 uur bij RT in het donker.
OPMERKING: De fluorescentie is gemakkelijk te doven; dus, na incubatie van het secundaire antilichaam, moeten de dia's uit de buurt van licht worden gehouden. De primaire en secundaire antilichamen moeten worden bewaard op een afstand van 4 °C van licht. - Voeg 300 μL DAPI (0,5 μg/ml) toe aan de coverslips (om de kernen te detecteren) gedurende 10 minuten en was de cellen drie keer met 1x TBST gedurende 5 minuten elk.
- Observeer de coverslips onder de fluorescentiemicroscoop en maak foto's10. Voer statistische analyse uit van de fluorescentie-intensiteit met behulp van de beeldvormingssoftware.
OPMERKING: De gebruikte dia's en coverslips moeten schoon en steriel zijn. Let bij het kleuren op de pH, concentratie en temperatuur van de verfoplossing en vermijd fluorescentieblussing. De fluorescerende microscoop moet ten minste 15 minuten van tevoren worden ingeschakeld om de kwiklamp voor te verwarmen en gedurende 30 minuten worden uitgeschakeld voordat deze weer wordt ingeschakeld. Bij het verkrijgen van beelden moeten de belichtingsparameters van dezelfde kleurstof in dezelfde batch experimenten consistent zijn om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen.
5. Immunofluorescentietest van ROS-niveau
- Kweek en behandel de cellen zoals besproken in stap 4.1.
- Was na medicamenteuze behandeling elke coverslip driemaal met PBS gedurende 3 minuten en incubeer met 400 μL DCFH-DA (10 μM) bij 37 °C gedurende 20 minuten.
OPMERKING: DCFH-DA is een universele indicator van oxidatieve stress. Het heeft celmembraandoorlaatbaarheid en geen fluorescentie. Zodra het de cel binnenkomt, wordt het gehydrolyseerd door esterase om 2',7'-dichloordozelotheïne (DCFH) te produceren en vervolgens snel geoxideerd om een sterk fluorescerend product te produceren. - Was de cellen opnieuw met serumvrije DMEM (tweemaal gedurende 3 minuten elk) en observeer onmiddellijk de coverslip na toevoeging van het fluorescentieblusmiddel onder de fluorescentiemicroscoop. Bereken de relatieve fluorescentie-intensiteit door de beeldvormingssoftware.
OPMERKING: Nadat u de DCFH-DA-sonde hebt geladen, moet u de resterende sonde reinigen die de cel niet binnenkomt, anders wordt de achtergrond hoog.
6. Western blot detectie van eiwitexpressie van Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 en Bax 11,12
- Ent PC12-cellen in 6-well platen in een concentratie van 1 x 106 cellen/put en kweek bij 37 °C gedurende 24 uur. Groepeer en behandel de cellen zoals hierboven vermeld in stap 4.1 en stel drie replicatieputten in elke groep in.
- Na medicamenteuze behandeling gedurende 24 uur, was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk en incubeer op ijs gedurende 30 minuten in voorbereide lysisbuffer. Na lysis centrifugeer je de cellen gedurende 20 minuten bij 16.000 x g en 4 °C en verzamel je de supernatanten.
- Detecteer de eiwitconcentratie en pas deze aan volgens de instructies via de Bradford-test. Verdun de monsters en denatureer bij 100 °C gedurende 10 min.
OPMERKING: De lysisbuffer bestaat uit fosfataseremmer, proteaseremmer en RIPA-lysaat in een volumeverhouding van 1:1:50. In de controlegroep is 200 μL/put lysisbuffer nodig en in de andere groepen 100 μL/putje lysisbuffer. Over het algemeen zijn de eiwitconcentraties van controle-, model- en twee soorten combinatiegroepen respectievelijk 0,45 mg / ml, 0,25 mg / ml en 0, 32-0, 39 mg / ml; hun eiwitconcentraties na verdunning met de laadbuffer zijn respectievelijk 0,36, 0,2 en 0,256-0,312 mg/ml. - Om eiwitten met verschillende molecuulgewichten te detecteren, laadt u 25 μg eiwit in elke baan, voert u een 12% SDS-PAGE-elektroforese uit en brengt u de gel over naar PVDF-membranen.
