Summary
Ce protocole fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le protocole fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la médecine traditionnelle chinoise (MTC).
Abstract
Compte tenu des avantages de la combinaison de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement de l’ischémie cérébrale, nous avons étudié les différences d’efficacité et de mécanisme entre la combinaison de préparation et la combinaison de composants afin d’explorer la stratégie de combinaison à deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le chlorure de cobalt (CoCl2) combiné à un milieu sans glucose a été utilisé pour induire des dommages oxydatifs des cellules PC12. Ensuite, la combinaison optimale d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) injection a été sélectionnée et combinée selon des méthodes de conception uniformes après criblage de leur concentration sûre et efficace sur les cellules PC12. En outre, la combinaison de composants criblés comprend 10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarine et 75 μM d’acide chlorogénique dans deux herbes. Ensuite, le MTT, l’annexine V-FITC/PI, l’immunofluorescence et l’analyse par transfert Western ont été utilisés pour évaluer l’efficacité et le mécanisme de la combinaison de préparations et de la combinaison de composants sur les cellules PC12 lésées. Les résultats ont montré que la combinaison de préparation optimale pour la survie cellulaire pro-était l’injection d’Ast et la capsule d’Eri avec une concentration de 6: 1,8 (μM). La combinaison de composants (10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique) était plus efficace que la combinaison de préparation. Les deux combinaisons ont remarquablement réduit le taux apoptotique, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 et le niveau intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS); pendant ce temps, ils ont régulé à la hausse les niveaux d’expression de p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax et Nrf2. Ces effets étaient plus évidents dans la combinaison de composants. En conclusion, les deux combinaisons peuvent inhiber la lésion induite par CoCl2 combiné avec un milieu sans glucose sur les cellules PC12, favorisant ainsi la survie cellulaire. Cependant, l’efficacité de la combinaison de composants par rapport à la combinaison de préparation peut être due à sa régulation plus forte de la voie de signalisation PI3K / Akt / Nrf2 liée au stress oxydatif et à l’apoptose.
Introduction
L’ischémie cérébrale chronique, causée par l’hypoperfusion cérébrale, est une maladie fréquente chez les personnes d’âge moyen et les personnes âgées1. En tant que maladie d’ischémie occulte à long terme, elle peut entraîner un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant. Les principaux mécanismes pathologiques comprennent l’apoptose cellulaire et les dommages oxydatifs, conduisant à un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant; c’est la base pathologique de la maladie d’Alzheimer, de la démence vasculaire et d’autres maladies, et affecte gravement la qualité de vie des patients. Cependant, il y a encore un manque de médicaments idéaux dans la médecine moderne pour traiter l’ischémie cérébrale chronique2. Dans le même temps, la combinaison d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) a été largement utilisée dans la pratique clinique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC)4. La stratégie de combinaison s’est remarquablement améliorée pour favoriser la récupération de la fonction nerveuse après une ischémie cérébrale, ce qui est meilleur que celui d’un seul médicament; Cependant, il existe de grandes différences dans le rapport posologique dans la combinaison des deux médicaments4. Les composants efficaces et le mécanisme d’action ne sont pas bien définis, ce qui est la question clé limitant son application clinique.
Des études antérieures ont démontré l’effet synergique de la combinaison de préparation d’Ast injection et d’Eri injection dans le traitement de l’ischémie cérébrale chez le rat. Il peut réguler positivement l’expression de la protéine p-Akt et réguler à la baisse l’expression dela protéine 5,6 promotrice de la mort associée à Bcl-2 (BAD), qui est l’une des protéines de la famille B-lymphoblastome 2 (Bcl-2) et a pour effet de favoriser l’apoptose. Cependant, la base matérielle et le mécanisme de son effet synergique ne sont pas clairs. En outre, le modèle de lésion des cellules PC12 a été établi avec un milieu sans glucose combiné CoCl2, et la combinaison optimale de composants dans Ast et Eri a été examinée et définie7.
Dans cette étude, les doses efficaces d’Ast et d’Eri sont examinées à l’aide du modèle de cellules PC12 blessées. La combinaison optimale des deux médicaments est examinée à l’aide de ce modèle combiné à la méthode de conception homogène. Le modèle cellulaire est utilisé pour évaluer davantage la différence dans les effets et les mécanismes de la combinaison de préparation et de la combinaison de composants dans les cellules PC12 lésées. Cette stratégie vise à explorer l’effet protecteur et le mécanisme de régulation des deux types de combinaisons sur les cellules PC12 lésées par la voie du signal PI3K / Akt / Nrf2 afin de déterminer le meilleur mode de combinaison. Cette étude fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la MTC.
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Protocol
1. Préparation du réactif
- Préparer le milieu complet en ajoutant 90 mL de DMEM à teneur élevée en sucre, 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 mL de solution de pénicilline-streptomycine dans une fiole de culture stérile de 125 mL. Mélanger le milieu complet et conserver à 4 °C dans des conditions fermées.
