Summary
Questo protocollo fornisce una strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 ferite. Il protocollo fornisce un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di applicazione della medicina tradizionale cinese (MTC).
Abstract
In considerazione dei vantaggi della combinazione della medicina tradizionale cinese (MTC) nel trattamento dell'ischemia cerebrale, abbiamo studiato le differenze nell'efficacia e nel meccanismo tra la combinazione di preparazione e la combinazione di componenti al fine di esplorare la strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 danneggiate. Il cloruro di cobalto (CoCl2) combinato con un mezzo privo di glucosio è stato impiegato per indurre il danno ossidativo delle cellule PC12. Quindi, la combinazione ottimale di iniezione di Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) è stata selezionata e combinata seguendo metodi di progettazione uniformi dopo aver esaminato la loro concentrazione sicura ed efficace sulle cellule PC12. Inoltre, la combinazione di componenti esaminata comprende 10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico in due erbe. Quindi, MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescenza e analisi Western blot sono stati utilizzati per valutare l'efficacia e il meccanismo della combinazione di preparazione e della combinazione di componenti su cellule PC12 danneggiate. I risultati hanno mostrato che la combinazione di preparazione ottimale per la pro-sopravvivenza cellulare era l'iniezione di Ast e la capsula di Eri con una concentrazione di 6:1,8 (μM). La combinazione di componenti (10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico) è risultata più efficace della combinazione di preparazione. Entrambe le combinazioni hanno notevolmente ridotto la velocità apoptotica, l'intensità di fluorescenza della caspasi-3 e il livello intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS); nel frattempo, hanno sovraregolato i livelli di espressione di p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax e Nrf2. Questi effetti erano più evidenti nella combinazione di componenti. In conclusione, entrambe le combinazioni possono inibire la lesione indotta da CoCl2 combinata con un mezzo privo di glucosio sulle cellule PC12, promuovendo così la sopravvivenza cellulare. Tuttavia, l'efficienza della combinazione di componenti rispetto alla combinazione di preparazione può essere dovuta alla sua più forte regolazione della via di segnalazione PI3K / Akt / Nrf2 correlata allo stress ossidativo e all'apoptosi.
Introduction
L'ischemia cerebrale cronica, causata da ipoperfusione cerebrale, è una malattia comune nelle persone di mezza età e negli anziani1. Come una malattia da ischemia occulta a lungo termine, può portare a disfunzione neurologica progressiva o persistente. I principali meccanismi patologici includono l'apoptosi cellulare e il danno ossidativo, che portano a disfunzioni neurologiche progressive o persistenti; questa è la base patologica della malattia di Alzheimer, della demenza vascolare e di altre malattie e influisce seriamente sulla qualità della vita dei pazienti. Tuttavia, c'è ancora una mancanza di farmaci ideali nella medicina moderna per trattare l'ischemia cerebrale cronica2. Allo stesso tempo, la combinazione di Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) è stata ampiamente utilizzata nella pratica clinica della medicina tradizionale cinese (MTC)4. La strategia di combinazione è notevolmente migliorata nel promuovere il recupero della funzione nervosa dopo ischemia cerebrale, che è migliore di quella di un singolo farmaco; Tuttavia, ci sono grandi differenze nel rapporto di dosaggio nella combinazione dei due farmaci4. Le componenti efficaci e il meccanismo d'azione non sono ben definiti, che è il problema chiave che limita la sua applicazione clinica.
Studi precedenti hanno dimostrato l'effetto sinergico della combinazione di preparazione di iniezione di Ast e iniezione di Eri nel trattamento dell'ischemia cerebrale nei ratti. Può sovraregolare l'espressione della proteina p-Akt e downregolare l'espressionedella proteina 5,6 del promotore di morte associato a Bcl-2 (BAD), che è una delle proteine della famiglia del linfoblastoma B 2 (Bcl-2) e ha l'effetto di promuovere l'apoptosi. Tuttavia, la base materiale e il meccanismo del suo effetto sinergico non sono chiari. Inoltre, il modello di lesione delle cellule PC12 è stato stabilito con terreno combinato privo di glucosio CoCl2 e la combinazione ottimale di componenti in Ast ed Eri è stata esaminata e definita7.
In questo studio, le dosi efficaci di Ast ed Eri sono sottoposte a screening utilizzando il modello cellulare PC12 danneggiato. La combinazione ottimale dei due farmaci viene esaminata utilizzando questo modello combinato con il metodo di progettazione omogeneo. Il modello cellulare viene utilizzato per valutare ulteriormente la differenza negli effetti e nei meccanismi della combinazione di preparazione e della combinazione di componenti nelle cellule PC12 danneggiate. Questa strategia mira a esplorare l'effetto protettivo e il meccanismo regolatore dei due tipi di combinazioni su cellule PC12 danneggiate attraverso la via del segnale PI3K / Akt / Nrf2 per determinare la migliore modalità di combinazione. Questo studio fornisce un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di applicazione della MTC.
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Protocol
1. Preparazione del reagente
- Preparare il terreno completo aggiungendo 90 ml di terreno ad alto contenuto di zucchero DMEM, 10 ml di siero bovino fetale (FBS) e 1 ml di soluzione di penicillina-streptomicina in un matraccio di coltura sterile da 125 ml. Miscelare il mezzo completo e conservare a 4 °C in condizioni chiuse.
