Summary
פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. הפרוטוקול מספק סימוכין לאופטימיזציה של מצב היישום הטוב ביותר של הרפואה הסינית המסורתית (TCM).
Abstract
לאור יתרונות השילוב של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בטיפול באיסכמיה מוחית, חקרנו את ההבדלים ביעילות ובמנגנון בין שילוב התכשיר לשילוב הרכיבים על מנת לבחון את אסטרטגיית שילוב שני צמחי המרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. קובלט כלוריד (CoCl2) בשילוב עם מדיום נטול גלוקוז שימש כדי לגרום נזק חמצוני של תאי PC12. לאחר מכן, השילוב האופטימלי של הזרקת Astragalus mongholicus (Ast) והזרקת Erigeron breviscapus (Eri) נבחר ושולב בשיטות עיצוב אחידות לאחר סינון הריכוז הבטוח והיעיל שלהם על תאי PC12. יתר על כן, שילוב הרכיבים שנבדק כולל 10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין, ו 75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית בשני עשבי תיבול. לאחר מכן, MTT, Annexin V-FITC/PI, immunofluorescence, וניתוח כתמים מערביים שימשו להערכת היעילות והמנגנון של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים על תאי PC12 פגועים. התוצאות הראו כי שילוב ההכנה האופטימלי להישרדות תאים היה הזרקת Ast וקפסולה Eri עם ריכוז של 6:1.8 (μM). שילוב הרכיבים (10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין ו-75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית) היה יעיל יותר משילוב ההכנה. שני הצירופים הפחיתו במידה ניכרת את קצב האפופטוטי, את עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 ואת רמת החמצן הריאקטיבי התוך-תאי (ROS); בינתיים, הם שיפרו את רמות הביטוי של p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax ו-Nrf2. השפעות אלה ניכרו יותר בשילוב הרכיבים. לסיכום, שני השילובים יכולים לעכב את הפגיעה הנגרמת על ידי CoCl2 בשילוב עם תווך ללא גלוקוז על תאי PC12, ובכך לקדם את הישרדות התא. עם זאת, היעילות של שילוב הרכיבים על פני שילוב ההכנה עשויה לנבוע מהוויסות החזק יותר של מסלול האיתות PI3K/Akt/Nrf2 הקשור לעקה חמצונית ואפופטוזיס.
Introduction
איסכמיה מוחית כרונית, הנגרמת על ידי היפופרפוזיה מוחית, היא מחלה שכיחה בקרב אנשים בגיל העמידה וקשישים1. כמחלת איסכמיה סמויה ארוכת טווח, היא עלולה להוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך. המנגנונים הפתולוגיים העיקריים כוללים אפופטוזיס של תאים ונזק חמצוני, המוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך; זהו הבסיס הפתולוגי של מחלת אלצהיימר, דמנציה וסקולרית ומחלות אחרות, ומשפיע קשות על איכות החיים של החולים. עם זאת, עדיין חסרות תרופות אידיאליות ברפואה המודרנית לטיפול באיסכמיה מוחית כרונית2. במקביל, השילוב של Astragalus mongholicus (Ast) ו- Erigeron breviscapus (Eri) נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית (TCM)4. האסטרטגיה המשולבת השתפרה להפליא בקידום התאוששות תפקוד העצבים לאחר איסכמיה מוחית, שהיא טובה יותר מזו של תרופה בודדת; עם זאת, ישנם הבדלים גדולים ביחס המינון בשילוב של שתי התרופות4. המרכיבים היעילים ומנגנון הפעולה אינם מוגדרים היטב, וזהו נושא המפתח המגביל את היישום הקליני שלה.
מחקרים קודמים הדגימו את ההשפעה הסינרגיסטית של שילוב ההכנה של הזרקת Ast והזרקת Eri בטיפול באיסכמיה מוחית בחולדות. זה יכול לווסת את הביטוי של חלבון p-Akt ולהפחית את הביטוי של Bcl-2 הקשורים למוות מקדמי מוות (BAD) חלבון5,6, שהוא אחד ממשפחת B-לימפובלסטומה 2 (Bcl-2) חלבונים ויש לו השפעה של קידום אפופטוזיס. עם זאת, הבסיס החומרי והמנגנון של השפעתה הסינרגטית אינם ברורים. יתר על כן, מודל הפציעה של תאי PC12 הוקם עם CoCl2 משולב תווך ללא גלוקוז, ושילוב הרכיבים האופטימלי ב- Ast ו- Eri נבדק והוגדר7.
במחקר זה, המינונים היעילים של Ast ו- Eri נבדקים באמצעות מודל תאי PC12 הפגוע. השילוב האופטימלי של שתי התרופות נבדק באמצעות מודל זה בשילוב עם שיטת התכנון ההומוגנית. מודל התא משמש להערכה נוספת של ההבדל בהשפעות ובמנגנונים של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים בתאי PC12 פגועים. אסטרטגיה זו שואפת לחקור את אפקט ההגנה ואת מנגנון הבקרה של שני סוגי הצירופים על תאי PC12 פגועים באמצעות מסלול האות PI3K/Akt/Nrf2 כדי לקבוע את מצב השילוב הטוב ביותר. מחקר זה מספק התייחסות למיטוב מצב היישום הטוב ביותר של TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מגיב
- הכן את המדיום המלא על ידי הוספת 90 מ"ל של DMEM מדיום סוכר גבוה, 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ו 1 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין בבקבוק תרבית סטרילית 125 מ"ל. יש לערבב את המדיום המלא ולאחסן בטמפרטורה של 4°C בתנאים סגורים.