OPMERKING: Tijdens de bereiding van SDS-gel moet deze volledig worden gemengd zonder bubbels of onoplosbare deeltjes; anders kunnen ongelijke of onregelmatige banden optreden. Zorg er bij het overbrengen van de membranen voor dat er geen bellen zijn tussen het PVDF-membraan en de gel; anders verschijnen er witte vlekken in de strip. Bovendien moet deze stap bij lage temperaturen worden uitgevoerd en moet de ijszak elke 30 minuten worden vervangen. - Blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende 1,5 uur bij RT en incubeer met 5 ml van de overeenkomstige primaire antilichamen (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 en Bax 1:1.000) gedurende 24 uur bij 4 °C. Gebruik β-actine (1:5.000) antilichaam als interne controle.
- Was de membranen met TBST (drie keer gedurende 10 minuten elk) en incubeer vervolgens met 5 ml secundaire HPR-geconjugeerde antilichamen (1:5.000) op RT gedurende 2 uur.
OPMERKING: De verdunningsverhouding van de antilichamen mag niet willekeurig worden gewijzigd en de membranen moeten voldoende met TBST worden gewassen in strikte overeenstemming met de vereisten om te voorkomen dat de achtergrondkleur van de band te zwart is. - Was ten slotte het membraan opnieuw met TBST en behandel het met chemiluminescent HRP-substraat (volgens de instructies van de fabrikant) voor eiwitbanddetectie. Leg de beelden vast met behulp van het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem en kwantificeer de grijswaarden van de eiwitten met behulp van de beeldvormingssoftware, met β-actine als de vergelijkende interne controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De screening van de optimale combinatie van Ast-injectie en Eri-capsule is weergegeven in figuur 1. De celoverlevingskans van Ast-injectie en Eri-capsule op de normale PC12-cellen is weergegeven in figuur 1A. De levensvatbaarheid van de cel was lager dan 95% met Ast-injectie bij concentraties hoger dan 12 μM (figuur 1A) en Eri-capsule bij concentraties hoger dan 5 μM (figuur 1A), wat aangeeft dat de maximale niet-toxische concentratie respectievelijk 12 μM en 5 μM was. Hun cytotoxiciteit was groter dan die van astragaloside A en scutellarine die alleen werden gebruikt. De levensvatbaarheid van Ast-injectie en Eri-capsule op de beschadigde PC12-cellen geïnduceerd door CoCl2 is weergegeven in figuur 1B,C. In vergelijking met de modelgroep kon Ast-injectie de overlevingskans van de gewonde PC12-cellen verbeteren in het concentratiebereik van 6-12 μM (p < 0,05 of p < 0,01), en Eri-capsules in de concentratie van 2-5 μM konden de overlevingskans verbeteren (p < 0,05 of p < 0,01). Astinjectie en Eri-capsule in de verhoudingen van 10:1, 8:4,2 en 6:1,8 μM kunnen de levensvatbaarheid van de pc12-cellen aanzienlijk verhogen (p < 0,01) (figuur 1D). De verhouding van 6:1,8 μM vertoonde de hoogste levensvatbaarheid van de cel, wat aangeeft dat het de optimale bereidingscombinatie en farmacologische activiteit is in vergelijking met de beste componentencombinatie.
De evaluatie van de beschermende effecten van twee soorten combinaties op de gewonde PC12-cellen is weergegeven in figuur 2. Vergeleken met de modelgroep werd de cel levensvatbaarheid van de twee combinaties significant bevorderd (p < 0,001) en was de componentencombinatie superieur aan de voorbereidingscombinatie (figuur 2A). Dit suggereert dat de componentcombinatie de celoverleving beter kan bevorderen dan de bereidingscombinatie. De apoptosesnelheid werd getest met flowcytometrie (figuur 2B,C). Vergeleken met de normale groep waren de percentages vroege, late en totale apoptotische cellen significant hoger in de modelgroep (p < 0,01 of p < 0,001). Vergeleken met de modelgroep waren de percentages apoptotische cellen in elk stadium significant lager in de behandelingsgroepen (p < 0,05 of p < 0,01, of p < 0,001). De fluorescentie-intensiteit van caspase-3-eiwitexpressie in elke groep is weergegeven in figuur 2D,E. Vergeleken met de normale groep was de fluorescentie-intensiteit van caspase-3 significant hoger in de modelgroep. Vergeleken met de modelgroep was de fluorescentie-intensiteit van caspase-3 significant lager in elke behandelingsgroep (p < 0,001 of p < 0,01) en was relatief lager in de componentcombinatiegroep dan in de bereidingscombinatiegroep. Deze resultaten suggereren dat het celmodel apoptose kan induceren en dat het anti-apoptose-effect van de componentcombinatie beter is dan dat van de bereidingscombinatie.
