Summary
このプロトコルは、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を提供します。このプロトコルは、漢方薬(TCM)の最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。
Abstract
脳虚血の治療における伝統的な漢方薬(TCM)の組み合わせの利点を考慮して、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を探索するために、製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムの違いを研究しました。グルコースフリー培地と組み合わせた塩化コバルト(CoCl2)は、PC12細胞の酸化的損傷を誘発するために使用されました。次に、 レン ゲ(Ast)注射と エリジェロンブレビスカプス (Eri)注射の最適な組み合わせを選択し、PC12細胞に対する安全で効果的な濃度をスクリーニングした後、統一された設計方法に従って組み合わせました。さらに、スクリーニングされた成分の組み合わせは、2つのハーブに10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸を含みます。次に、MTT、アネキシンV-FITC/PI、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析を使用して、損傷したPC12細胞に対する製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムを評価しました。結果は、細胞生存促進のための最適な調製の組み合わせが、濃度6:1.8(μM)のAst注射とEriカプセルであることを示しました。成分の組み合わせ(10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)は、製剤の組み合わせよりも効果的でした。どちらの組み合わせも、アポトーシス速度、カスパーゼ-3の蛍光強度、および細胞内活性酸素種(ROS)レベルを著しく低下させました。一方、彼らはp-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、およびNrf2の発現レベルをアップレギュレートしました。これらの効果は、コンポーネントの組み合わせでより明白でした。結論として、両方の組み合わせは、PC12細胞上のグルコースフリー培地と組み合わせたCoCl2 によって誘発される傷害を阻害し、したがって細胞の生存を促進することができる。ただし、調製の組み合わせに対する成分の組み合わせの効率は、酸化ストレスとアポトーシスに関連するPI3K / Akt / Nrf2シグナル伝達経路のより強力な制御による可能性があります。
Introduction
脳低灌流による慢性脳虚血は、中高年に多い疾患です1。長期潜血性疾患として、進行性または持続性の神経機能障害を引き起こす可能性があります。主な病理学的メカニズムには、細胞のアポトーシスおよび酸化的損傷が含まれ、進行性または持続性の神経学的機能障害を引き起こす。これは、アルツハイマー病、血管性認知症、およびその他の疾患の病理学的基盤であり、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします。しかし、現代医学では慢性脳虚血を治療するための理想的な薬がまだ不足しています2。同時に、 レン ゲ(Ast)と エリジェロンブレビスカプス (Eri)の組み合わせは、伝統的な漢方薬(TCM)の臨床診療で広く使用されています4。併用戦略は、脳虚血後の神経機能の回復を促進する上で著しく改善されており、これは単一の薬剤よりも優れています。しかしながら、2つの薬剤の組み合わせでは投与比に大きな違いがある4。有効な成分と作用機序は明確に定義されておらず、これが臨床応用を制限する重要な問題です。
以前の研究では、ラットの脳虚血の治療におけるAst注射とEri注射の製剤の組み合わせの相乗効果が実証されています。p-Aktタンパク質の発現をアップレギュレートし、Bリンパ芽腫2(Bcl-2)ファミリータンパク質の一つであり、アポトーシスを促進する効果を有するBcl-2関連死プロモーター(BAD)タンパク質5,6の発現をダウンレギュレートすることができる。しかし、その相乗効果の物質的根拠とメカニズムは明らかではありません。また、CoCl2複合グルコースフリー培地を用いてPC12細胞の傷害モデルを確立し、AstとEriにおける最適な成分の組み合わせをスクリーニングし、定義した7。