- Preparare la soluzione di CoCl 2 aggiungendo 0,02 g di polvere di CoCl2 (accuratamente pesata) in 10 ml di terreno senza zucchero DMEM (completamente sciolto) per ottenere una soluzione madre da 8,4 mM. Filtrare la soluzione con un filtro batterico da 0,22 μm, sigillarla e conservarla a 4 °C di distanza dalla luce.
NOTA: CoCl2 è instabile e deve essere conservato in un contenitore ermetico, al riparo dalla luce; il periodo di validità della soluzione CoCl2 è di 7 giorni. - Preparare la soluzione salina tamponata Tris-Hcl (TBST).
- Pesare accuratamente 8 g di cloruro di sodio, 0,2 g di cloruro di potassio e 3 g di Tris-base. Aggiungerli in un becher da 1 L, quindi aggiungere 1.000 ml di acqua RO per sciogliere la miscela.
- Regolare il pH a 7,4, aggiungere 1 mL di Tween 20 e mescolare accuratamente per ottenere la soluzione TBST.
NOTA: Tween 20 agisce come tensioattivo per ridurre il legame non specifico degli anticorpi agli antigeni e funziona meglio a una concentrazione dello 0,1%.
- Preparare la soluzione di MTT (sale di bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazolio) pesando 0,1 g di polvere di MTT in 20 mL di soluzione PBS per ottenere una soluzione madre da 5 mg/ml. Filtrare la soluzione con un filtro batterico da 0,22 μm, sigillarla e conservarla a 4 °C di distanza dalla luce, posta in standby.
NOTA: la polvere MTT è instabile e assorbe facilmente l'umidità, quindi deve essere conservata in un luogo chiuso e asciutto al riparo dalla luce. La soluzione MTT scade dopo 7 giorni. MTT ha un effetto cancerogeno, quindi evitare il contatto diretto con la pelle. - Preparare la soluzione di capsule Eri rimuovendo l'involucro della capsula e pesando accuratamente 0,18 g del contenuto in 10 ml di terreno senza zucchero DMEM per preparare una soluzione madre da 100 μM (basata sulla concentrazione di scutellrina). Filtrare la soluzione con un filtro antibatterico da 0,2 μm, sigillarla e conservarla in un contenitore ermetico a 4 °C.
NOTA: La scutellarina è il principale ingrediente attivo di Erigeron breviscapus. La concentrazione di scutellarina nelle capsule è stata determinata mediante HPLC-UV in 2,56 mg/g, cioè 5,54 μmol/g8. La concentrazione del preparato è calcolata in base alla concentrazione di scutellarina. Questo è conveniente per valutare l'attività farmacologica del preparato e del componente. - Preparare la soluzione dell'iniezione Ast aggiungendo 5 ml di iniezione e 5 ml di media DMEM senza zucchero in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL per preparare una soluzione madre da 60 μM (basata sulla concentrazione di astragaloside A). Filtrare la soluzione attraverso un filtro batterico da 0,2 μm e conservarla in un contenitore ermetico a 4 °C.
NOTA: Il volume di iniezione è di 10 ml ciascuno e la concentrazione di astragaloside A nell'iniezione è stata determinata mediante HPLC-ELSD in 0,094 mg/ml (cioè 120 μM)9. La preparazione deve essere effettuata in un armadio di biosicurezza e utilizzata in modo a prova di luce in tutto. Il volume della soluzione iniettabile e del mezzo senza zucchero deve essere misurato accuratamente e miscelato bene. - Preparare la soluzione di astragaloside A pesando accuratamente 7,85 mg di astragaloside A standard e sciogliendola completamente in 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per preparare una soluzione madre da 5.000 μM. Filtrarlo con un filtro antibatterico da 0,22 μm e conservarlo ermeticamente a 4 °C.
NOTA: La polvere di astragaloside A è insolubile nel mezzo senza zucchero. Quando si prepara la soluzione, scioglierla con la quantità appropriata di DMSO per mantenere la concentrazione sperimentale finale di DMSO al di sotto dello 0,1% per garantire l'assenza di citotossicità. - Preparare la soluzione di scutellarin pesando accuratamente 11,56 mg di scutellarin standard e sciogliendola completamente con 5 ml di terreno DMEM senza zucchero per preparare una soluzione madre da 5.000 μM. Filtrarlo con un filtro antibatterico da 0,22 μm e conservarlo ermeticamente a 4 °C.
- Preparare la soluzione di acido clorogenico pesando 8,86 mg di acido clorogenico standard accuratamente e sciogliendola completamente con 5 ml di terreno DMEM senza zucchero per preparare una soluzione madre da 5.000 μM. Filtrarlo con un filtro antibatterico da 0,22 μm e conservarlo ermeticamente a 4 °C.
NOTA: La polvere di acido clorogenico è instabile e assorbe facilmente l'acqua. Deve essere sigillato e conservato a 4 °C al riparo dalla luce; Il tempo di esposizione deve essere ridotto al minimo durante la pesatura.
2. Saggio di vitalità cellulare
- Ottenere cellule PC12 e coltivarle in DMEM integrato con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina.