Western blot detecteerde de p-Akt, Akt, Bcl-2 en Bax eiwitexpressie (figuur 3). Vergeleken met de normale groep waren de expressieniveaus van p-Akt/Akt en Bcl-2/Bax significant lager in de modelgroep (p < 0,01 of p < 0,001). Vergeleken met de modelgroep was de expressie van p-Akt/Akt en Bcl-2/Bax significant hoger in de twee combinaties (p < 0,05 of p < 0,01, of p < 0,001), specifiek hoger in de componentencombinatie. De resultaten suggereren dat de componentcombinatie superieur is aan de preparaatcombinatie bij het bevorderen van celoverleving, wat gerelateerd is aan het sterkere anti-apoptose-effect dat wordt geproduceerd door het upreguleren van de Akt / Bcl-2 / Bax-signaalroute.
De fluorescentie van DCFH kan worden gemeten met een fluorescentiemicroscoop om het niveau van ROS in de cellen te bepalen (figuur 4A, B). Zoals te zien is in figuur 4A, was de fluorescentie bijna onzichtbaar in de normale cellen en was de fluorescentie in de modelgroep significant verbeterd. De fluorescentie in beide combinaties was significant verminderd in vergelijking met de modelgroep. Zoals te zien is in figuur 4B, was de relatieve fluorescentie-intensiteit significant zwakker in elke behandelingsgroep in vergelijking met de modelgroep (p < 0,001). Fluorescentie had de neiging om af te nemen in de componentcombinatiegroep in vergelijking met de preparaatcombinatiegroep, wat aangeeft dat het celmodel oxidatieve schade kan veroorzaken. Het anti-oxidatieve schade-effect van de componentencombinatie is beter dan dat van de bereidingscombinatie.
Western blot detecteerde de expressie van het Nrf2-eiwit (figuur 4C). Vergeleken met de normale groep was de expressie van Nrf2 significant verminderd in de modelgroep (p < 0,05). Vergeleken met de modelgroep was de expressie van Nrf2-eiwit significant hoger in de behandelingsgroepen (p < 0,01 of p < 0,05), specifiek hoger in de componentcombinatiegroep (figuur 4D). Dit suggereert dat de componentcombinatie beter is dan de voorbereidingscombinatie bij het bevorderen van celoverleving, wat verband houdt met de sterkere anti-oxidatieve schade die wordt veroorzaakt door het upreguleren van de Nrf2-signaalroute.
Concluderend kan de componentencombinatie (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarine en 75 μM chlorogeenzuur) de overleving van gewonde cellen beter bevorderen dan de bereidingscombinatie (6 μM Ast-injectie en 1,8 μM Eri-capsule) door een sterkere regulatie van signaalroutes gerelateerd aan apoptose en oxidatieve schade.
SPSS statistische software 26.0 werd gebruikt voor statistische analyse, en alle gegevens worden uitgedrukt als het middel ± standaarddeviatie (SD). Voor vergelijkingen tussen groepen werden de gegevens geëvalueerd door een eenrichtings-ANOVA gevolgd door de test van Tukey. p < 0,05 werd geacht een statistisch significant verschil aan te geven.