この研究では、AstとEriの有効用量を損傷したPC12細胞モデルを使用してスクリーニングします。2つの薬剤の最適な組み合わせは、均質設計法と組み合わせたこのモデルを使用してスクリーニングされます。細胞モデルは、損傷したPC12細胞における調製の組み合わせと成分の組み合わせの効果とメカニズムの違いをさらに評価するために使用されます。この戦略は、損傷したPC12細胞に対する2種類の組み合わせの保護効果と調節メカニズムをPI3K / Akt / Nrf2シグナル経路を介して調査し、最良の組み合わせモードを決定することを目的としています。この調査は、TCMの最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。
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Protocol
1. 試薬の調製
- 125 mLの滅菌培養フラスコに90 mLのDMEM高糖培地、10 mLのウシ胎児血清(FBS)、および1 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を加えて、完全培地を調製します。完全培地を混合し、密閉条件下で4°Cで保存する。
- 10 mLのDMEM無糖培地(完全に溶解)に0.02 gのCoCl2粉末(正確に秤量)を加えてCoCl2溶液を調製し、8.4 mMストック溶液を得た。溶液を0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封して、光から4°C離して保存します。
注:CoCl2 は不安定であり、光から保護された密閉容器に保管する必要があります。CoCl2 溶液の有効期間は7日間です。 - トリス塩酸緩衝塩溶液(TBST)を調製します。
- 8 gの塩化ナトリウム、0.2 gの塩化カリウム、および3 gのトリス塩基を正確に計量します。それらを1Lビーカーに加え、次に1,000mLのRO水を加えて混合物を溶解します。
- pHを7.4に調整し、1 mLのTween 20を加え、十分に混合してTBST溶液を得ます。
注:Tween 20は、抗原に対する抗体の非特異的結合を低減する界面活性剤として機能し、0.1%濃度で最適に機能します。
- MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物塩)溶液を調製し、20 mLのPBS溶液に0.1 gのMTT粉末を量り、5 mg/mLのストック溶液を得ました。溶液を0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封し、光から4°C離して保管し、スタンバイ状態にします。
注意: MTTパウダーは不安定で湿気を吸収しやすいため、光を避けて密閉乾燥した場所に保管する必要があります。MTT ソリューションは 7 日後に有効期限が切れます。MTTは発がん作用があるため、皮膚に直接触れないようにしてください。 - カプセルシェルを取り出し、DMEM無糖培地10mLに内容物0.18gを正確に秤量してエリカプセル液を調製し、100μMストック溶液(スクテラリン濃度基準)を調製した。溶液を0.2 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封して、4°Cの密閉容器に保管します。
注:スクテラリンはエリゲロンブレビスカプスの主な有効成分です。カプセル中のスクテラリンの濃度は、HPLC-UVによって2.56 mg / g、すなわち5.54 μmol / g8と決定されています。製剤の濃度は、スクテラリン濃度に基づいて計算される。これは、製剤および成分の薬理学的活性を評価するのに便利である。 - 15 mLの滅菌遠心チューブに5 mLの注射剤と5 mLの無糖DMEM培地を加えてAst注射の溶液を調製し、60 μMのストック溶液を調製しました(アストラガロシドAの濃度に基づく)。溶液を0.2 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cの密閉容器に保管します。