NOTA: In questo studio, le cellule sono ottenute dall'Accademia cinese delle scienze. Le cellule PC12 sono cellule aderenti che hanno le caratteristiche generali delle cellule neuroendocrine e sono ampiamente utilizzate in neurofisiologia e neurofarmacologia. - Coltura delle cellule a 37 °C in un incubatore integrato con il 5% di CO 2 e sottocoltura ogni2-3 giorni. Usa le celle nei passaggi 4-8 per tutti gli esperimenti.
- Coltura cellulare
- Trattare le cellule PC12 nella fase di crescita logaritmica (70%-80% di confluenza cellulare) con 1 mL di tripsina (0,25%) e osservare le cellule al microscopio. Quando le cellule diventano rotonde, interrompere la digestione della tripsina aggiungendo 3 ml del mezzo completo.
- Trasferire le cellule in una provetta sterile da centrifuga da 15 ml e centrifugare le cellule a 840 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante, risospendere con il mezzo completo e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi contare il numero di cellule utilizzando un citometro a flusso.
- Avviare il software di citometria a flusso, selezionare il multiplo di diluizione corrispondente della soluzione cellulare nell'impostazione di conteggio e fare clic su Grafico densità dopo aver caricato il campione di cella dalla provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Allontanare la popolazione di celle dall'asse X e dall'asse Y, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella dati sotto la figura e selezionare X, Y, Conteggio e Conteggio Abs. I dati in Conteggio Abs nella tabella dati forniscono il risultato del conteggio delle celle.
- Regolare la concentrazione cellulare a 1 x 10 5 cellule/ml, inoculare 100 μL/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e coltivare a 37 °C e5 % di CO2 in un incubatore per 24 ore.
- Screening di concentrazioni sicure di due farmaci su cellule PC12 normali
- Coltura delle cellule come descritto nei punti 2.1-2.2. Scartare il surnatante e trattare le cellule normali con diverse concentrazioni finali di iniezione Ast (4, 8, 12, 16, 20 e 24 μM) e capsula Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 μM). Trattare sei pozzetti replicati di ciascun gruppo per 24 ore.
NOTA: I farmaci vengono aggiunti al terreno per raggiungere la concentrazione finale del farmaco (menzionata nel punto 2.4.1), quindi viene aggiunto un volume uguale di mezzi a ciascun pozzetto. Quando si aspira il surnatante, la punta della pipetta deve essere posizionata delicatamente contro la parete del pozzetto per evitare di contattare le cellule sul fondo del pozzetto. Quando si aggiungono soluzioni diverse, aggiungerle delicatamente e rapidamente lungo i bordi dei pozzetti e prestare attenzione quando si cambia la testa della pistola per pipette per evitare di influenzare i risultati sperimentali. - Eliminare il surnatante, aggiungere 120 μL di soluzione MTT (1 mg/ml) in ciascun pozzetto e incubare le cellule per 4 ore a 37 °C.
- Dopo l'incubazione, scartare nuovamente il surnatante e aggiungere 150 μL di DMSO a ciascun pozzetto. Agitare la piastra per 10 minuti ad una velocità di 240 volte/min (numero di vibrazioni orizzontali al minuto) utilizzando un oscillatore a vortice.
- Misurare l'assorbanza di ciascun campione a 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Calcolare la vitalità cellulare (%), che è l'assorbanza del gruppo trattato/assorbanza del gruppo normale (controllo) x 100.
NOTA: assicurarsi che la soluzione MTT rientri nel periodo di validità; Se il colore è cambiato (in verde scuro), non può essere utilizzato. Quando si verifica l'assorbanza delle cellule, è necessario impostare un pozzetto bianco (terreno di coltura e MTT, senza cellule o farmaci) per eliminare l'interferenza di altri reagenti. Un volume di 150 μL di DMSO viene aggiunto a ciascun pozzetto e agitato per 10 minuti per sciogliere meglio i cristalli blu-viola. L'assorbanza deve essere rilevata il prima possibile per garantire l'accuratezza dei risultati.
- Coltura delle cellule come descritto nei punti 2.1-2.2. Scartare il surnatante e trattare le cellule normali con diverse concentrazioni finali di iniezione Ast (4, 8, 12, 16, 20 e 24 μM) e capsula Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 μM). Trattare sei pozzetti replicati di ciascun gruppo per 24 ore.
- Screening delle concentrazioni efficaci di due farmaci su cellule PC12 danneggiate
- Coltivare le cellule per 24 ore come indicato nei punti 2.1-2.2, scartare il surnatante e quindi trattare le cellule con 20 μL/pozzetto di CoCl2 (0,4 mM) combinato con il mezzo senza zucchero.
- Trattare contemporaneamente le cellule con 100 μL/pozzetto di iniezione Ast (le concentrazioni finali sono 2, 6, 8, 10 e 12 μM) o 100 μL di capsula Eri (le concentrazioni finali sono 1, 2, 3, 4 e 5 μM) a 37 °C per altre 24 ore. Aggiungere 120 μL/pozzetto di mezzo completo al gruppo di controllo.
NOTA: CoCl2 induce condizioni ipossiche nelle cellule. - Misurare l'assorbanza di ciascun campione con il metodo MTT e calcolare la vitalità cellulare come descritto in precedenza nelle fasi 2.4.2 e 2.4.3.