- הכן תמיסת CoCl 2 על ידי הוספת 0.02 גרם אבקת CoCl2 (במשקל מדויק) ב-10 מ"ל של DMEM ללא סוכר (מומס לחלוטין) לקבלת תמיסת מלאי של 8.4 מילימול. סנן את התמיסה עם מסנן חיידקים בגודל 0.22 מיקרומטר, אטם אותה ואחסן אותה במרחק של 4°C מאור.
הערה: CoCl2 אינו יציב ויש לאחסן אותו במיכל אטום, מוגן מפני אור; תקופת התוקף של פתרון CoCl2 היא 7 ימים. - הכינו תמיסת מלח חוצצת Tris-Hcl (TBST).
- שקול במדויק 8 גרם נתרן כלורי, 0.2 גרם אשלגן כלורי, ו 3 גרם של בסיס טריס. הוסיפו אותם לכוס של 1 ליטר, ולאחר מכן הוסיפו 1,000 מ"ל של מי RO כדי להמיס את התערובת.
- התאם את ה- pH ל- 7.4, הוסף 1 מ"ל של Tween 20, וערבב היטב כדי להשיג את פתרון TBST.
הערה: Tween 20 פועל כחומר פעילי שטח כדי להפחית את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים לאנטיגנים ועובד הכי טוב בריכוז של 0.1%.
- הכן תמיסת MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) על ידי שקילת 0.1 גרם אבקת MTT בתמיסת PBS של 20 מ"ל כדי לקבל תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל. סננו את התמיסה באמצעות מסנן חיידקים בגודל 0.22 מיקרומטר, אטמו אותה ואחסנו אותה במרחק של 4°C מאור, כשהיא במצב המתנה.
הערה: אבקת MTT אינה יציבה וסופגת לחות בקלות, לכן יש לאחסן אותה במקום סגור ויבש, הרחק מאור. פג תוקפו של פתרון MTT לאחר 7 ימים. ל-MTT יש השפעה מסרטנת, לכן יש להימנע ממגע ישיר עם העור. - הכן את תמיסת הקפסולה Eri על ידי הסרת מעטפת הקפסולה ומשקל מדויק של 0.18 גרם מהתוכן ב 10 מ"ל של מדיום DMEM ללא סוכר כדי להכין תמיסת מלאי 100 מיקרומטר (מבוסס על ריכוז scutellarin). סננו את התמיסה עם מסנן חיידקים בגודל 0.2 מיקרומטר, אטמו אותה ואחסנו אותה במיכל אטום בטמפרטורה של 4°C.
הערה: Scutellarin הוא המרכיב הפעיל העיקרי של Erigeron breviscapus. ריכוז scutellarin בכמוסות נקבע על ידי HPLC-UV להיות 2.56 מ"ג / גרם, כלומר, 5.54 μmol / גרם8. ריכוז התכשיר מחושב על בסיס ריכוז scutellarin. זה נוח להערכת הפעילות הפרמקולוגית של התכשיר והרכיב. - הכן את הפתרון של הזרקת Ast על ידי הוספת 5 מ"ל הזרקה ו 5 מ"ל של מדיה DMEM ללא סוכר בצינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל להכנת תמיסת מלאי 60 מיקרומטר (מבוסס על ריכוז אסטרגלוסיד A). סננו את התמיסה דרך מסנן חיידקים בגודל 0.2 מיקרומטר, ואחסנו אותה במיכל אטום בטמפרטורה של 4°C.
הערה: נפח ההזרקה הוא 10 מ"ל כל אחד, וריכוז אסטרגלוסיד A בזריקה נקבע על ידי HPLC-ELSD להיות 0.094 מ"ג/מ"ל (כלומר, 120 מיקרומטר)9. ההכנה צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגית ולפעול באופן חסין אור לכל אורכו. יש למדוד במדויק את נפח תמיסת ההזרקה והמדיום ללא סוכר ולערבב היטב. - הכינו תמיסה של אסטרגלוסיד A על ידי שקילה מדויקת של 7.85 מ"ג של אסטרגלוסיד A סטנדרטי והמסתו לחלוטין ב-2 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) להכנת תמיסת מלאי של 5,000 מיקרומטר. סנן אותו עם מסנן חיידקים 0.22 מיקרומטר ואחסן אותו אטום ב 4 ° C.
הערה: אבקת Astragaloside A אינה מסיסה בתווך ללא סוכר. בעת הכנת התמיסה, יש להמיס אותה עם הכמות המתאימה של DMSO כדי לשמור על ריכוז הניסוי הסופי של DMSO מתחת ל-0.1% כדי להבטיח שאין ציטוטוקסיות. - הכינו את תמיסת הסקוטלרין על ידי שקילת 11.56 מ"ג של סקוטלרין סטנדרטי באופן מדויק וממיס אותה לחלוטין עם 5 מ"ל של מדיום DMEM ללא סוכר להכנת תמיסת מלאי של 5,000 מיקרומטר. סנן אותו עם מסנן חיידקים 0.22 מיקרומטר ואחסן אותו אטום ב 4 ° C.
- הכן את תמיסת החומצה הכלורוגנית על ידי שקילת 8.86 מ"ג של חומצה כלורוגנית סטנדרטית באופן מדויק וממיס אותה לחלוטין עם 5 מ"ל של מדיום DMEM ללא סוכר כדי להכין תמיסת מלאי של 5,000 מיקרומטר. סנן אותו עם מסנן חיידקים 0.22 מיקרומטר ואחסן אותו אטום ב 4 ° C.
הערה: אבקת חומצה כלורוגנית אינה יציבה ונספגת מים בקלות. זה צריך להיות אטום ומאוחסן ב 4 °C הרחק מאור; יש למזער את זמן החשיפה במהלך השקילה.
2. בדיקת כדאיות התא
- להשיג תאי PC12 ולגדל אותם בתרבית DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U / מ"ל של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין.