注:注射量はそれぞれ10 mLであり、注射中のアストラガロシドAの濃度はHPLC-ELSDによって0.094 mg / mL(すなわち、120 μM)9と決定されています。準備はバイオセーフティキャビネットで実行し、全体を通して遮光方法で操作する必要があります。注射液と無糖培地の量は正確に測定し、よく混合する必要があります。 - 7.85 mgのアストラガロシドA標準物質を正確に秤量し、2 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に完全に溶解して5,000 μMのストック溶液を調製することにより、アストラガロシドA溶液を調製します。0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cで気密に保管します。
注:アストラガロシドA粉末は無糖培地に不溶です。溶液を調製する際は、適量のDMSOで溶解し、実験の最終濃度を0.1%未満に保ち、細胞毒性がないことを確認してください。 - スクテラリン標準物質11.56mgを秤量し、5mLの無糖DMEM培地で完全に溶解してスクテラリン溶液を調製し、5,000μMストック溶液を調製します。0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cで気密に保管します。
- クロロゲン酸標準物質8.86mgを秤量してクロロゲン酸溶液を調製し、5mLの無糖DMEM培地で完全に溶解し、5,000μMの原液を調製した。0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、4°Cで気密に保管します。
注:クロロゲン酸粉末は不安定で、水を吸収しやすいです。密封し、光から4°C離して保管する必要があります。計量中の暴露時間は最小限に抑える必要があります。
2. 細胞生存率アッセイ
- PC12細胞を入手し、10%FBS、100 U/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEMで培養します。
注:この研究では、細胞は中国科学院から入手しています。PC12細胞は、神経内分泌細胞の一般的な特徴を持つ接着細胞であり、神経生理学および神経薬理学において広く使用されている。 - 5%CO2 を添加したインキュベーター内で37°Cで細胞を培養し、2〜3日ごとに継代培養する。すべての実験で4〜8番目の通路で細胞を使用します。
- 細胞培養
- 対数増殖期(70%〜80%の細胞コンフルエンシー)のPC12細胞を1 mLのトリプシン(0.25%)で処理し、顕微鏡下で細胞を観察します。細胞が丸くなったら、3 mLの完全培地を加えてトリプシン消化を停止します。
- 細胞を滅菌済みの15 mL遠沈管に移し、840 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、完全な培地で再懸濁し、細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。次に、フローサイトメーターを使用して細胞数をカウントします。
- フローサイトメトリーソフトウェアを起動し、カウント設定で対応する細胞溶液の希釈倍数を選択し、1.5 mLマイクロ遠心チューブから細胞サンプルをロードした後、 密度チャート をクリックします。
- X軸とY軸から離れるセル集団を丸で囲み、図の下のデータテーブルを右クリックして、[ X]、[Y]、[カウント]、および [腹筋カウント]を選択します。データテーブルの Abs カウントの下のデータは、セルカウント結果を示します。
- 細胞濃度を1 x 10 5 cells/mLに調整し、96ウェルプレートに100 μL/ウェルを接種し、インキュベーター内で37°C、5 %CO2 で24時間培養します。
- 正常PC12細胞上の2種類の薬剤の安全な濃度のスクリーニング
- ステップ2.1〜2.2に記載されているように細胞を培養します。上清を廃棄し、最終濃度の異なるAst注射液(4、8、12、16、20、24μM)とエリカプセル(0.625、1.25、2.5、5、10、20μM)で正常細胞を処理します。各グループの6つの複製ウェルを24時間処理します。
注:薬物の最終濃度を達成するために薬物を培地に添加し(ステップ2.4.1で言及)、次に等量の培地を各ウェルに加えます。上清を吸引するときは、ウェルの底にある細胞に接触しないように、ピペットチップをウェル壁にそっと当てる必要があります。異なる溶液を追加するときは、ウェルの端に沿って穏やかかつ迅速に追加し、実験結果に影響を与えないようにピペットガンヘッドを交換するときは注意してください。 - 上清を捨て、120 μLのMTT溶液(1 mg/mL)を各ウェルに加え、細胞を37°Cで4時間インキュベートします。