- Screening della combinazione ottimale di due farmaci basato sul metodo di progettazione omogenea
NOTA: Dopo aver ottenuto l'intervallo di concentrazione efficace dell'iniezione di astragalo e della capsula di breviscapus, è stato utilizzato il metodo di progettazione uniforme U 7 (7 4) tabella per ottenere sei diverse combinazioni dei due farmaci. Iniezione Ast:Eri capsula: 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM e 6)12:3,4 μM.- Coltivare le cellule come descritto sopra al punto 2.3.1 e trattare le cellule PC12 danneggiate con sei concentrazioni proporzionali di Ast iniettabile:Eri capsula come menzionato sopra.
- Trattare le cellule per 24 ore e calcolare la vitalità cellulare come descritto in precedenza nei punti 2.4.2 e 2.4.3.
- Valutazione dell'effetto protettivo di due combinazioni ottimali su cellule PC12 lese
NOTA: Dopo aver ottenuto la combinazione di preparazione ottimale (iniezione Ast:capsula Eri di 6:1,8 μM) e la combinazione ottimale di componenti7 (10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico), viene eseguita un'ulteriore valutazione per verificare i loro effetti protettivi sulle cellule PC12 danneggiate.- Coltivare le cellule come descritto sopra nella fase 2.3.1 e trattare le cellule PC12 danneggiate con i due tipi di combinazioni di farmaci come discusso nella NOTA sopra.
- Trattare le cellule per 24 ore e calcolare la vitalità cellulare come descritto in precedenza nei punti 2.4.2 e 2.4.3.
3. Saggio dell'annessina V-FITC/PI per il tasso di apoptosi
- Seminare le cellule PC12 in una piastra a 12 pozzetti ad una concentrazione di 1,3 x 105 cellule/pozzetto e coltivarle a 37 °C per 24 ore.
- Raggruppa le cellule: gruppo di controllo, gruppo modello e due combinazioni di farmaci. Aggiungere 1,2 mL/pozzetto di mezzo completo al gruppo di controllo, aggiungere 1,2 mL/pozzetto di fluido contenente 0,4 mM CoCl 2 al gruppo modello e aggiungere 1,2 mL/pozzetto di ciascuna delle due combinazioni contenenti 0,4 mM CoCl2. Incubare le cellule a 37 °C per altre 24 ore.
- Dopo il trattamento farmacologico, trattare le cellule con 250 μL/pozzetto di tripsina, trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 840 xg per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL del tampone legante.
- Incubare le cellule al buio con 5 μL di Annexin V-FITC e 10 μL di ioduro di propidio (PI) per 15 minuti a RT, quindi controllare l'apoptosi mediante citometria a flusso. Imposta tre pozzi replicati in ogni gruppo.
NOTA: La tripsina utilizzata in questo test non può contenere EDTA perché l'EDTA è un agente chelante di ioni metallici che compete con l'annessina V per legare gli ioni calcio e influenza l'affinità dell'annessina per PI. Quando si verifica l'apoptosi, la fosfoserina, originariamente sul lato interno della membrana cellulare, si rivolge verso l'esterno verso la superficie cellulare e l'annessina V-FITC si lega selettivamente alla fosfoserina al di fuori della membrana per mostrare fluorescenza verde. - Fare clic su Compensazione automatica nel menu Start , selezionare FITC, PE, PerCP e APC nel canale Seleziona e selezionare Compensazione alle: Altezza. Fare clic su OK nella voce statistica: Mediana. Con lo stesso metodo di conteggio delle cellule menzionato nel passaggio 2.3.2, raccogliere i campioni di cellule, fare clic sulla mappa di densità e cerchiare la popolazione cellulare effettiva.
- Con la fluorescenza FITC come parametro dell'asse X e altri parametri di fluorescenza come parametro dell'asse Y, creare una mappa di densità. Fare clic su Matrice di compensazione nel menu Start e Coefficiente nella matrice di overflow. Le informazioni sulla mappa della densità vengono visualizzate per l'analisi del tasso di apoptosi.
- Incubare le cellule al buio con 5 μL di Annexin V-FITC e 10 μL di ioduro di propidio (PI) per 15 minuti a RT, quindi controllare l'apoptosi mediante citometria a flusso. Imposta tre pozzi replicati in ogni gruppo.
4. Rilevazione dell'immunofluorescenza della generazione di caspasi-3
- Seminare le celle PC12 su coprivetrini ad una densità di 8 x 104 celle/coverslip e metterli in piastre da 24 pozzetti a 37 °C per 24 ore. Raggruppare le celle come menzionato sopra nel passaggio 3.2; Imposta tre copertine replicate per ogni gruppo.
- Dopo il trattamento farmacologico, sciacquare i coprivetrini due volte con PBS (37 °C) per 5 minuti ciascuno, fissarli con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,5% per 20 minuti a RT.
- Risciacquare nuovamente le cellule e bloccarle con siero di capra al 10% per 1 ora a RT.
- Incubare ciascun foglietto con 200 μL di anticorpo primario caspasi-3 (una proteina esecutiva chiave dell'apoptosi) diluito a una concentrazione di 1:250 in 1x TBST, durante la notte a 4 °C. Lavare con 1x TBST (tre volte per 3 minuti ciascuno) e incubare con 200 μL di anticorpo secondario (1:300 diluizione in 1x TBST) per 1 ora a RT al buio.