הערה: במחקר זה, התאים מתקבלים מהאקדמיה הסינית למדעים. תאי PC12 הם תאים דבקים בעלי המאפיינים הכלליים של תאים נוירואנדוקריניים ונמצאים בשימוש נרחב בנוירופיזיולוגיה ובנוירופרמקולוגיה. - תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור בתוספת 5%CO2 ותת-תרבית אותם כל 2-3 ימים. השתמש בתאים במעברים 4-8 לכל הניסויים.
- תרבית תאים
- יש לטפל בתאי PC12 בשלב הגידול הלוגריתמי (70%-80% מפגש תאים) עם 1 מ"ל טריפסין (0.25%) ולהתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ. כאשר התאים הופכים עגולים, לעצור את העיכול טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של המדיום המלא.
- מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את התאים ב 840 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש עם המדיום המלא, והעבירו את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן ספור את מספר התאים באמצעות ציטומטר זרימה.
- הפעל את תוכנת ציטומטריית הזרימה, בחר את מכפילת הדילול המתאימה של תמיסת התא בהגדרת הספירה ולחץ על תרשים צפיפות לאחר טעינת דגימת התא מצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- הקף את אוכלוסיית התאים הרחק מציר X ומציר Y, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על טבלת הנתונים מתחת לאיור ובחר X, Y, Count ו- ABS Count. הנתונים תחת Abs Count בטבלת הנתונים מספקים את תוצאת ספירת התאים.
- התאימו את ריכוז התאים ל-1 x 10 5 תאים/מ"ל, חסנו 100 μL/well בצלחות של 96 בארות, ותרבו בטמפרטורה של 37°Cו-5 % CO2 באינקובטור למשך 24 שעות.
- בדיקת ריכוזים בטוחים של שתי תרופות בתאי PC12 תקינים
- תרבית את התאים כמתואר בשלבים 2.1-2.2. השליכו את הסופרנטנט, וטפלו בתאים הנורמליים עם ריכוזים סופיים שונים של הזרקת Ast (4, 8, 12, 16, 20 ו-24 מיקרומטר) וקפסולת Eri (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20 מיקרומטר). טפל בשש בארות משוכפלות של כל קבוצה במשך 24 שעות.
הערה: התרופות מתווספות למדיה כדי להשיג את הריכוז הסופי של התרופה (המוזכר בשלב 2.4.1), ולאחר מכן נפח שווה של מדיה מתווסף לכל באר. כאשר שואפים את supernatant, קצה פיפטה צריך להיות ממוקם בעדינות על קיר הבאר כדי למנוע מגע עם התאים בתחתית הבאר. בעת הוספת פתרונות שונים, להוסיף אותם בעדינות ובמהירות לאורך שולי הבארות, ולשים לב בעת שינוי ראש אקדח פיפטה כדי למנוע השפעה על תוצאות הניסוי. - השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 120 מיקרוליטר של תמיסת MTT (1 מ"ג/מ"ל) לכל באר, ודגרו על התאים במשך 4 שעות ב-37°C.
- לאחר הדגירה, השליכו שוב את הסופרנאטנט והוסיפו 150 מיקרוליטר DMSO לכל באר. נערו את הצלחת במשך 10 דקות במהירות של 240 פעמים לדקה (מספר תנודות אופקיות לדקה) באמצעות מתנד מערבולת.
- מדוד את הספיגה של כל דגימה ב- 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות. חישוב כדאיות התא (%), שהיא ספיגת הקבוצה המטופלת/ספיגה של נורמלי הקבוצה (ביקורת) x 100.
הערה: ודא שפתרון MTT נמצא בתוך תקופת התוקף; אם הצבע השתנה (לירוק כהה), לא ניתן להשתמש בו. בעת בדיקת ספיגת תאים, יש להגדיר באר ריקה (מדיום תרבית ו- MTT, ללא תאים או תרופות) כדי למנוע את ההפרעה של ריאגנטים אחרים. נפח של 150 μL של DMSO מתווסף לכל באר ומנער במשך 10 דקות כדי להמיס את הגבישים הכחולים-סגולים טוב יותר. יש לזהות את הספיגה בהקדם האפשרי כדי להבטיח את דיוק התוצאות.
- תרבית את התאים כמתואר בשלבים 2.1-2.2. השליכו את הסופרנטנט, וטפלו בתאים הנורמליים עם ריכוזים סופיים שונים של הזרקת Ast (4, 8, 12, 16, 20 ו-24 מיקרומטר) וקפסולת Eri (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20 מיקרומטר). טפל בשש בארות משוכפלות של כל קבוצה במשך 24 שעות.
- בדיקת ריכוזים אפקטיביים של שתי תרופות על תאי PC12 פגועים
- תרבית את התאים במשך 24 שעות כפי שהוזכר בשלבים 2.1-2.2, להשליך את supernatant, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 20 μL / באר של CoCl2 (0.4 mM) בשילוב עם המדיום ללא סוכר.
- יש לטפל בו זמנית בתאים עם 100 μL/well של הזרקת Ast (הריכוזים הסופיים הם 2, 6, 8, 10 ו-12 μM) או 100 μL של קפסולת Eri (הריכוזים הסופיים הם 1, 2, 3, 4 ו-5 μM) ב-37°C למשך 24 שעות נוספות. הוסף 120 μL/well של מדיום שלם לקבוצת הביקורת.
הערה: CoCl2 גורם לתנאים היפוקסיים בתאים. - למדוד את הספיגה של כל דגימה בשיטת MTT ולחשב את כדאיות התא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 2.4.2 ו- 2.4.3.