- Préparer la solution de CoCl 2 en ajoutant 0,02 g de poudre de CoCl2 (pesée avec précision) dans 10 mL de milieu sans sucre DMEM (complètement dissous) pour obtenir une solution mère de 8,4 mM. Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,22 μm, la sceller et la conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.
NOTE: CoCl2 est instable et doit être stocké dans un récipient hermétique, à l’abri de la lumière; la durée de validité de la solution CoCl2 est de 7 jours. - Préparer la solution de sel tamponné Tris-Hcl (TBST).
- Peser avec précision 8 g de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potassium et 3 g de Tris-base. Ajoutez-les dans un bécher de 1 L, puis ajoutez 1 000 mL d’eau osmosée pour dissoudre le mélange.
- Ajuster le pH à 7,4, ajouter 1 mL de Tween 20 et bien mélanger pour obtenir la solution TBST.
REMARQUE: Tween 20 agit comme un tensioactif pour réduire la liaison non spécifique des anticorps aux antigènes et fonctionne mieux à une concentration de 0,1%.
- Préparer la solution de MTT (sel de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2)-2,5-diphényltétrazolium) en pesant 0,1 g de poudre de MTT dans 20 mL de solution de PBS pour obtenir une solution mère à 5 mg/mL. Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,22 μm, la sceller et la conserver à 4 °C à l’abri de la lumière, placée en veille.
REMARQUE: La poudre MTT est instable et absorbe facilement l’humidité, elle doit donc être stockée dans un endroit fermé et sec à l’abri de la lumière. La solution MTT expire après 7 jours. Le MTT a un effet cancérigène, évitez donc tout contact direct avec la peau. - Préparer la solution de gélule d’Eri en retirant l’enveloppe de la gélule et en pesant avec précision 0,18 g du contenu dans 10 mL de milieu sans sucre DMEM pour préparer une solution mère de 100 μM (basée sur la concentration de scutellarin). Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,2 μm, la sceller et la conserver dans un récipient hermétique à 4 °C.
REMARQUE: La scutellarine est le principal ingrédient actif d’Erigeron breviscapus. La concentration de scutellarine dans les capsules a été déterminée par CLHP-UV à 2,56 mg/g, soit 5,54 μmol/g8. La concentration de la préparation est calculée en fonction de la concentration en scutellarine. Ceci est pratique pour évaluer l’activité pharmacologique de la préparation et du composant. - Préparer la solution de l’injection d’Ast en ajoutant 5 mL d’injection et 5 mL de milieu DMEM sans sucre dans un tube centrifuge stérile de 15 mL pour préparer une solution mère de 60 μM (basée sur la concentration d’astragaloside A). Filtrer la solution à travers un filtre bactérien de 0,2 μm et la conserver dans un récipient hermétique à 4 °C.
REMARQUE : Le volume d’injection est de 10 mL chacun, et la concentration d’astragaloside A dans l’injection a été déterminée par CLHP-ELSD à 0,094 mg/mL (c.-à-d. 120 μM)9. La préparation doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité et opérée de manière étanche à la lumière tout au long du processus. Le volume de la solution injectable et du milieu sans sucre doit être mesuré avec précision et bien mélangé. - Préparer une solution d’astragaloside A en pesant avec précision 7,85 mg d’étalon d’astragaloside A et en la dissolvant complètement dans 2 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de 5 000 μM. Filtrez-le avec un filtre bactérien de 0,22 μm et conservez-le hermétiquement à 4 °C.
NOTE: La poudre d’astragaloside A est insoluble dans le milieu sans sucre. Lors de la préparation de la solution, dissoudre avec la quantité appropriée de DMSO pour maintenir la concentration expérimentale finale de DMSO en dessous de 0,1% et éviter toute cytotoxicité. - Préparer la solution de scutellarine en pesant 11,56 mg d’étalon de scutellarine avec précision et en la dissolvant complètement avec 5 ml de milieu DMEM sans sucre pour préparer une solution mère de 5 000 μM. Filtrez-le avec un filtre bactérien de 0,22 μm et conservez-le hermétiquement à 4 °C.
- Préparer la solution d’acide chlorogénique en pesant 8,86 mg d’acide chlorogénique étalon avec précision et en la dissolvant complètement avec 5 mL de milieu DMEM sans sucre pour préparer une solution mère de 5 000 μM. Filtrez-le avec un filtre bactérien de 0,22 μm et conservez-le hermétiquement à 4 °C.
REMARQUE: La poudre d’acide chlorogénique est instable et absorbe facilement l’eau. Il doit être scellé et conservé à 4 °C à l’abri de la lumière; Le temps d’exposition doit être réduit au minimum pendant la pesée.
2. Essai de viabilité cellulaire
- Obtenir des cellules PC12 et les cultiver dans du DMEM supplémenté avec 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
REMARQUE: Dans cette étude, les cellules sont obtenues auprès de l’Académie chinoise des sciences. Les cellules PC12 sont des cellules adhérentes qui ont les caractéristiques générales des cellules neuroendocrines et sont largement utilisées en neurophysiologie et en neuropharmacologie. - Culture des cellules à 37 °C dans un incubateur supplémenté en 5% de CO 2 et sous-culture tous les2-3 jours. Utilisez des cellules aux passages 4 à 8 pour toutes les expériences.