NOTA: La fluorescenza si spegne facilmente; Pertanto, dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario, i vetrini devono essere tenuti lontano dalla luce. Gli anticorpi primari e secondari devono essere conservati a 4 °C di distanza dalla luce. - Aggiungere 300 μL di DAPI (0,5 μg/ml) ai vetrini di copertura (per rilevare i nuclei) per 10 minuti e lavare le cellule tre volte con 1x TBST per 5 minuti ciascuna.
- Osservare i vetrini sotto il microscopio a fluorescenza e catturare immagini10. Eseguire analisi statistiche dell'intensità della fluorescenza utilizzando il software di imaging.
NOTA: I vetrini e i vetrini utilizzati devono essere puliti e sterili. Durante la colorazione, prestare attenzione al pH, alla concentrazione e alla temperatura della soluzione colorante ed evitare la tempra a fluorescenza. Il microscopio fluorescente deve essere acceso almeno 15 minuti prima di preriscaldare la lampada al mercurio e spento per 30 minuti prima di essere riacceso. Quando si acquisiscono immagini, i parametri di esposizione dello stesso colorante nello stesso lotto di esperimenti dovrebbero essere coerenti per garantire l'accuratezza dei risultati.
5. Dosaggio di immunofluorescenza del livello di ROS
- Coltivare e trattare le cellule come discusso al punto 4.1.
- Dopo il trattamento farmacologico, lavare ogni coprislip tre volte con PBS per 3 minuti e incubare con 400 μL di DCFH-DA (10 μM) a 37 °C per 20 minuti.
NOTA: DCFH-DA è un indicatore universale dello stress ossidativo. Ha permeabilità alla membrana cellulare e nessuna fluorescenza. Una volta entrato nella cellula, viene idrolizzato dall'esterasi per produrre 2',7'-diclorodiidrofluoresceina (DCFH) e quindi rapidamente ossidato per produrre un forte prodotto fluorescente. - Lavare nuovamente le cellule con DMEM senza siero (due volte per 3 minuti ciascuna) e osservare immediatamente il foglietto dopo aver aggiunto l'agente di tempra a fluorescenza al microscopio a fluorescenza. Calcolare l'intensità di fluorescenza relativa con il software di imaging.
NOTA: Dopo aver caricato la sonda DCFH-DA, assicurarsi di pulire la sonda residua che non entra nella cella, altrimenti lo sfondo diventerà alto.
6. Rilevazione Western blot dell'espressione proteica di Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax11,12
- Inoculare le cellule PC12 in piastre a 6 pozzetti ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/pozzetto e coltura a 37 °C per 24 ore. Raggruppare e trattare le cellule come indicato nel passaggio 4.1 e impostare tre pozzetti replicati in ciascun gruppo.
- Dopo il trattamento farmacologico per 24 ore, lavare le cellule tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna e incubare su ghiaccio per 30 minuti in tampone di lisi preparato. Dopo la lisi, centrifugare le cellule per 20 minuti a 16.000 x g e 4 °C e raccogliere i surnatanti
- Rilevare la concentrazione proteica e regolare secondo le istruzioni attraverso il test Bradford. Diluire i campioni e denaturarli a 100 °C per 10 minuti.
NOTA: Il tampone di lisi è composto da inibitore della fosfatasi, inibitore della proteasi e lisato RIPA in un rapporto di volume di 1:1:50. Nel gruppo di controllo, sono necessari 200 μL/pozzetto di tampone di lisi e 100 μL/pozzetto di tampone di lisi sono richiesti negli altri gruppi. Generalmente, le concentrazioni proteiche di controllo, modello e due tipi di gruppi di combinazioni sono rispettivamente 0,45 mg / ml, 0,25 mg / ml e 0,32-0,39 mg / ml; le loro concentrazioni proteiche dopo la diluizione con il tampone di carico sono rispettivamente 0,36, 0,2 e 0,256-0,312 mg/ml. - Per rilevare proteine con diversi pesi molecolari, caricare 25 μg di proteine in ogni corsia, eseguire un'elettroforesi SDS-PAGE al 12% e trasferire il gel alle membrane PVDF.
NOTA: Durante la preparazione del gel SDS, deve essere completamente miscelato senza bolle o particelle insolubili; in caso contrario, potrebbero verificarsi bande irregolari o irregolari. Quando si trasferiscono le membrane, assicurarsi che non ci siano bolle tra la membrana PVDF e il gel; Altrimenti, appariranno macchie bianche nella striscia. Inoltre, questo passaggio deve essere eseguito a basse temperature e la borsa del ghiaccio deve essere cambiata ogni 30 minuti. - Bloccare le membrane con latte scremato al 5% per 1,5 ore a RT e incubare con 5 ml dei corrispondenti anticorpi primari (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 e Bax 1:1.000) per 24 ore a 4 °C. Utilizzare l'anticorpo β-actina (1:5.000) come controllo interno.
- Lavare le membrane con TBST (tre volte per 10 minuti ciascuna), quindi incubare con 5 ml di anticorpi secondari coniugati HPR (1:5.000) a RT per 2 ore.