- סינון השילוב האופטימלי של שתי תרופות על בסיס שיטת התכנון ההומוגנית
הערה: לאחר השגת טווח הריכוז האפקטיבי של הזרקת אסטרגלוס וקפסולת breviscapus, שיטת העיצוב האחיד U 7 (7 4) טבלה שימש להשגת שישה שילובים שונים של שתי התרופות. הזרקת Ast:Eri capsule: 1) 2:2.6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1.8 μM, 4) 8:4.2 μM, 5) 10:1 μM, ו-6)12:3.4 μM.- תרבית את התאים כמתואר לעיל בשלב 2.3.1, ותטפל בתאי PC12 הפגועים עם שישה ריכוזי פרופורציה של הזרקת Ast:Eri כמוסה כאמור לעיל.
- טפל בתאים במשך 24 שעות וחשב את כדאיות התא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 2.4.2 ו- 2.4.3.
- הערכת ההשפעה המגנה של שני שילובים אופטימליים על תאי PC12 פצועים
הערה: לאחר קבלת שילוב ההכנה האופטימלי (הזרקת Ast: כמוסה Eri של 6: 1.8 μM) ואת שילוב הרכיבים האופטימלי7 (10 מיקרומטר astragaloside A, 40 μM scutellarin, ו 75 μM חומצה כלורוגנית), הערכה נוספת מבוצעת כדי לבדוק את ההשפעות המגינות שלהם על תאי PC12 פצועים.- תרבית את התאים כמתואר לעיל בשלב 2.3.1, וטפל בתאי PC12 הפגועים בשני סוגי שילובי התרופות כפי שנדון בהערה לעיל.
- טפל בתאים במשך 24 שעות וחשב את כדאיות התא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 2.4.2 ו- 2.4.3.
3. בדיקת Annexin V-FITC/PI לשיעור אפופטוזיס
- זרעו את תאי PC12 בצלחת של 12 בארות בריכוז של 1.3 x 105 תאים / באר ותרביתו אותם ב 37 ° C במשך 24 שעות.
- קבץ את התאים: קבוצת ביקורת, קבוצת מודל ושני שילובים של תרופות. הוסף 1.2 מ"ל/באר של מדיום שלם לקבוצת הביקורת, הוסף 1.2 מ"ל/באר של מדיה המכילה 0.4 mM CoCl 2 לקבוצת הדגמים, והוסף 1.2 מ"ל/באר מכל אחד משני הצירופים המכילים 0.4 mM CoCl2. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 24 שעות נוספות.
- לאחר הטיפול התרופתי, יש לטפל בתאים עם 250 מיקרוליטר/באר טריפסין, להעביר את התאים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ובצנטריפוגה ב-840 xg למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ הקשירה.
- לדגור על התאים בחושך עם 5 μL של Annexin V-FITC ו 10 μL של יודיד פרופידיום (PI) במשך 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לבדוק אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה. הגדר שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה.
הערה: הטריפסין המשמש בבדיקה זו אינו יכול להכיל EDTA מכיוון ש- EDTA הוא חומר כלאט יונים מתכתי המתחרה עם נספחין V לקשירת יוני סידן ומשפיע על הזיקה של אנקסין ל- PI. כאשר אפופטוזיס מתרחש, פוספוסרין, במקור בצד הפנימי של קרום התא, פונה החוצה אל פני התא, ו Annexin V-FITC נקשר באופן סלקטיבי פוספוסרין מחוץ לממברנה כדי להראות פלואורסצנטיות ירוקה. - לחץ על פיצוי אוטומטי בתפריט התחלה, בחר FITC , PE , PerCP ו- APC בערוץ בחר ובחר פיצוי ב: גובה. לחץ על אישור בפריט סטטיסטי: חציון. עם אותה שיטת ספירת תאים המוזכרת בשלב 2.3.2, אסוף את דגימות התא, לחץ על מפת הצפיפות והקף בעיגול את אוכלוסיית התאים האפקטיבית.
- עם פלואורסצנטיות FITC כפרמטר ציר X, ופרמטרים פלואורסצנטיים אחרים כפרמטר ציר Y, צור מפת צפיפות. לחץ על מטריצת פיצוי בתפריט התחלה ומקדם במטריצת הגלישה. מידע מפת הצפיפות מוצג לניתוח קצב האפופטוזיס.
- לדגור על התאים בחושך עם 5 μL של Annexin V-FITC ו 10 μL של יודיד פרופידיום (PI) במשך 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לבדוק אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה. הגדר שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה.
4. זיהוי אימונופלואורסנציה של דור קספאז-3
- זרעו את תאי PC12 על כיסויים בצפיפות של 8 x 104 תאים/כיסויים והניחו אותם בצלחות של 24 בארות בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות. קבץ את התאים כפי שהוזכר לעיל בשלב 3.2; הגדר שלוש כיסויים משוכפלים עבור כל קבוצה.
- לאחר טיפול תרופתי, שטפו את הכיסויים פעמיים עם PBS (37°C) במשך 5 דקות כל אחד, תקנו אותם עם 4% פרפורמאלדהיד למשך 15 דקות, וחדרו עם 0.5% Triton X-100 למשך 20 דקות ב-RT.
- שטפו שוב את התאים וחסמו אותם עם 10% סרום עיזים למשך שעה אחת ב-RT.
- יש לדגור על כל מכסה ב-200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני קספאז-3 (חלבון מפתח של אפופטוזיס) מדולל בריכוז של 1:250 ב-1x TBST, למשך הלילה ב-4°C. יש לשטוף עם 1x TBST (שלוש פעמים למשך 3 דקות כל אחת), ולדגור עם 200 μL של נוגדן משני (דילול 1:300 ב-1x TBST) למשך שעה אחת ב-RT בחושך.