- Culture cellulaire
- Traiter les cellules PC12 dans la phase de croissance logarithmique (confluence cellulaire de 70% à 80%) avec 1 mL de trypsine (0,25%) et observer les cellules au microscope. Lorsque les cellules deviennent rondes, arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL du milieu complet.
- Transférer les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 ml et centrifuger les cellules à 840 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension avec le milieu complet et transférer la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Comptez ensuite le nombre de cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
- Démarrez le logiciel de cytométrie en flux, sélectionnez le multiple de dilution correspondant de la solution cellulaire dans le paramètre de comptage, puis cliquez sur Tableau de densité après avoir chargé l’échantillon de cellule à partir du tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Encerclez la population cellulaire loin des axes X et Y, cliquez avec le bouton droit sur le tableau de données sous la figure, puis sélectionnez X, Y, Nombre et Nombre d’abs. Les données sous Abs Count dans le tableau de données donnent le résultat du comptage des cellules.
- Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 5 cellules/mL, inoculer 100 μL/puits dans des plaques de 96 puits, et cultiver à 37 °C et5 % de CO2 dans un incubateur pendant 24 h.
- Dépistage des concentrations sécuritaires de deux médicaments sur des cellules PC12 normales
- Culture des cellules comme décrit aux étapes 2.1-2.2. Jeter le surnageant et traiter les cellules normales avec différentes concentrations finales d’injection d’Ast (4, 8, 12, 16, 20 et 24 μM) et de capsule d’Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 et 20 μM). Traiter six puits répliqués de chaque groupe pendant 24 h.
REMARQUE : Les médicaments sont ajoutés au milieu pour atteindre la concentration finale du médicament (mentionnée à l’étape 2.4.1), puis un volume égal de milieu est ajouté à chaque puits. Lors de l’aspiration du surnageant, l’extrémité de la pipette doit être placée doucement contre la paroi du puits pour éviter tout contact avec les cellules au fond du puits. Lors de l’ajout de différentes solutions, ajoutez-les doucement et rapidement le long des bords des puits, et faites attention lors du changement de tête de pistolet de pipette pour éviter d’affecter les résultats expérimentaux. - Jeter le surnageant, ajouter 120 μL de solution de MTT (1 mg/mL) dans chaque puits et incuber les cellules pendant 4 h à 37 °C.
- Après l’incubation, jetez à nouveau le surnageant et ajoutez 150 μL de DMSO à chaque puits. Secouer la plaque pendant 10 min à une vitesse de 240 fois/min (nombre de vibrations horizontales par minute) à l’aide d’un oscillateur vortex.
- Mesurer l’absorbance de chaque échantillon à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Calculer la viabilité cellulaire (%), qui est l’absorbance du groupe traité/absorbance du groupe normal (témoin) x 100.
REMARQUE: Assurez-vous que la solution MTT est dans la période de validité; Si la couleur a changé (en vert foncé), elle ne peut pas être utilisée. Lors de l’essai de l’absorbance des cellules, un puits blanc (milieu de culture et MTT, sans cellules ni médicaments) doit être réglé pour éliminer l’interférence des autres réactifs. Un volume de 150 μL de DMSO est ajouté à chaque puits et agité pendant 10 min pour mieux dissoudre les cristaux bleu-violet. L’absorbance doit être détectée dès que possible pour assurer l’exactitude des résultats.
- Culture des cellules comme décrit aux étapes 2.1-2.2. Jeter le surnageant et traiter les cellules normales avec différentes concentrations finales d’injection d’Ast (4, 8, 12, 16, 20 et 24 μM) et de capsule d’Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 et 20 μM). Traiter six puits répliqués de chaque groupe pendant 24 h.
- Dépistage des concentrations efficaces de deux médicaments sur des cellules PC12 lésées
- Cultivez les cellules pendant 24 h comme mentionné aux étapes 2.1-2.2, jetez le surnageant, puis traitez les cellules avec 20 μL/puits de CoCl2 (0,4 mM) combiné avec le milieu sans sucre.
- Traiter simultanément les cellules avec 100 μL/puits d’injection d’Ast (les concentrations finales sont de 2, 6, 8, 10 et 12 μM) ou 100 μL de capsule d’Eri (les concentrations finales sont de 1, 2, 3, 4 et 5 μM) à 37 °C pendant 24 heures supplémentaires. Ajouter 120 μL/puits de milieu complet au groupe témoin.
REMARQUE: CoCl2 induit des conditions hypoxiques dans les cellules. - Mesurer l’absorbance de chaque échantillon par la méthode MTT et calculer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.
- Criblage de la combinaison optimale de deux médicaments sur la base de la méthode de conception homogène
NOTE: Après avoir obtenu la plage de concentration efficace de l’injection d’astragale et de la capsule de breviscapus, le tableau de la méthode de conception uniforme U 7 (7 4) a été utilisé pour obtenir six combinaisons différentes des deux médicaments. Injection d’Ast : capsule Eri : 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM et 6)12:3,4 μM.- Cultiver les cellules comme décrit ci-dessus à l’étape 2.3.1, et traiter les cellules PC12 lésées avec six concentrations proportionnelles d’Ast injection:Eri capsule comme mentionné ci-dessus.