NOTA: Il rapporto di diluizione degli anticorpi non deve essere modificato arbitrariamente e le membrane devono essere lavate con TBST in conformità con i requisiti per evitare che il colore di fondo della banda sia troppo nero. - Infine, lavare nuovamente la membrana con TBST e trattarla con substrato HRP chemiluminescente (secondo le istruzioni del produttore) per il rilevamento della banda proteica. Cattura le immagini utilizzando il sistema di imaging a chemiluminescenza e quantifica i valori di grigio delle proteine utilizzando il software di imaging, con β-actina come controllo interno comparativo.
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Representative Results
Lo screening della combinazione ottimale di Ast iniezione ed Eri capsule è mostrato nella Figura 1. Il tasso di sopravvivenza cellulare dell'iniezione di Ast e della capsula Eri sulle cellule PC12 normali è mostrato nella Figura 1A. La vitalità cellulare era inferiore al 95% con iniezione di Ast a concentrazioni superiori a 12 μM (Figura 1A) e capsula Eri a concentrazioni superiori a 5 μM (Figura 1A), indicando che la concentrazione massima non tossica era rispettivamente di 12 μM e 5 μM. La loro citotossicità era maggiore di quella dell'astragaloside A e della scutellarina usati da soli. La vitalità dell'iniezione di Ast e della capsula di Eri sulle cellule PC12 danneggiate indotte da CoCl2 è mostrata nella Figura 1B,C. Rispetto al gruppo modello, l'iniezione di Ast potrebbe migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule PC12 danneggiate nell'intervallo di concentrazione di 6-12 μM (p < 0,05 o p < 0,01) e le capsule di Eri alla concentrazione di 2-5 μM potrebbero migliorare il tasso di sopravvivenza (p < 0,05 o p < 0,01). L'iniezione Ast e la capsula Eri nei rapporti di 10:1, 8:4,2 e 6:1,8 μM possono aumentare significativamente la vitalità delle cellule PC12 con lesione (p < 0,01) (Figura 1D). Il rapporto di 6:1,8 μM ha mostrato la più alta vitalità cellulare, indicando che è la combinazione di preparazione ottimale e l'attività farmacologica rispetto alla migliore combinazione di componenti.
La valutazione degli effetti protettivi di due tipi di combinazione sulle cellule PC12 danneggiate è mostrata nella Figura 2. Rispetto al gruppo modello, la vitalità cellulare delle due combinazioni è stata significativamente promossa (p < 0,001) e la combinazione di componenti è stata superiore alla combinazione di preparazione (Figura 2A). Ciò suggerisce che la combinazione di componenti può promuovere la sopravvivenza cellulare meglio della combinazione di preparazione. Il tasso di apoptosi è stato testato mediante citometria a flusso (Figura 2B,C). Rispetto al gruppo normale, le percentuali di cellule apoptotiche precoci, tardive e totali erano significativamente più alte nel gruppo modello (p < 0,01 o p < 0,001). Rispetto al gruppo modello, le percentuali di cellule apoptotiche in ogni fase erano significativamente più basse nei gruppi di trattamento (p < 0,05 o p < 0,01 o p < 0,001). L'intensità di fluorescenza dell'espressione della proteina caspasi-3 in ciascun gruppo è mostrata nella Figura 2D,E. Rispetto al gruppo normale, l'intensità di fluorescenza della caspasi-3 era significativamente più alta nel gruppo modello. Rispetto al gruppo modello, l'intensità di fluorescenza della caspasi-3 era significativamente inferiore in ciascun gruppo di trattamento (p < 0,001 o p < 0,01) ed era relativamente inferiore nel gruppo di combinazione di componenti rispetto al gruppo di combinazione di preparazione. Questi risultati suggeriscono che il modello cellulare può indurre apoptosi e l'effetto anti-apoptosi della combinazione di componenti è migliore di quello della combinazione di preparazione.
Western blot ha rilevato l'espressione delle proteine p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax (Figura 3). Rispetto al gruppo normale, i livelli di espressione di p-Akt/Akt e Bcl-2/Bax erano significativamente più bassi nel gruppo modello (p < 0,01 o p < 0,001). Rispetto al gruppo modello, l'espressione di p-Akt/Akt e Bcl-2/Bax era significativamente più alta nelle due combinazioni (p < 0,05 o p < 0,01, o p < 0,001), in particolare più alta nella combinazione di componenti. I risultati suggeriscono che la combinazione di componenti è superiore alla combinazione di preparazione nel promuovere la sopravvivenza cellulare, che è correlata al più forte effetto anti-apoptosi prodotto dall'upregolazione della via del segnale Akt / Bcl-2 / Bax.
La fluorescenza del DCFH può essere misurata da un microscopio a fluorescenza per determinare il livello di ROS nelle cellule (Figura 4A,B). Come mostrato nella Figura 4A, la fluorescenza era quasi invisibile nelle cellule normali e la fluorescenza nel gruppo modello era significativamente migliorata. La fluorescenza in entrambe le combinazioni è stata significativamente ridotta rispetto al gruppo modello. Come mostrato nella Figura 4B, l'intensità relativa della fluorescenza era significativamente più debole in ciascun gruppo di trattamento rispetto al gruppo modello (p < 0,001). La fluorescenza ha avuto la tendenza a diminuire nel gruppo di combinazione di componenti rispetto al gruppo di combinazione di preparazione, indicando che il modello cellulare può indurre danni ossidativi. L'effetto di danno antiossidante della combinazione di componenti è migliore di quello della combinazione di preparazione.