Figuur 1: Effecten van geneesmiddelen op de levensvatbaarheid van normale en gewonde PC12-cellen. (A) Effecten van verschillende concentraties Ast-injectie en verschillende concentraties Eri-capsule op normale PC12-cellen. (B) Screening van de effectieve concentratie van Ast-injectie op gewonde PC12-cellen. (C) Screening van de effectieve concentratie van Eri-capsule op gewonde PC12-cellen. (D) Effecten van de combinaties van twee geneesmiddelen in verschillende verhoudingen op de overlevingskans van gewonde PC12-cellen. Statistische waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD uit zes onafhankelijke experimenten. && p < 0,01 in vergelijking met de controlegroep. *p < 0,05 en **p < 0,01 ten opzichte van de modelgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effecten van twee combinaties op de overleving en apoptose van gewonde PC12-cellen. (A) Effect van de componentencombinatie en de voorbereidingscombinatie op de overlevingskans van gewonde PC12-cellen. (B) Grafiek van de in bijlage V-PI gedetecteerde apoptosesnelheid. (C) Statistisch histogram van de apoptosesnelheid. (D) De relatieve fluorescentie-intensiteit van caspase-3 eiwitexpressie (400x). Schaalstaven: 20 μm. (E) Statistisch histogram van fluorescentie-intensiteit van caspase-3 eiwitexpressie. Statistische waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten, met uitzondering van de levensvatbaarheid van cellen voor zes onafhankelijke experimenten. *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001 ten opzichte van de modelgroep. ##p < 0,01 ten opzichte van de bereidingscombinatiegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effecten van de twee combinaties op de expressieniveaus van p-Akt, Akt, Bcl-2 en Bax. (A) Eiwitexpressie van p-Akt en Akt bepaald door Western blot-analyse. (B) Statistisch histogram van p-Akt/Akt ratio statistieken in elke groep. (C) Eiwitexpressie van Bcl-2 en Bax bepaald door Western blot-analyse. (D) Statistisch histogram van de Bcl-2/Bax-verhouding in elke groep. Statistische waarden worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten. *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001 in vergelijking met de modelgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effect van twee combinaties op de Nrf2-eiwitexpressie en ROS-niveaus. (A) Niveaus van ROS werden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie (400x). Schaalbalken: 20 μm. (B) Statistisch histogram van ROS-fluorescentie-intensiteit in elke groep. (C) Nrf2-eiwitexpressie bepaald door Western blot-analyse. (D) Statistisch histogram van nrf2-eiwitexpressie. Statistische waarden worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten. *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001 in vergelijking met de modelgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is nog steeds een gebrek aan ideale geneesmiddelen voor de behandeling van cerebrale ischemie in de moderne klinische praktijk2. Onder begeleiding van het aanvullen van qi en het activeren van de bloedcirculatiemethode zijn Ast, Eri en andere preparaten in combinatie gebruikt in de klinische praktijk van TCM en hebben goede uitgebreide voordelen bereikt 13,14,15. Een groot aantal studies hebben aangetoond dat Ast de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière kan verbeteren, de cerebrale bloedstroom kan verhogen, het vermogen van zenuwcellen om hypoxie te verdragen en bestand is tegen schade door zuurstofvrije radicalen, en neurologische disfunctie aanzienlijk kan verbeteren16,17. Het is met name geschikt voor seniele ischemische cerebrovasculaire ziekte16,17. Eri kan bloedvaten verwijden, de bloedtoevoer naar de hersenen verhogen, ROS verwijderen en lipideperoxidatie verminderen18,19. Het synergetische effect, farmacodynamische componenten en het mechanisme van de combinatie van de twee geneesmiddelen zijn echter nog steeds onduidelijk, wat een veel voorkomend probleem is dat de klinische toepassing van TCM beperkt.
De ischemische en hypoxische omgeving van chronische cerebrale ischemie induceert oxidatieve stressschade en activeert tegelijkertijd de signaalroute van de hersencelapoptose om neuronale apoptose te bevorderen20,21. De PI3K/Akt-route is een klassieke anti-apoptotische en pro-overlevingssignaaltransductieroute22,23, waaronder Bcl-2-familie-eiwitten en de caspase-familie de downstream uitvoerende eiwitten van deze signaalroute zijn. Gefosforyleerde Akt kan direct of indirect de Bcl-2-familie reguleren en de activering van de stroomafwaartse route caspase-3 remmen, waardoor een anti-apoptotisch effect wordt uitgeoefend11. Bovendien kan overtollige ROS gegenereerd door hypoxie oxidatieve stressschade veroorzaken, terwijl gefosforyleerde Akt Nrf2 kan activeren om overtollige ROS te elimineren om oxidatieve stressschade te bestrijden12,24. Daarom kan activering van de PI3K/Akt/Nrf2-route oxidatieve stress en apoptose effectief voorkomen en beheersen, waardoor hypoxisch-ischemisch hersenletsel wordt verminderd25,26.