- Traiter les cellules pendant 24 h et calculer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.
- Evaluation de l’effet protecteur de deux combinaisons optimales sur les cellules PC12 lésées
NOTE: Après avoir obtenu la combinaison de préparation optimale (injection d’Ast: capsule Eri de 6: 1,8 μM) et la combinaison de composants optimale7 (astragaloside A 10 μM, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique), une évaluation plus approfondie est effectuée pour vérifier leurs effets protecteurs sur les cellules PC12 lésées.- Cultiver les cellules comme décrit ci-dessus à l’étape 2.3.1, et traiter les cellules PC12 lésées avec les deux types de combinaisons de médicaments dont il est question dans la NOTE ci-dessus.
- Traiter les cellules pendant 24 h et calculer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.
3. Dosage de l’annexine V-FITC/PI pour le taux d’apoptose
- Ensemencer les cellules PC12 dans une plaque de 12 puits à une concentration de 1,3 x 105 cellules/puits et les cultiver à 37 °C pendant 24 h.
- Regroupez les cellules : groupe témoin, groupe modèle et deux combinaisons de médicaments. Ajouter 1,2 mL/puits de milieu complet au groupe témoin, ajouter 1,2 mL/puits de milieu contenant 0,4 mM de CoCl2au groupe modèle et ajouter 1,2 mL/puits de chacune des deux combinaisons contenant 0,4 mM de CoCl2. Incuber les cellules à 37 °C pendant encore 24 h.
- Après un traitement médicamenteux, traiter les cellules avec 250 μL/puits de trypsine, transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 840 xg pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL du tampon de liaison.
- Incuber les cellules dans l’obscurité avec 5 μL d’annexine V-FITC et 10 μL d’iodure de propidium (PI) pendant 15 minutes à TA, puis vérifier l’apoptose par cytométrie en flux. Définissez trois puits de réplication dans chaque groupe.
NOTE: La trypsine utilisée dans ce test ne peut pas contenir d’EDTA parce que l’EDTA est un agent chélatant des ions métalliques qui entre en compétition avec l’annexine V pour lier les ions calcium et affecte l’affinité de l’annexine pour PI. Lorsque l’apoptose se produit, la phosphosérine, à l’origine sur la face interne de la membrane cellulaire, se tourne vers l’extérieur vers la surface cellulaire, et l’annexine V-FITC se lie sélectivement à la phosphosérine à l’extérieur de la membrane pour montrer une fluorescence verte. - Cliquez sur Compensation automatique dans le menu Démarrer, sélectionnez FITC, PE, PerCP et APC dans le canal Sélectionner, puis sélectionnez Compensation à : Hauteur. Cliquez sur OK dans l’élément statistique : médiane. Avec la même méthode de comptage cellulaire mentionnée à l’étape 2.3.2, prélevez les échantillons de cellules, cliquez sur la carte de densité et encerclez la population cellulaire effective.
- Avec la fluorescence FITC comme paramètre de l’axe X et d’autres paramètres de fluorescence comme paramètre de l’axe Y, créez une carte de densité. Cliquez sur Matrice de compensation dans le menu Démarrer et Coefficient dans la matrice de débordement. Les informations de la carte de densité sont affichées pour l’analyse du taux d’apoptose.
- Incuber les cellules dans l’obscurité avec 5 μL d’annexine V-FITC et 10 μL d’iodure de propidium (PI) pendant 15 minutes à TA, puis vérifier l’apoptose par cytométrie en flux. Définissez trois puits de réplication dans chaque groupe.
4. Détection par immunofluorescence de la génération de caspase-3
- Ensemencer les cellules PC12 sur des lamelles de couverture à une densité de 8 x 104 cellules/lamelle de couverture et les placer dans des plaques de 24 puits à 37 °C pendant 24 h. Regroupez les cellules comme mentionné ci-dessus à l’étape 3.2; Configurez trois fiches de recouvrement répliquées pour chaque groupe.
- Après le traitement médicamenteux, rincer les lames de couverture deux fois avec du PBS (37 °C) pendant 5 min chacune, les fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes et perméabiliser avec du Triton X-100 à 0,5% pendant 20 min à TA.
- Rincez à nouveau les cellules et bloquez-les avec du sérum de chèvre à 10% pendant 1 h à TA.
- Incuber chaque lamelle de couverture avec 200 μL d’anticorps primaire caspase-3 (une protéine exécutive clé de l’apoptose) dilué à une concentration de 1:250 dans 1x TBST, pendant une nuit à 4 °C. Laver avec 1x TBST (trois fois pendant 3 min chacune) et incuber avec 200 μL d’anticorps secondaire (dilution 1:300 dans 1x TBST) pendant 1 h à TA dans l’obscurité.