- インキュベーション後、上清を再度廃棄し、各ウェルに150 μLのDMSOを加えます。渦発振器を使用して、プレートを240回/分(毎分水平振動数)の速度で10分間振とうします。
- マイクロプレートリーダーを使用して、490 nmにおける各サンプルの吸光度を測定します。細胞生存率(%)を計算し、これは治療群の吸光度/正常群(対照)の吸光度x100です。
注: MTT ソリューションが有効期間内であることを確認します。色が(濃い緑色に)変わった場合は使用できません。細胞の吸光度をテストするときは、ブランクウェル(培養培地とMTT、細胞や薬物を含まない)を設定して、他の試薬の干渉を排除する必要があります。150 μLの容量のDMSOを各ウェルに加え、10分間振とうして、青紫色の結晶をよりよく溶解させます。結果の正確性を確保するために、吸光度をできるだけ早く検出する必要があります。
- ステップ2.1〜2.2に記載されているように細胞を培養します。上清を廃棄し、最終濃度の異なるAst注射液(4、8、12、16、20、24μM)とエリカプセル(0.625、1.25、2.5、5、10、20μM)で正常細胞を処理します。各グループの6つの複製ウェルを24時間処理します。
- 損傷したPC12細胞に対する2剤有効濃度のスクリーニング
- ステップ2.1〜2.2で述べたように細胞を24時間培養し、上清を廃棄してから、無糖培地と組み合わせたCoCl2 (0.4 mM)の20 μL/ウェルで細胞を処理します。
- 細胞を100 μL/ウェルのAst注射(最終濃度は2、6、8、10、および12 μM)または100 μLのEriカプセル(最終濃度は1、2、3、4、および5 μM)で37°Cでさらに24時間処理します。120 μL/ウェルの完全培地を対照群に加えます。
注:CoCl2 は細胞内に低酸素状態を誘導します。 - MTT法によって各サンプルの吸光度を測定し、ステップ2.4.2および2.4.3で前述したように細胞生存率を計算します。
- 均質設計法に基づく2剤の最適組み合わせのスクリーニング
注:レンゲ注射とブレビスカプスカプセルの有効濃度範囲を取得した後、統一設計法U 7(7 4)表を使用して、2つの薬物の6つの異なる組み合わせを取得しました。Ast注射:エリカプセル:1)2:2.6μM、2)4:5μM、3)6:1.8μM、4)8:4.2μM、5)10:1μM、6)12:3.4μM。- 上記のステップ2.3.1で細胞を培養し、負傷したPC12細胞を上記のようにAst注射:エリカプセルの6つの割合濃度で処理します。
- 細胞を24時間処理し、ステップ2.4.2および2.4.3で前述したように細胞生存率を計算します。
- 損傷したPC12細胞に対する2つの最適な組み合わせの保護効果の評価
注:最適な製剤の組み合わせ(Ast注射:6:1.8 μMのエリカプセル)と最適な成分の組み合わせ7 (10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)を取得した後、損傷したPC12細胞に対する保護効果を確認するためにさらに評価が行われます。- ステップ2.3.1で上記のように細胞を培養し、損傷したPC12細胞を上記の注で説明した2種類の薬物の組み合わせで処理します。
- 細胞を24時間処理し、ステップ2.4.2および2.4.3で前述したように細胞生存率を計算します。
3. アポトーシス率に関するアネキシンV-FITC/PIアッセイ
- PC12細胞を12ウェルプレートに1.3 x 105 細胞/ウェルの濃度で播種し、37°Cで24時間培養します。
- 細胞をグループ化します:コントロールグループ、モデルグループ、および薬物の2つの組み合わせ。対照群に1.2 mL/ウェルの完全培地を追加し、0.4 mM CoCl 2を含む培地を1.2 mL/ウェルをモデル群に追加し、0.4 mM CoCl 2を含む2つの組み合わせのそれぞれ1.2 mL/ウェルを追加します。細胞を37°Cでさらに24時間インキュベートします。
- 薬物処理後、細胞を250 μL/ウェルのトリプシンで処理し、細胞を15 mL遠沈管に移し、室温(RT)で840 xg で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを500 μLの結合バッファーに再懸濁します。
- 細胞を暗所で5 μLのアネキシンV-FITCと10 μLのヨウ化プロピジウム(PI)でRTで15分間インキュベートし、フローサイトメトリーでアポトーシスを確認します。各グループに3つの複製ウェルを設定します。