הערה: הפלואורסצנטיות מרוותה בקלות; לכן, לאחר הדגירה של הנוגדן המשני, שקופיות צריך להיות נשמר הרחק אור. הנוגדנים הראשוניים והמשניים צריכים להיות מאוחסנים במרחק של 4 מעלות צלזיוס מהאור. - הוסף 300 μL של DAPI (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) לכיסויים (כדי לזהות את הגרעינים) למשך 10 דקות ושטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x TBST במשך 5 דקות כל אחד.
- התבוננו בכיסויים מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי וצלמו תמונות10. ביצוע ניתוח סטטיסטי של עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת ההדמיה.
הערה: המגלשות והכיסויים שבהם נעשה שימוש צריכים להיות נקיים וסטריליים. בעת הצביעה, שימו לב לרמת החומציות, הריכוז והטמפרטורה של תמיסת הצביעה, והימנעו מרוות פלואורסצנטית. יש להפעיל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי לפחות 15 דקות מראש כדי לחמם מראש את מנורת הכספית ולכבות אותו למשך 30 דקות לפני שהוא מופעל שוב. בעת רכישת תמונות, פרמטרי החשיפה של אותו צבע באותה אצווה של ניסויים צריכים להיות עקביים כדי להבטיח את דיוק התוצאות.
5. בדיקת אימונופלואורסנציה של רמת ROS
- תרבית וטיפול בתאים כפי שנדון בשלב 4.1.
- לאחר הטיפול התרופתי, יש לשטוף כל כיסוי שלוש פעמים עם PBS למשך 3 דקות, ולדגור עם 400 μL של DCFH-DA (10 μM) בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות.
הערה: DCFH-DA הוא אינדיקטור אוניברסלי לעקה חמצונית. יש לו חדירות קרום התא ולא פלואורסצנטיות. ברגע שהוא נכנס לתא, הוא עובר הידרוליזה על ידי אסטראז כדי לייצר 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) ולאחר מכן מחומצן במהירות כדי לייצר מוצר פלואורסצנטי חזק. - שטפו שוב את התאים עם DMEM ללא סרום (פעמיים למשך 3 דקות כל אחד) ומיד התבוננו בכיסוי לאחר הוספת חומר מרווה פלואורסצנטי מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי. חשב את עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית על ידי תוכנת ההדמיה.
הערה: לאחר טעינת הבדיקה DCFH-DA, הקפד לנקות את הבדיקה השיורית שאינה נכנסת לתא, אחרת הרקע יהפוך גבוה.
6. זיהוי כתם מערבי של ביטוי חלבונים של Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 ו-Bax11,12
- חסן תאי PC12 בצלחות 6 בארות בריכוז של 1 x 106 תאים / באר ותרבית ב 37 ° C במשך 24 שעות. קבץ וטפל בתאים כאמור בשלב 4.1, והגדר שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה.
- לאחר טיפול תרופתי במשך 24 שעות, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ודגרו על קרח במשך 30 דקות במאגר ליזיס מוכן. לאחר הליזה, צנטריפוגו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 16,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנאטנטים.
- זהה את ריכוז החלבון והתאם בהתאם להוראות באמצעות בדיקת ברדפורד. לדלל את הדגימות ו denature ב 100 ° C במשך 10 דקות.
הערה: מאגר הליזה מורכב ממעכב פוספטאז, מעכב פרוטאז ו-RIPA lysate ביחס נפח של 1:1:50. בקבוצת הביקורת, נדרשים 200 μL/well של חיץ ליזיס, ו-100 μL/well של חיץ ליזיס נדרשים בקבוצות האחרות. באופן כללי, ריכוזי החלבונים של קבוצת הבקרה, המודל ושני סוגים של שילובים הם 0.45 מ"ג/מ"ל, 0.25 מ"ג/מ"ל ו-0.32-0.39 מ"ג/מ"ל בהתאמה; ריכוזי החלבון שלהם לאחר דילול עם מאגר ההעמסה הם 0.36, 0.2 ו-0.256-0.312 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. - כדי לזהות חלבונים בעלי משקלים מולקולריים שונים, יש לטעון 25 מיקרוגרם חלבון בכל נתיב, להריץ אלקטרופורזה SDS-PAGE של 12% ולהעביר את הג'ל לממברנות PVDF.
הערה: במהלך הכנת ג'ל SDS, יש לערבב אותו באופן מלא ללא בועות או חלקיקים בלתי מסיסים; אחרת, עלולים להתרחש פסים לא אחידים או לא סדירים. בעת העברת הממברנות, ודא שאין בועות בין קרום PVDF לבין הג'ל; אחרת, יופיעו כתמים לבנים ברצועה. בנוסף, שלב זה חייב להתבצע בטמפרטורות נמוכות, ואת שקית הקרח צריך להיות שונה כל 30 דקות. - חסום את הממברנות עם חלב 5% ללא שומן למשך 1.5 שעות ב- RT ודגור עם 5 מ"ל של הנוגדנים הראשוניים המתאימים (Nrf2 1:1,000, Akt 1:2,000, p-Akt 1:2,000, Bcl-2 1:5,000 ו- Bax 1:1,000) למשך 24 שעות ב- 4 ° C. השתמש בנוגדן β-אקטין (1:5,000) כבקרה פנימית.
- שטפו את הממברנות עם TBST (שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת), ואז דגרו עם 5 מ"ל של נוגדנים מצומדים משניים מסוג HPR (1:5,000) ב-RT למשך שעתיים.