NOTE: La fluorescence est facilement éteinte; Ainsi, après l’incubation de l’anticorps secondaire, les lames doivent être tenues à l’écart de la lumière. Les anticorps primaires et secondaires doivent être conservés à 4 °C à l’abri de la lumière. - Ajouter 300 μL de DAPI (0,5 μg/mL) aux lamelles de couverture (pour détecter les noyaux) pendant 10 min et laver les cellules trois fois avec 1x TBST pendant 5 min chacune.
- Observez les lamelles de couverture au microscope à fluorescence et capturez des images10. Effectuer une analyse statistique de l’intensité de fluorescence à l’aide du logiciel d’imagerie.
NOTE: Les lames et les lames de couverture utilisées doivent être propres et stériles. Lors de la coloration, faites attention au pH, à la concentration et à la température de la solution de teinture et évitez la trempe par fluorescence. Le microscope fluorescent doit être allumé au moins 15 minutes à l’avance pour préchauffer la lampe au mercure et éteint pendant 30 minutes avant d’être rallumé. Lors de l’acquisition d’images, les paramètres d’exposition du même colorant dans le même lot d’expériences doivent être cohérents pour assurer l’exactitude des résultats.
5. Dosage d’immunofluorescence du niveau de ROS
- Culture et traitement des cellules comme indiqué à l’étape 4.1.
- Après le traitement médicamenteux, laver chaque lamelle de couverture trois fois avec du PBS pendant 3 minutes et incuber avec 400 μL de DCFH-DA (10 μM) à 37 °C pendant 20 min.
NOTE: DCFH-DA est un indicateur universel du stress oxydatif. Il a une perméabilité de la membrane cellulaire et aucune fluorescence. Une fois qu’il pénètre dans la cellule, il est hydrolysé par l’estérase pour produire de la 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH), puis rapidement oxydé pour produire un produit fluorescent puissant. - Lavez à nouveau les cellules avec du DMEM sans sérum (deux fois pendant 3 minutes chacune) et observez immédiatement la lamelle de couverture après avoir ajouté l’agent de trempe à fluorescence au microscope à fluorescence. Calculez l’intensité relative de fluorescence à l’aide du logiciel d’imagerie.
REMARQUE: Après avoir chargé la sonde DCFH-DA, assurez-vous de nettoyer la sonde résiduelle qui ne pénètre pas dans la cellule, sinon l’arrière-plan deviendra élevé.
6. Détection par transfert Western de l’expression protéique de Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 et Bax11,12
- Inoculer les cellules PC12 dans des plaques à 6 puits à une concentration de 1 x 106 cellules/puits et les cultiver à 37 °C pendant 24 h. Regroupez et traitez les cellules comme indiqué ci-dessus à l’étape 4.1, et définissez trois puits de réplication dans chaque groupe.
- Après un traitement médicamenteux pendant 24 h, laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune et incuber sur de la glace pendant 30 minutes dans un tampon de lyse préparé. Après lyse, centrifuger les cellules pendant 20 min à 16 000 x g et 4 °C et recueillir les surnageants.
- Détectez la concentration de protéines et ajustez-la selon les instructions du test Bradford. Diluer les échantillons et les dénaturer à 100 °C pendant 10 min.
REMARQUE: Le tampon de lyse est composé d’inhibiteur de phosphatase, d’inhibiteur de protéase et de lysat RIPA dans un rapport volumique de 1: 1: 50. Dans le groupe témoin, 200 μL/puits de tampon de lyse sont nécessaires, et 100 μL/puits de tampon de lyse sont nécessaires dans les autres groupes. En général, les concentrations de protéines des groupes témoin, modèle et deux types de combinaisons sont respectivement de 0,45 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0,32-0,39 mg/mL; leurs concentrations de protéines après dilution avec le tampon de charge sont respectivement de 0,36, 0,2 et 0,256-0,312 mg/mL. - Pour détecter des protéines de poids moléculaire différents, chargez 25 μg de protéines dans chaque voie, exécutez une électrophorèse SDS-PAGE à 12% et transférez le gel sur des membranes PVDF.
REMARQUE: Lors de la préparation du gel SDS, il doit être complètement mélangé sans bulles ni particules insolubles; sinon, des bandes inégales ou irrégulières peuvent se produire. Lors du transfert des membranes, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre la membrane PVDF et le gel; Sinon, des taches blanches apparaîtront dans la bande. De plus, cette étape doit être effectuée à basse température et le sac de glace doit être changé toutes les 30 minutes. - Bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5 % pendant 1,5 h à TA et incuber avec 5 mL des anticorps primaires correspondants (Nrf2 1:1 000, Akt 1:2 000, p-Akt 1:2 000, Bcl-2 1:5 000 et Bax 1:1 000) pendant 24 h à 4 °C. Utiliser l’anticorps β-actine (1:5 000) comme contrôle interne.
- Laver les membranes avec du TBST (trois fois pendant 10 minutes chacune), puis incuber avec 5 mL d’anticorps secondaires conjugués HPR (1:5 000) à TA pendant 2 h.