In de studie werd de voorbereidingscombinatie gescreend met behulp van het gewonde PC12-celmodel en het effect en het mechanisme in dit model werden vergeleken met de eerder gescreende componentcombinatie7. Bovendien is de maximale niet-toxische concentratie van Ast-injectie en Eri-capsule respectievelijk 12 μM (berekend door astragaloside A) en 5 μM (berekend door scutellarine), terwijl de maximale niet-toxische concentratie van astragaloside A en scutellarine respectievelijk 20 μM en 50 μM is7. Het toont aan dat de componentcombinatie veiliger is dan de bereidingscombinatie, met een meer controleerbare kwaliteit en uitgebreide voordelen van hoge efficiëntie en lage toxiciteit.
De huidige celmodellen die kunnen worden gebruikt om cerebrale ischemie te simuleren, omvatten voornamelijk fysieke hypoxie (geïnduceerd door OGD) en chemische hypoxie (geïnduceerd door Na2S2O4 of CoCl2)27. Onder hen hebben zowel OGD- als Na2S2O4-verwondingen een korte hypoxietijd en zijn ze niet geschikt voor het simuleren van chronische ischemie27. CoCl 2-geïnduceerde hypoxie is een van de meest gebruikte hypoxie-mimics in vergelijking met OGD en het gebruik van andere hypoxie-mimics. Het kan leiden tot aanhoudende en stabiele oxidatieve schade door ROS en typische apoptotische veranderingen in verschillende cellijnen veroorzaken27. Daarom werd in deze studie CoCl2 gedurende 24 uur gebruikt om de neuronale hypoxie te simuleren28,29. De modelleringsconcentratie (0,1, 0,2, 0,4 en 0,8 mM) en de geldigheidsperiode (1 en 7 dagen) werden gescreend. Bovendien, gezien het onvermijdelijke gebrek aan glucose en zuurstof na cerebrale ischemie, kan de glucosevrije en hypoxische omgeving cerebrale ischemische schade beter simuleren. Deze studie toonde aan dat 0,4 mM CoCl2 in combinatie met een glucosevrij medium gedurende 24 uur een stabiel en controleerbaar chronisch hypoxisch celmodel kon vaststellen. In de vervolgstudie zal het diermodel van chronische cerebrale ischemie worden gebruikt om de therapeutische voordelen van de componentcombinatie in vivo verder te valideren.
Dit celmodel kan de apoptosesnelheid, caspase-3 fluorescentie-intensiteit en intracellulair ROS-niveau (figuur 2 en figuur 4) verhogen, wat de pathologische veranderingen van chronische cerebrale ischemie, zoals apoptose, oxidatieve stress, enz. Beter kan simuleren. Op basis van dit model werd ontdekt dat de twee soorten combinaties apoptose en oxidatieve stressschade kunnen remmen. Het effect van de componentencombinatie op het bevorderen van de celoverleving was significant beter dan dat van de preparaatcombinatie (figuur 1); beide combinaties kunnen de expressieniveaus van P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax en Nrf2 in verschillende gradaties verhogen (figuur 3 en figuur 4). In het bijzonder had de componentencombinatie een sterker effect op de up-regulatie van Akt/Bcl-2/Bax en Nrf2 signaleringsroute. Deze resultaten geven aan dat de componentencombinatie beter bestand is tegen celbeschadiging dan de voorbereidingscombinatie, die gerelateerd is aan sterkere anti-apoptose en anti-oxidatieve stress.
Kortom, deze resultaten bieden een combinatiestrategie van twee kruiden om gewonde PC12-cellen te behandelen en bieden een nieuw idee voor het evalueren en optimaliseren van de gecombineerde toepassingsmodus van twee kruiden. Over het algemeen biedt deze studie een referentie voor het selecteren van de actieve componentcombinatie van TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door Key R &D-projecten van de Sichuan Provincial Department of science and technology (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