הערה: אין לשנות באופן שרירותי את יחס הדילול של הנוגדנים, ויש לשטוף את הממברנות ב-TBST במידה מספקת בהתאם לדרישות כדי למנוע שצבע הרקע של הרצועה יהיה שחור מדי. - לבסוף, שטפו שוב את הממברנה עם TBST, וטפלו בה עם מצע HRP כימילומינסנטי (בהתאם להוראות היצרן) לזיהוי רצועת החלבון. צלם את התמונות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה וכמת את ערכי האפור של החלבונים באמצעות תוכנת ההדמיה, עם β-אקטין כבקרה פנימית השוואתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדיקת השילוב האופטימלי של הזרקת Ast וקפסולת Eri מוצגת באיור 1. שיעור הישרדות התאים של הזרקת Ast וכמוסת Eri על תאי PC12 רגילים מוצג באיור 1A. כדאיות התא הייתה נמוכה מ-95% עם הזרקת Ast בריכוזים גדולים מ-12 מיקרומטר (איור 1A) וקפסולת Eri בריכוזים גדולים מ-5 מיקרומטר (איור 1A), מה שמצביע על כך שהריכוז הלא-רעיל המרבי היה 12 מיקרומטר ו-5 מיקרומטר, בהתאמה. ציטוטוקסיות שלהם הייתה גדולה יותר מזו של אסטרגלוסיד A וסקוטלרין ששימשו לבדם. הכדאיות של הזרקת Ast וקפסולת Eri על תאי PC12 הפגועים המושרים על-ידי CoCl2 מוצגת באיור 1B,C. בהשוואה לקבוצת המודל, הזרקת Ast יכולה לשפר את שיעור ההישרדות של תאי PC12 הפגועים בטווח ריכוז של 6-12 מיקרומטר (p < 0.05 או p < 0.01 ), וכמוסות Eri בריכוז של 2-5 מיקרומטר יכולות לשפר את שיעור ההישרדות (p < 0.05 או p < 0.01). הזרקת Ast וקפסולת Eri ביחס של 10:1, 8:4.2 ו-6:1.8 מיקרומטר יכולות להגדיל באופן משמעותי את הכדאיות של תאי PC12 הפצועים (p < 0.01) (איור 1D). היחס של 6:1.8 מיקרומטר הציג את הכדאיות התאית הגבוהה ביותר, מה שמצביע על כך שזהו שילוב ההכנה והפעילות הפרמקולוגית האופטימלית בהשוואה לשילוב הרכיבים הטוב ביותר.
הערכת ההשפעות המגינות של שני סוגים של שילוב על תאי PC12 הפגועים מוצגת באיור 2. בהשוואה לקבוצת המודל, יכולת הקיום של שני הצירופים קודמה באופן משמעותי (p < 0.001), ושילוב הרכיבים היה עדיף על שילוב ההכנה (איור 2A). זה מצביע על כך ששילוב הרכיבים יכול לקדם את הישרדות התאים טוב יותר משילוב ההכנה. קצב האפופטוזיס נבדק על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 2B,C). בהשוואה לקבוצה הנורמלית, האחוזים של תאים אפופטוטיים מוקדמים, מאוחרים וסך הכל היו גבוהים משמעותית בקבוצת המודל (p < 0.01 או p < 0.001). בהשוואה לקבוצת המודל, אחוזי התאים האפופטוטיים בכל שלב היו נמוכים משמעותית בקבוצות הטיפול (p < 0.05 או p < 0.01, או p < 0.001). עוצמת הפלואורסצנטיות של ביטוי חלבון קספאז-3 בכל קבוצה מוצגת באיור 2D,E. בהשוואה לקבוצה הרגילה, עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 הייתה גבוהה משמעותית בקבוצת המודל. בהשוואה לקבוצת המודל, עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 הייתה נמוכה משמעותית בכל קבוצת טיפול (p < 0.001 או p < 0.01) והייתה נמוכה יחסית בקבוצת שילוב המרכיבים מאשר בקבוצת שילוב ההכנה. תוצאות אלה מצביעות על כך שמודל התא יכול לגרום לאפופטוזיס, ואפקט האנטי-אפופטוזיס של שילוב הרכיבים טוב יותר מזה של שילוב ההכנה.
כתם מערבי זיהה את ביטוי החלבון p-Akt, Akt, Bcl-2 ו-Bax (איור 3). בהשוואה לקבוצה הנורמלית, רמות הביטוי של p-Akt/Akt ו-Bcl-2/Bax היו נמוכות משמעותית בקבוצת המודל (p < 0.01 או p < 0.001). בהשוואה לקבוצת המודלים, הביטוי של p-Akt/Akt ו-Bcl-2/Bax היה גבוה משמעותית בשני הצירופים (p < 0.05 או p < 0.01, או p < 0.001), במיוחד גבוה יותר בשילוב הרכיבים. התוצאות מצביעות על כך ששילוב הרכיבים עדיף על שילוב ההכנה בקידום הישרדות התא, הקשור לאפקט האנטי-אפופטוזיס החזק יותר המיוצר על ידי ויסות מסלול האות Akt/Bcl-2/Bax.
הפלואורסצנטיות של DCFH יכולה להימדד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את רמת ה-ROS בתאים (איור 4A,B). כפי שניתן לראות באיור 4A, הפלואורסצנטיות הייתה כמעט בלתי נראית בתאים הנורמליים, והפלואורסצנטיות בקבוצת המודל השתפרה באופן משמעותי. הפלואורסצנטיות בשני השילובים הופחתה משמעותית בהשוואה לקבוצת הדגמים. כפי שניתן לראות באיור 4B, עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית הייתה חלשה משמעותית בכל קבוצת טיפול בהשוואה לקבוצת המודל (p < 0.001). לפלואורסצנטיות הייתה נטייה לרדת בקבוצת שילוב המרכיבים בהשוואה לקבוצת שילוב ההכנה, מה שמצביע על כך שמודל התא יכול לגרום לנזק חמצוני. השפעת הנזק האנטי חמצוני של שילוב הרכיבים טובה יותר מזו של שילוב ההכנה.