NOTE: Le taux de dilution des anticorps ne doit pas être modifié arbitrairement et les membranes doivent être lavées avec TBST suffisamment en stricte conformité avec les exigences pour éviter que la couleur de fond de la bande ne soit trop noire. - Enfin, lavez à nouveau la membrane avec du TBST et traitez-la avec un substrat HRP chimiluminescent (selon les instructions du fabricant) pour la détection des bandes protéiques. Capturez les images à l’aide du système d’imagerie par chimiluminescence et quantifiez les valeurs de gris des protéines à l’aide du logiciel d’imagerie, avec la β-actine comme contrôle interne comparatif.
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Representative Results
Le dépistage de la combinaison optimale d’Ast injection et de capsule Eri est illustré à la figure 1. Le taux de survie cellulaire de l’injection d’Ast et de la capsule Eri sur les cellules PC12 normales est illustré à la figure 1A. La viabilité cellulaire était inférieure à 95 % avec l’injection d’Ast à des concentrations supérieures à 12 μM (figure 1A) et la capsule Eri à des concentrations supérieures à 5 μM (figure 1A), ce qui indique que la concentration maximale non toxique était de 12 μM et 5 μM, respectivement. Leur cytotoxicité était supérieure à celle de l’astragaloside A et de la scutellarine utilisés seuls. La viabilité de l’injection d’Ast et de la capsule Eri sur les cellules PC12 lésées induite par CoCl2 est illustrée à la figure 1B,C. Par rapport au groupe témoin, l’injection d’Ast pourrait améliorer le taux de survie des cellules PC12 blessées dans la plage de concentration de 6-12 μM (p < 0,05 ou p < 0,01), et les capsules Eri à la concentration de 2-5 μM pourraient améliorer le taux de survie (p < 0,05 ou p < 0,01 ). L’injection d’Ast et la capsule Eri dans les rapports de 10:1, 8:4,2 et 6:1,8 μM peuvent augmenter considérablement la viabilité des cellules PC12 de lésion (p < 0,01) (Figure 1D). Le rapport de 6:1,8 μM a montré la viabilité cellulaire la plus élevée, indiquant qu’il s’agit de la combinaison de préparation et de l’activité pharmacologique optimales par rapport à la meilleure combinaison de composants.
L’évaluation des effets protecteurs de deux types de combinaison sur les cellules PC12 lésées est présentée à la figure 2. Par rapport au groupe témoin, la viabilité cellulaire des deux combinaisons a été significativement favorisée (p < 0,001), et la combinaison de composants était supérieure à la combinaison de préparation (Figure 2A). Cela suggère que la combinaison de composants peut favoriser la survie cellulaire mieux que la combinaison de préparation. Le taux d’apoptose a été testé par cytométrie de flux (Figure 2B,C). Par rapport au groupe normal, les pourcentages de cellules apoptotiques précoces, tardives et totales étaient significativement plus élevés dans le groupe témoin (p < 0,01 ou p < 0,001). Par rapport au groupe témoin, les pourcentages de cellules apoptotiques à chaque stade étaient significativement plus faibles dans les groupes de traitement (p < 0,05 ou p < 0,01, ou p < 0,001). L’intensité de fluorescence de l’expression de la protéine caspase-3 dans chaque groupe est illustrée à la figure 2D,E. Par rapport au groupe normal, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 était significativement plus élevée dans le groupe témoin. Par rapport au groupe témoin, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 était significativement plus faible dans chaque groupe de traitement (p < 0,001 ou p < 0,01) et était relativement plus faible dans le groupe de combinaison de composants que dans le groupe de combinaison de préparation. Ces résultats suggèrent que le modèle cellulaire peut induire l’apoptose et que l’effet anti-apoptose de la combinaison de composants est meilleur que celui de la combinaison de préparation.
Le transfert Western a détecté l’expression des protéines p-Akt, Akt, Bcl-2 et Bax (Figure 3). Par rapport au groupe normal, les niveaux d’expression de p-Akt/Akt et de Bcl-2/Bax étaient significativement plus faibles dans le groupe témoin (p < 0,01 ou p < 0,001). Par rapport au groupe témoin, l’expression de p-Akt/Akt et de Bcl-2/Bax était significativement plus élevée dans les deux combinaisons (p < 0,05 ou p < 0,01, ou p < 0,001), en particulier dans la combinaison de composants. Les résultats suggèrent que la combinaison de composants est supérieure à la combinaison de préparation pour favoriser la survie cellulaire, ce qui est lié à l’effet anti-apoptose plus fort produit par la régulation positive de la voie de signal Akt / Bcl-2 / Bax.
La fluorescence du DCFH peut être mesurée au microscope à fluorescence pour déterminer le niveau de ROS dans les cellules (Figure 4A,B). Comme le montre la figure 4A, la fluorescence était presque invisible dans les cellules normales, et la fluorescence dans le groupe témoin était significativement améliorée. La fluorescence dans les deux combinaisons a été significativement réduite par rapport au groupe modèle. Comme le montre la figure 4B, l’intensité relative de fluorescence était significativement plus faible dans chaque groupe de traitement par rapport au groupe modèle (p < 0,001). La fluorescence avait tendance à diminuer dans le groupe de combinaison de composants par rapport au groupe de combinaison de préparation, indiquant que le modèle cellulaire peut induire des dommages oxydatifs. L’effet anti-oxydatif de la combinaison de composants est meilleur que celui de la combinaison de préparation.