Western blot ha rilevato l'espressione della proteina Nrf2 (Figura 4C). Rispetto al gruppo normale, l'espressione di Nrf2 è stata significativamente ridotta nel gruppo modello (p < 0,05). Rispetto al gruppo modello, l'espressione della proteina Nrf2 era significativamente più alta nei gruppi di trattamento (p < 0,01 o p < 0,05), in particolare più alta nel gruppo di combinazione di componenti (Figura 4D). Ciò suggerisce che la combinazione di componenti è migliore della combinazione di preparazione nel promuovere la sopravvivenza cellulare, che è correlata al più forte danno antiossidante prodotto dall'upregolazione della via del segnale Nrf2.
In conclusione, la combinazione di componenti (10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico) potrebbe promuovere la sopravvivenza delle cellule danneggiate meglio della combinazione di preparazione (iniezione Ast da 6 μM e capsula Eri da 1,8 μM) attraverso una maggiore regolazione delle vie di segnale correlate all'apoptosi e al danno ossidativo.
Il software statistico SPSS 26.0 è stato utilizzato per l'analisi statistica e tutti i dati sono espressi come mezzi ± deviazione standard (SD). Per i confronti tra gruppi, i dati sono stati valutati da un ANOVA unidirezionale seguito dal test di Tukey. p < 0,05 è stato considerato indicante una differenza statisticamente significativa.
Figura 1: Effetti dei farmaci sulla vitalità delle cellule PC12 normali e danneggiate. (A) Effetti di varie concentrazioni di iniezione di Ast e varie concentrazioni di capsule di Eri su cellule PC12 normali. (B) Screening della concentrazione effettiva di Ast iniettabile su cellule PC12 lese. (C) Screening della concentrazione effettiva della capsula di Eri sulle cellule PC12 lese. (D) Effetti delle combinazioni di due farmaci in proporzioni diverse sul tasso di sopravvivenza delle cellule PC12 danneggiate. I valori statistici sono espressi come media ± SD da sei esperimenti indipendenti. &&p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. *p < 0,05 e **p < 0,01 rispetto al gruppo di modelli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetti di due combinazioni sulla sopravvivenza e l'apoptosi delle cellule PC12 danneggiate. (A) Effetto della combinazione di componenti e della combinazione di preparazione sul tasso di sopravvivenza delle cellule PC12 danneggiate. (B) Grafico del tasso di apoptosi rilevato dall'annessina V-PI. (C) Istogramma statistico del tasso di apoptosi. (D) L'intensità di fluorescenza relativa dell'espressione proteica della caspasi-3 (400x). Barre della scala: 20 μm. (E) Istogramma statistico dell'intensità di fluorescenza dell'espressione proteica della caspasi-3. I valori statistici sono espressi come media ± SD da tre esperimenti indipendenti, ad eccezione della vitalità cellulare per sei esperimenti indipendenti. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli. ##p < 0,01 rispetto al gruppo di combinazione di preparazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Effetti delle due combinazioni sui livelli di espressione di p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax. (A) Espressione proteica di p-Akt e Akt determinata mediante analisi Western blot. (B) Istogramma statistico delle statistiche del rapporto p-Akt/Akt in ciascun gruppo. (C) Espressione proteica di Bcl-2 e Bax determinata mediante analisi Western blot. (D) Istogramma statistico del rapporto Bcl-2/Bax in ciascun gruppo. I valori statistici sono espressi come media ± SD da tre esperimenti indipendenti. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetto di due combinazioni sull'espressione della proteina Nrf2 e sui livelli di ROS. (A) I livelli di ROS sono stati rilevati mediante microscopia a fluorescenza (400x). Barre della scala: 20 μm. (B) Istogramma statistico dell'intensità di fluorescenza ROS in ciascun gruppo. (C) Espressione della proteina Nrf2 determinata mediante analisi Western blot. (D) Istogramma statistico dell'espressione della proteina Nrf2. I valori statistici sono espressi come media ± SD da tre esperimenti indipendenti. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
C'è ancora una mancanza di farmaci ideali per il trattamento dell'ischemia cerebrale nella moderna pratica clinica2. Sotto la guida dell'integrazione del qi e dell'attivazione del metodo di circolazione sanguigna, Ast, Eri e altri preparati sono stati utilizzati in combinazione nella pratica clinica della MTC e hanno ottenuto buoni vantaggi globali13,14,15. Un gran numero di studi ha dimostrato che Ast può migliorare la permeabilità della barriera emato-encefalica, aumentare il flusso sanguigno cerebrale, migliorare la capacità delle cellule nervose di tollerare l'ipossia e resistere ai danni dei radicali liberi dell'ossigeno e può migliorare significativamente la disfunzione neurologica16,17. È particolarmente indicato per la malattia cerebrovascolare ischemica senile16,17. Eri può dilatare i vasi sanguigni, aumentare l'afflusso di sangue al cervello, rimuovere i ROS e ridurre la perossidazione lipidica18,19. Tuttavia, l'effetto sinergico, i componenti farmacodinamici e il meccanismo della combinazione dei due farmaci non sono ancora chiari, il che è un problema comune che limita l'applicazione clinica della MTC.