כתם מערבי זיהה את הביטוי של חלבון Nrf2 (איור 4C). בהשוואה לקבוצה הנורמלית, הביטוי של Nrf2 הופחת באופן משמעותי בקבוצת המודל (p < 0.05). בהשוואה לקבוצת המודל, הביטוי של חלבון Nrf2 היה גבוה יותר באופן מובהק בקבוצות הטיפול (p < 0.01 או p < 0.05), במיוחד גבוה יותר בקבוצת שילוב המרכיבים (איור 4D). זה מצביע על כך ששילוב הרכיבים טוב יותר משילוב ההכנה בקידום הישרדות התא, הקשור לנזק האנטי-חמצוני החזק יותר המיוצר על ידי ויסות מסלול האות Nrf2.
לסיכום, שילוב הרכיבים (10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין ו-75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית) יכול לקדם את הישרדותם של תאים פגועים טוב יותר משילוב ההכנה (הזרקת 6 מיקרומטר Ast ו-1.8 מיקרומטר כמוסת ארי) באמצעות ויסות חזק יותר של מסלולי אותות הקשורים לאפופטוזיס ונזק חמצוני.
התוכנה הסטטיסטית SPSS 26.0 שימשה לניתוח סטטיסטי, וכל הנתונים מבוטאים כאמצעי ± סטיית תקן (SD). לצורך השוואות בין קבוצות, הנתונים הוערכו על ידי ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן של Tukey. P < 0.05 נחשב כמצביע על הבדל מובהק סטטיסטית.
איור 1: השפעות של תרופות על יכולת הקיום של תאי PC12 נורמליים ופגועים. (A) השפעות של ריכוזים שונים של הזרקת Ast וריכוזים שונים של קפסולת Eri על תאי PC12 נורמליים. (B) בדיקת הריכוז האפקטיבי של הזרקת Ast על תאי PC12 פגועים. (C) בדיקת הריכוז האפקטיבי של קפסולת Eri על תאי PC12 פגועים. (D) השפעות שילובים של שתי תרופות בפרופורציות שונות על שיעור ההישרדות של תאי PC12 פגועים. ערכים סטטיסטיים מבוטאים כממוצע ± SD משישה ניסויים עצמאיים. &p < 0.01 בהשוואה לקבוצת הביקורת. *P < 0.05 ו- **P < 0.01 בהשוואה לקבוצת הדגמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השפעות של שני שילובים על הישרדות ואפופטוזיס של תאי PC12 פגועים. (A) השפעת שילוב הרכיבים ושילוב ההכנה על שיעור ההישרדות של תאי PC12 פגועים. (B) גרף של שיעור אפופטוזיס שזוהה על ידי Annexin V-PI. (C) היסטוגרמה סטטיסטית של קצב אפופטוזיס. (D) עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית של ביטוי חלבון קספאז-3 (400x). פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (E) היסטוגרמה סטטיסטית של עוצמת הפלואורסצנטיות של ביטוי חלבון קספאז-3. ערכים סטטיסטיים מבוטאים כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים, למעט כדאיות התא עבור שישה ניסויים עצמאיים. *p < 0.05, **p < 0.01 ו- ***p < 0.001 בהשוואה לקבוצת הדגמים. ##p < 0.01 בהשוואה לקבוצת שילוב ההכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעות של שני הצירופים על רמות הביטוי של p-Akt, Akt, Bcl-2 ו-Bax. (A) ביטוי חלבונים של p-Akt ו-Akt שנקבע על-ידי ניתוח כתמים מערביים. (B) היסטוגרמה סטטיסטית של סטטיסטיקות יחס p-Akt/Akt בכל קבוצה. (C) ביטוי חלבונים של Bcl-2 ו-Bax שנקבע על ידי ניתוח כתמים מערביים. (D) היסטוגרמה סטטיסטית של יחס Bcl-2/Bax בכל קבוצה. ערכים סטטיסטיים מבוטאים כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים. *p < 0.05, **p < 0.01 ו- ***p < 0.001 בהשוואה לקבוצת הדגמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ההשפעה של שני שילובים על ביטוי החלבון Nrf2 ורמות ROS. (A) רמות ROS זוהו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (400x). פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) היסטוגרמה סטטיסטית של עוצמת הפלואורסצנטיות של ROS בכל קבוצה. (C) ביטוי חלבון Nrf2 נקבע על ידי ניתוח כתמים מערביים. (D) היסטוגרמה סטטיסטית של ביטוי חלבון Nrf2. ערכים סטטיסטיים מבוטאים כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים. *p < 0.05, **p < 0.01 ו- ***p < 0.001 בהשוואה לקבוצת הדגמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עדיין חסרות תרופות אידיאליות לטיפול באיסכמיה מוחית בפרקטיקה הקלינית המודרנית2. בהנחיית תוספת צ'י והפעלת שיטת זרימת הדם, אסט, ארי ותכשירים אחרים שימשו בשילוב בפרקטיקה הקלינית של TCM והשיגו יתרונות מקיפים טובים13,14,15. מספר רב של מחקרים הראו כי Ast יכול לשפר את החדירות של מחסום הדם-מוח, להגביר את זרימת הדם במוח, לשפר את יכולתם של תאי עצב לסבול היפוקסיה ולהתנגד נזק רדיקלים חופשיים חמצן, והוא יכול לשפר באופן משמעותי תפקוד נוירולוגי16,17. זה מתאים במיוחד עבור מחלת כלי דם איסכמית סנילית16,17. Eri יכול להרחיב את כלי הדם, להגביר את אספקת הדם למוח, להסיר ROS, ולהפחית חמצון שומנים18,19. עם זאת, ההשפעה הסינרגיסטית, המרכיבים הפרמקודינמיים ומנגנון השילוב של שתי התרופות עדיין אינם ברורים, וזו בעיה נפוצה המגבילה את היישום הקליני של TCM.