Le transfert Western a détecté l’expression de la protéine Nrf2 (Figure 4C). Par rapport au groupe normal, l’expression de Nrf2 a été significativement réduite dans le groupe modèle (p < 0,05). Par rapport au groupe témoin, l’expression de la protéine Nrf2 était significativement plus élevée dans les groupes de traitement (p < 0,01 ou p < 0,05), en particulier dans le groupe de combinaison de composants (Figure 4D). Cela suggère que la combinaison de composants est meilleure que la combinaison de préparation pour favoriser la survie cellulaire, ce qui est lié aux dommages antioxydants plus forts produits par la régulation positive de la voie du signal Nrf2.
En conclusion, la combinaison de composants (10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique) pourrait favoriser la survie des cellules lésées mieux que la combinaison de préparation (injection d’Ast de 6 μM et capsule d’Eri de 1,8 μM) grâce à une régulation plus forte des voies de signal liées à l’apoptose et aux dommages oxydatifs.
Le logiciel statistique SPSS 26.0 a été utilisé pour l’analyse statistique, et toutes les données sont exprimées sous forme de moyennes ±écart type (ET). Pour les comparaisons entre les groupes, les données ont été évaluées par une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey. p < 0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative.
Figure 1 : Effets des médicaments sur la viabilité des cellules PC12 normales et lésées. (A) Effets de diverses concentrations d’injection d’Ast et de diverses concentrations de capsule Eri sur les cellules PC12 normales. (B) Dépistage de la concentration efficace d’Ast injectable sur les cellules PC12 lésées. (C) Dépistage de la concentration efficace de la capsule Eri sur les cellules PC12 lésées. (D) Effets des combinaisons de deux médicaments dans des proportions différentes sur le taux de survie des cellules PC12 lésées. Les valeurs statistiques sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type de six expériences indépendantes. &&p < 0,01 par rapport au groupe témoin. *p < 0,05 et **p < 0,01 par rapport au groupe de modèles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effets de deux combinaisons sur la survie et l’apoptose des cellules PC12 lésées. (A) Effet de la combinaison de composants et de la combinaison de préparation sur le taux de survie des cellules PC12 lésées. (B) Graphique du taux d’apoptose détecté par l’annexine V-PI. (C) Histogramme statistique du taux d’apoptose. (D) L’intensité relative de fluorescence de l’expression de la protéine caspase-3 (400x). Barres d’échelle : 20 μm. (E) Histogramme statistique de l’intensité de fluorescence de l’expression de la protéine caspase-3. Les valeurs statistiques sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes, à l’exception de la viabilité cellulaire pour six expériences indépendantes. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport au groupe de modèles. ##p < 0,01 par rapport au groupe de combinaison de préparation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effets des deux combinaisons sur les niveaux d’expression de p-Akt, Akt, Bcl-2 et Bax. (A) Expression protéique de p-Akt et Akt déterminée par Western blot. (B) Histogramme statistique des statistiques du rapport p-Akt/Akt dans chaque groupe. (C) Expression protéique de Bcl-2 et de Bax déterminée par transfert Western. (D) Histogramme statistique du rapport Bcl-2/Bax dans chaque groupe. Les valeurs statistiques sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport au groupe de modèles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet de deux combinaisons sur l’expression de la protéine Nrf2 et les niveaux de ROS. (A) Les niveaux de ROS ont été détectés par microscopie à fluorescence (400x). Barres d’échelle: 20 μm. (B) Histogramme statistique de l’intensité de fluorescence ROS dans chaque groupe. (C) Expression de la protéine Nrf2 déterminée par Western blot. (D) Histogramme statistique de l’expression de la protéine Nrf2. Les valeurs statistiques sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport au groupe de modèles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il y a encore un manque de médicaments idéaux pour le traitement de l’ischémie cérébrale dans la pratique clinique moderne2. Sous la direction de la supplémentation en qi et de l’activation de la méthode de circulation sanguine, Ast, Eri et d’autres préparations ont été utilisés en combinaison dans la pratique clinique de la MTC et ont obtenu de bons avantages complets13,14,15. Un grand nombre d’études ont montré que l’Ast peut améliorer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, augmenter le flux sanguin cérébral, améliorer la capacité des cellules nerveuses à tolérer l’hypoxie et à résister aux dommages causés par les radicaux libres d’oxygène, et peut améliorer considérablement le dysfonctionnement neurologique16,17. Il est particulièrement adapté aux maladies cérébrovasculaires ischémiques séniles16,17. Eri peut dilater les vaisseaux sanguins, augmenter l’apport sanguin au cerveau, éliminer les ROS et réduire la peroxydation lipidique18,19. Cependant, l’effet synergique, les composants pharmacodynamiques et le mécanisme de la combinaison des deux médicaments ne sont toujours pas clairs, ce qui est un problème courant limitant l’application clinique de la MTC.