注:EDTAはアネキシンVと競合してカルシウムイオンに結合し、PIに対するアネキシンの親和性に影響を与える金属イオンキレート剤であるため、この試験で使用されるトリプシンにはEDTAを含めることはできません。アポトーシスが起こると、もともと細胞膜の内側にあったホスホセリンが細胞表面に外側に向きを変え、アネキシンV-FITCは膜外側のホスホセリンに選択的に結合して緑色の蛍光を示します。 - スタートメニューの「自動補正」をクリックし、「チャンネルの選択」で「FITC」、「PE」、「PERCP」、および「APC」を選択し、「補正場所:高さ」を選択します。統計項目の中央値でOKをクリックします。ステップ2.3.2で説明したのと同じ細胞カウント方法で、細胞サンプルを収集し、密度マップをクリックして、有効な細胞集団を丸で囲みます。
- FITC蛍光をX軸パラメータとして、その他の蛍光パラメータをY軸パラメータとして使用して、密度マップを作成します。[スタート]メニューの[補正マトリックス]をクリックし、オーバーフローマトリックスの[係数]をクリックします。 アポトーシス率の分析のために密度マップ情報が表示されます。
- 細胞を暗所で5 μLのアネキシンV-FITCと10 μLのヨウ化プロピジウム(PI)でRTで15分間インキュベートし、フローサイトメトリーでアポトーシスを確認します。各グループに3つの複製ウェルを設定します。
4. カスパーゼ-3世代の免疫蛍光検出
- PC12細胞を8 x 104 細胞/カバーガラスの密度でカバーガラスに播種し、37°Cで24時間24ウェルプレートに入れます。上記のステップ3.2で説明したようにセルをグループ化します。グループごとに 3 つの複製カバースリップを設定します。
- 薬物処理後、カバーガラスをPBS(37°C)でそれぞれ5分間2回すすぎ、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.5%Triton X-100でRTで20分間透過処理します。
- 細胞を再度すすぎ、RTで1時間10%ヤギ血清でブロックします。
- 各カバーガラスを、1x TBST中で1:250の濃度で希釈した一次抗体カスパーゼ-3(アポトーシスの重要な実行タンパク質)200 μLで、4°Cで一晩インキュベートします。 1x TBST(各3分間で3回)で洗浄し、200 μLの二次抗体(1x TBSTで1:300希釈)とともに、暗所のRTで1時間インキュベートします。
注:蛍光は簡単に消光できます。したがって、二次抗体のインキュベーション後、スライドは光から遠ざける必要があります。一次抗体と二次抗体は、光から4°C離して保存する必要があります。 - 300 μLのDAPI(0.5 μg/mL)をカバーガラス(核を検出するため)に10分間加え、細胞を1x TBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 蛍光顕微鏡でカバーガラスを観察し、画像をキャプチャします10.イメージングソフトウェアを使用して蛍光強度の統計解析を実行します。
注意: 使用するスライドとカバーガラスは、清潔で無菌である必要があります。染色するときは、染色液のpH、濃度、温度に注意し、蛍光消光を避けてください。蛍光顕微鏡は、水銀灯を予熱するために少なくとも15分前にオンにし、30分間オフにしてから再度オンにする必要があります。画像を取得する場合、結果の精度を確保するために、同じバッチの実験における同じ色素の露光パラメータは一貫している必要があります。
5. ROSレベルの免疫蛍光アッセイ
- ステップ4.1で説明したように細胞を培養および処理します。
- 薬物処理後、各カバーガラスをPBSで3分間3回洗浄し、400 μLのDCFH-DA(10 μM)とともに37°Cで20分間インキュベートします。
注:DCFH-DAは酸化ストレスの普遍的な指標です。細胞膜透過性があり、蛍光がありません。細胞に入ると、エステラーゼによって加水分解されて2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)が生成され、その後急速に酸化されて強力な蛍光生成物が生成されます。 - 無血清DMEMで細胞を再度洗浄し(各2回、3分間)、蛍光消光剤を添加した後、直ちにカバーガラスを蛍光顕微鏡で観察します。イメージングソフトウェアにより相対蛍光強度を算出する。
注意: DCFH-DAプローブをロードした後、セルに入らない残留プローブを必ず清掃してください。
6. Nrf2、p-Akt、Akt、Bcl-2、およびBaxのタンパク質発現のウェスタンブロット検出11,12