הסביבה האיסכמית וההיפוקסית של איסכמיה מוחית כרונית גורמת לנזק לעקה חמצונית, ובו זמנית, מפעילה את מסלול איתות האפופטוזיס של תאי המוח כדי לקדם אפופטוזיס עצבי20,21. מסלול PI3K/Akt הוא מסלול העברת אותות אנטי-אפופטוטי ופרו-הישרדותיקלאסי 22,23, ביניהם חלבונים ממשפחת Bcl-2 ומשפחת הקספז הם החלבונים המנהלים במורד הזרם של מסלול אות זה. Akt פוספורילציה יכול לווסת במישרין או בעקיפין את משפחת Bcl-2 ולעכב את ההפעלה של המסלול במורד הזרם קספאז-3, ובכך להפעיל אפקט אנטי-אפופטוטי11. בנוסף, עודף ROS שנוצר על ידי היפוקסיה יכול לגרום לפציעה בעקה חמצונית, בעוד Akt פוספורילציה יכול להפעיל Nrf2 כדי לחסל עודף ROS כדי להילחם בנזקי עקה חמצונית12,24. לכן, הפעלה של מסלול PI3K/Akt/Nrf2 יכולה למנוע ולשלוט ביעילות בעקה חמצונית ובאפופטוזיס, ובכך להפחית פגיעה מוחית היפוקסית-איסכמית25,26.
במחקר, שילוב ההכנה הוקרן באמצעות מודל תאי PC12 הפגוע, וההשפעה והמנגנון במודל זה הושוו לשילוב הרכיבים שהוקרן קודם לכן7. בנוסף, הריכוז הלא רעיל המרבי של הזרקת Ast וקפסולה Eri הוא 12 μM (מחושב על ידי astragaloside A) ו 5 μM (מחושב על ידי scutellarin), בהתאמה, בעוד הריכוז הלא רעיל המרבי של astragaloside A ו scutellarin הוא 20 μM ו 50 μM, בהתאמה7. זה מראה כי שילוב הרכיבים בטוח יותר משילוב ההכנה, עם איכות נשלטת יותר ויתרונות מקיפים של יעילות גבוהה ורעילות נמוכה.
המודלים התאיים הנוכחיים שניתן להשתמש בהם כדי לדמות איסכמיה מוחית כוללים בעיקר היפוקסיה פיזית (המושרה על ידי OGD) והיפוקסיה כימית (המושרה על ידי Na 2 S 2 O4 אוCoCl2)27. ביניהם, הן OGD והן Na 2 S2O4 פציעותיש זמן היפוקסיה קצר ואינם מתאימים להדמיית איסכמיה כרונית27. CoCl 2-induced hypoxia הוא אחד מחיקויי ההיפוקסיה הנפוצים ביותר בהשוואה ל- OGD והשימוש בחיקויי היפוקסיה אחרים. זה יכול להוביל לנזק חמצוני מתמשך ויציב על ידי ROS ולייצר שינויים אפופטוטיים טיפוסיים בשורות תאים שונות27. לכן, במחקר זה, CoCl2 שימש במשך 24 שעות כדי לדמות את היפוקסיה עצבית28,29. נבדקו ריכוז המידול שלו (0.1, 0.2, 0.4 ו-0.8 מילימול) ותקופת התוקף (1 ו-7 ימים). בנוסף, בהתחשב בחוסר הבלתי נמנע של גלוקוז וחמצן לאחר איסכמיה מוחית, הסביבה ללא גלוקוז והיפוקסי יכולה לדמות טוב יותר פגיעה איסכמית מוחית. מחקר זה הראה כי 0.4 mM CoCl2 בשילוב עם מדיום ללא גלוקוז במשך 24 שעות יכול לבסס מודל תאים היפוקסי כרוני יציב וניתן לשליטה. במחקר ההמשך, המודל החייתי של איסכמיה מוחית כרונית ישמש כדי לאמת עוד יותר את היתרונות הטיפוליים של שילוב המרכיבים in vivo.
מודל התא הזה יכול להגביר את קצב האפופטוזיס, את עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 ואת רמת ה-ROS התוך-תאית (איור 2 ואיור 4), מה שיכול לדמות טוב יותר את השינויים הפתולוגיים של איסכמיה מוחית כרונית, כמו אפופטוזיס, עקה חמצונית וכו'. בהתבסס על מודל זה, נמצא כי שני סוגי השילובים יכולים לעכב אפופטוזיס ונזקי עקה חמצונית. ההשפעה של שילוב הרכיבים על קידום הישרדות התאים הייתה טובה משמעותית מזו של שילוב ההכנה (איור 1); שני הצירופים יכולים לווסת את רמות הביטוי של P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax ו-Nrf2 בדרגות שונות (איור 3 ואיור 4). בפרט, לשילוב הרכיבים הייתה השפעה חזקה יותר על ויסות המעלה של מסלול האיתות Akt/Bcl-2/Bax ו-Nrf2. תוצאות אלה מצביעות על כך ששילוב הרכיבים יכול להתנגד טוב יותר לנזק לתאים מאשר שילוב ההכנה, הקשור לאנטי-אפופטוזיס חזק יותר ועקה אנטי-חמצונית.
לסיכום, תוצאות אלה מספקות אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 פצועים ומספקות רעיון חדש להערכה ואופטימיזציה של מצב היישום המשולב של שני צמחי מרפא. בסך הכל, מחקר זה מספק התייחסות לבחירת שילוב הרכיבים הפעילים של TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי פרויקטי מו"פ מרכזיים של המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