L'ambiente ischemico e ipossico dell'ischemia cerebrale cronica induce danni da stress ossidativo e, allo stesso tempo, attiva la via di segnalazione dell'apoptosi delle cellule cerebrali per promuovere l'apoptosi neuronale20,21. La via PI3K/Akt è una classica via di trasduzione del segnale anti-apoptotica e pro-sopravvivenza22,23, tra cui le proteine della famiglia Bcl-2 e la famiglia delle caspasi sono le proteine esecutive a valle di questa via del segnale. L'Akt fosforilato può regolare direttamente o indirettamente la famiglia Bcl-2 e inibire l'attivazione della via a valle caspasi-3, esercitando così un effetto anti-apoptotico11. Inoltre, l'eccesso di ROS generato dall'ipossia può indurre lesioni da stress ossidativo, mentre l'Akt fosforilato può attivare Nrf2 per eliminare i ROS in eccesso per combattere il danno da stress ossidativo12,24. Pertanto, l'attivazione della via PI3K/Akt/Nrf2 può prevenire e controllare efficacemente lo stress ossidativo e l'apoptosi, riducendo così il danno cerebrale ipossico-ischemico25,26.
Nello studio, la combinazione di preparazione è stata sottoposta a screening utilizzando il modello cellulare PC12 danneggiato e l'effetto e il meccanismo in questo modello sono stati confrontati con la combinazione di componenti esaminata in precedenza7. Inoltre, la concentrazione massima non tossica di Ast iniettabile e capsula Eri è di 12 μM (calcolata dall'astragaloside A) e 5 μM (calcolata dalla scutellarina), rispettivamente, mentre la concentrazione massima non tossica di astragaloside A e scutellarin è rispettivamente di 20 μM e 50 μM,7. Dimostra che la combinazione di componenti è più sicura della combinazione di preparazione, con una qualità più controllabile e vantaggi completi di alta efficienza e bassa tossicità.
Gli attuali modelli cellulari che possono essere utilizzati per simulare l'ischemia cerebrale includono principalmente ipossia fisica (indotta da OGD) e ipossia chimica (indotta da Na 2 S 2 O4 oCoCl2)27. Tra questi, sia le lesioni OGD che Na2 S2O4 hanno un breve tempo di ipossia e non sono adatte per simulare l'ischemia cronica27. L'ipossia indotta da CoCl2 è una delle imitazioni dell'ipossia più comunemente utilizzate rispetto all'OGD e all'uso di altre imitazioni dell'ipossia. Può portare a danni ossidativi persistenti e stabili da ROS e produrre cambiamenti apoptotici tipici in diverse linee cellulari27. Pertanto, in questo studio, CoCl2 è stato utilizzato per 24 ore per simulare l'ipossia neuronale28,29. Sono stati sottoposti a screening la sua concentrazione di modellazione (0,1, 0,2, 0,4 e 0,8 mM) e il periodo di validità (1 e 7 giorni). Inoltre, data l'inevitabile mancanza di glucosio e ossigeno dopo ischemia cerebrale, l'ambiente privo di glucosio e ipossico può simulare meglio il danno ischemico cerebrale. Questo studio ha dimostrato che 0,4 mM CoCl2 combinati con un mezzo privo di glucosio per 24 ore potrebbero stabilire un modello di cellule ipossiche croniche stabili e controllabili. Nello studio di follow-up, il modello animale di ischemia cerebrale cronica sarà utilizzato per convalidare ulteriormente i vantaggi terapeutici della combinazione di componenti in vivo.
Questo modello cellulare può aumentare il tasso di apoptosi, l'intensità della fluorescenza della caspasi-3 e il livello di ROS intracellulare (Figura 2 e Figura 4), che può simulare meglio i cambiamenti patologici dell'ischemia cerebrale cronica, come apoptosi, stress ossidativo, ecc. Sulla base di questo modello, è stato riscontrato che i due tipi di combinazioni possono inibire l'apoptosi e il danno da stress ossidativo. L'effetto della combinazione di componenti sulla promozione della sopravvivenza cellulare è stato significativamente migliore di quello della combinazione di preparazione (Figura 1); entrambe le combinazioni potrebbero sovraregolare i livelli di espressione di P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax e Nrf2 in gradi diversi (Figura 3 e Figura 4). In particolare, la combinazione di componenti ha avuto un effetto più forte sulla up-regulation della via di segnalazione Akt/Bcl-2/Bax e Nrf2. Questi risultati indicano che la combinazione di componenti può resistere meglio al danno cellulare rispetto alla combinazione di preparazione, che è correlata a una maggiore anti-apoptosi e stress anti-ossidativo.
In conclusione, questi risultati forniscono una strategia combinata di due erbe per trattare le cellule PC12 danneggiate e forniscono una nuova idea per valutare e ottimizzare la modalità di applicazione combinata di due erbe. Nel complesso, questo studio fornisce un riferimento per la selezione della combinazione di componenti attivi di MTC.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da progetti chiave di ricerca e sviluppo del Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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