L’environnement ischémique ischémique et hypoxique chronique induit des dommages de stress oxydatif et, en même temps, active la voie de signalisation de l’apoptose des cellules cérébrales pour favoriser l’apoptose neuronale20,21. La voie PI3K/Akt est une voie classique de transduction du signal anti-apoptotique et pro-survie22,23, parmi laquelle les protéines de la famille Bcl-2 et la famille des caspases sont les protéines exécutives en aval de cette voie de signal. L’Akt phosphorylé peut réguler directement ou indirectement la famille Bcl-2 et inhiber l’activation de la voie aval caspase-3, exerçant ainsi un effet anti-apoptotique11. En outre, l’excès de ROS généré par l’hypoxie peut induire des lésions de stress oxydatif, tandis que l’Akt phosphorylé peut activer Nrf2 pour éliminer l’excès de ROS afin de lutter contre les dommages causés par le stress oxydatif12,24. Par conséquent, l’activation de la voie PI3K/Akt/Nrf2 peut prévenir et contrôler efficacement le stress oxydatif et l’apoptose, réduisant ainsi les lésions cérébrales hypoxiques-ischémiques25,26.
Dans l’étude, la combinaison de préparation a été examinée à l’aide du modèle de cellules PC12 blessées, et l’effet et le mécanisme de ce modèle ont été comparés à la combinaison de composants examinée précédemment7. En outre, la concentration maximale non toxique d’Ast injectable et de capsule d’Eri est respectivement de 12 μM (calculée par l’astragaloside A) et de 5 μM (calculée par la scutellarine), tandis que la concentration maximale non toxique d’astragaloside A et de scutellarine est de 20 μM et 50 μM, respectivement7. Il montre que la combinaison de composants est plus sûre que la combinaison de préparation, avec une qualité plus contrôlable et des avantages complets de haute efficacité et de faible toxicité.
Les modèles cellulaires actuels qui peuvent être utilisés pour simuler l’ischémie cérébrale comprennent principalement l’hypoxie physique (induite par OGD) et l’hypoxie chimique (induite parNa2S2O4ouCoCl2)27. Parmi eux, les blessures OGD et Na2 S2O4 ont un temps d’hypoxie court et ne conviennent pas à la simulation de l’ischémie chronique27. L’hypoxie induite par CoCl2 est l’un des imitateurs d’hypoxie les plus couramment utilisés par rapport à l’OGD et l’utilisation d’autres imitateurs d’hypoxie. Il peut entraîner des dommages oxydatifs persistants et stables par les ROS et produire des changements apoptotiques typiques dans différentes lignées cellulaires27. Par conséquent, dans cette étude, CoCl2 a été utilisé pendant 24 h pour simuler l’hypoxie neuronale28,29. Sa concentration de modélisation (0,1, 0,2, 0,4 et 0,8 mM) et la période de validité (1 et 7 jours) ont été examinées. De plus, étant donné le manque inévitable de glucose et d’oxygène après une ischémie cérébrale, l’environnement hypoxique et sans glucose peut mieux simuler une lésion ischémique cérébrale. Cette étude a montré que 0,4 mM de CoCl2combiné à un milieu sans glucose pendant 24 h pouvait établir un modèle de cellules hypoxiques chroniques stable et contrôlable. Dans l’étude de suivi, le modèle animal de l’ischémie cérébrale chronique sera utilisé pour valider davantage les avantages thérapeutiques de la combinaison de composants in vivo.
Ce modèle cellulaire peut augmenter le taux d’apoptose, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 et le niveau de ROS intracellulaire (Figure 2 et Figure 4), ce qui peut mieux simuler les changements pathologiques de l’ischémie cérébrale chronique, tels que l’apoptose, le stress oxydatif, etc. Sur la base de ce modèle, il a été constaté que les deux types de combinaisons peuvent inhiber l’apoptose et les dommages causés par le stress oxydatif. L’effet de la combinaison de composants sur la promotion de la survie cellulaire était significativement meilleur que celui de la combinaison de préparation (Figure 1) ; les deux combinaisons pourraient réguler à la hausse les niveaux d’expression de P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax et Nrf2 à différents degrés (Figure 3 et Figure 4). En particulier, la combinaison de composants a eu un effet plus fort sur la régulation positive de la voie de signalisation Akt/Bcl-2/Bax et Nrf2. Ces résultats indiquent que la combinaison de composants peut mieux résister aux dommages cellulaires que la combinaison de préparation, qui est liée à un stress anti-apoptose et anti-oxydatif plus fort.
En conclusion, ces résultats fournissent une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées et fournissent une nouvelle idée pour évaluer et optimiser le mode d’application combiné de deux herbes. Dans l’ensemble, cette étude fournit une référence pour sélectionner la combinaison de composants actifs de la MTC.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des projets clés de R & D du Département provincial de la science et de la technologie du Sichuan (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