- PC12細胞を1 x 10 6細胞/ウェルの濃度で6 ウェルプレートに接種し、37°Cで24時間培養します。ステップ4.1で前述したように細胞をグループ化して処理し、各グループに3つの複製ウェルを設定します。
- 24時間の薬物処理後、細胞をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、調製した溶解バッファー中で氷上で30分間インキュベートします。溶解後、細胞を16,000 x g および4°Cで20分間遠心分離し、上清を回収します。
- タンパク質濃度を検出し、ブラッドフォードアッセイの指示に従って調整します。サンプルを希釈し、100°Cで10分間変性させます。
注:溶解バッファーは、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびRIPAライセートで構成されており、容量比は1:1:50です。対照群では200 μL/ウェルの溶解バッファーが必要で、他の群では100 μL/ウェルの溶解バッファーが必要です。一般に、コントロール、モデル、および2種類の組み合わせグループのタンパク質濃度は、それぞれ0.45 mg / mL、0.25 mg / mL、および0.32〜0.39 mg / mLです。ローディングバッファーで希釈した後のタンパク質濃度は、それぞれ0.36、0.2、および0.256-0.312 mg / mLです。 - 分子量の異なるタンパク質を検出するには、各レーンに25 μgのタンパク質をロードし、12% SDS-PAGE電気泳動を実行し、ゲルをPVDFメンブレンに移します。
注:SDSゲルの調製中は、気泡や不溶性粒子なしで完全に混合する必要があります。そうしないと、不均一なバンドや不規則なバンドが発生する可能性があります。メンブレンを移すときは、PVDFメンブレンとゲルの間に気泡がないことを確認してください。そうしないと、ストリップに白い斑点が表示されます。さらに、このステップは低温で実行する必要があり、アイスバッグは30分ごとに交換する必要があります。 - メンブレンを5%脱脂乳でRTで1.5時間ブロックし、対応する一次抗体5 mL(Nrf2 1:1,000、Akt 1:2,000、p-Akt 1:2,000、Bcl-2 1:5,000、Bax 1:1,000)とともに4°Cで24時間インキュベートします。 βアクチン(1:5,000)抗体を内部コントロールとして使用します。
- メンブレンをTBSTで洗浄し(各10分間で3回)、5 mLの二次HPR標識抗体(1:5,000)とともにRTで2時間インキュベートします。
注:抗体の希釈比は任意に変更してはならず、バンドの背景色が黒すぎないように、要件に厳密に従って膜を十分にTBSTで洗浄する必要があります。 - 最後に、メンブレンを再度TBSTで洗浄し、タンパク質バンド検出のために化学発光HRP基質で処理します(製造元の指示に従って)。化学発光イメージングシステムを使用して画像をキャプチャし、イメージングソフトウェアを使用してタンパク質のグレー値を定量し、β-アクチンを比較内部コントロールとして使用します。
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Representative Results
Ast注射とEriカプセルの最適な組み合わせのスクリーニングを図1に示す。正常PC12細胞に対するAst注射およびエリカプセルの細胞生存率を図1Aに示す。細胞生存率は、12 μMを超える濃度のAst注射(図1A)および5 μMを超える濃度のEriカプセル(図1A)で95%未満であり、最大非毒性濃度がそれぞれ12 μMおよび5 μMであることを示しています。それらの細胞毒性は、単独で使用されたアストラガロシドAおよびスクテラリンのそれよりも大きかった。CoCl2によって誘導された損傷したPC12細胞に対するAst注射およびEriカプセルの生存率を図1B、Cに示す。モデル群と比較して、Ast注射は6〜12μM(p < 0.05またはp < 0.01)の濃度範囲で損傷したPC12細胞の生存率を改善し、2〜5μM の濃度のエリカプセルは生存率を改善する可能性があります(p < 0.05またはp < 0.01)。Ast注射とEriカプセルを10:1、8:4.2、および6:1.8μMの比率で投与すると、損傷PC12細胞の生存率を大幅に高めることができます(p < 0.01)(図1D)。6:1.8 μMの比率は最も高い細胞生存率を示し、最良の成分の組み合わせと比較して最適な製剤の組み合わせと薬理活性であることを示しています。
損傷したPC12細胞に対する2種類の組み合わせによる保護効果の評価を図2に示す。モデル群と比較して、2つの組み合わせの細胞生存率は有意に促進され(p < 0.001)、成分の組み合わせは調製の組み合わせよりも優れていました(図2A)。これは、成分の組み合わせが調製物の組み合わせよりも細胞の生存をよりよく促進できることを示唆しています。アポトーシス速度をフローサイトメトリーにより試験した(図2B、C)。正常群と比較して、初期、後期、および総アポトーシス細胞の割合は、モデル群で有意に高かった(p < 0.01またはp < 0.001)。モデル群と比較して、各段階におけるアポトーシス細胞の割合は、治療群で有意に低かった(p < 0.05またはp < 0.01、またはp < 0.001)。各群におけるカスパーゼ-3タンパク質発現の蛍光強度を図2D、Eに示す。正常群と比較して、カスパーゼ-3の蛍光強度はモデル群で有意に高かった。モデル群と比較して、カスパーゼ-3の蛍光強度は、各治療群で有意に低く(p < 0.001またはp < 0.01)、調製併用群よりも成分併用群で比較的低かった。これらの結果は、細胞モデルがアポトーシスを誘導できることを示唆しており、成分の組み合わせの抗アポトーシス効果は、調製の組み合わせのそれよりも優れている。
ウェスタンブロットでは、p-Akt、Akt、Bcl-2、およびBaxタンパク質の発現が検出されました(図3)。正常群と比較して、p-Akt/AktおよびBcl-2/Baxの発現量はモデル群で有意に低かった(p < 0.01またはp < 0.001)。モデル群と比較して、p-Akt/AktとBcl-2/Baxの発現は、2つの組み合わせ(p < 0.05またはp < 0.01、またはp < 0.001)で有意に高く、特に成分の組み合わせで高かった。この結果は、Akt/Bcl-2/Baxシグナル経路をアップレギュレートすることによって生じるより強力な抗アポトーシス効果に関連する、細胞生存の促進において、成分の組み合わせが調製の組み合わせよりも優れていることを示唆しています。
DCFHの蛍光を蛍光顕微鏡で測定して、細胞内のROSレベルを決定することができます(図4A、B)。 図4Aに示すように、正常細胞では蛍光がほとんど見えず、モデル群では蛍光が有意に増強された。両方の組み合わせの蛍光は、モデル群と比較して有意に減少した。 図4Bに示すように、相対蛍光強度は、モデル群と比較して各処置群において有意に弱かった(p < 0.001)。蛍光は、調製併用群と比較して成分併用群で減少する傾向があり、細胞モデルが酸化的損傷を誘発し得ることを示している。成分の組み合わせの抗酸化損傷効果は、製剤の組み合わせよりも優れています。
ウェスタンブロットはNrf2タンパク質の発現を検出した(図4C)。正常群と比較して、モデル群ではNrf2の発現が有意に低下した(p < 0.05)。モデル群と比較して、Nrf2タンパク質の発現は、治療群で有意に高く(p < 0.01またはp < 0.05)、特に成分併用群で高かった(図4D)。これは、Nrf2シグナル経路をアップレギュレートすることによって生じるより強い抗酸化損傷に関連する、細胞生存を促進する上で、成分の組み合わせが調製物の組み合わせよりも優れていることを示唆しています。
結論として、成分の組み合わせ(10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)は、アポトーシスと酸化的損傷に関連するシグナル経路のより強力な調節を通じて、製剤の組み合わせ(6 μMのAst注射と1.8 μMのEriカプセル)よりも損傷細胞の生存を促進する可能性があります。
統計解析にはSPSS統計ソフトウェア26.0を用い、全てのデータを標準偏差(SD)±平均値として表した。グループ間の比較のために、データは一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定によって評価されました。 p <0.05は統計的に有意な差を示すと考えられた。
図1:正常および損傷したPC12細胞の生存率に対する薬物の影響 。 (A)正常PC12細胞に対する各種濃度のAst注射および各種濃度のエリカプセルの効果。(B)損傷したPC12細胞に対するAst注射の有効濃度のスクリーニング。(C)損傷したPC12細胞に対するエリカプセルの有効濃度のスクリーニング。(D)損傷したPC12細胞の生存率に対する異なる比率の2つの薬剤の組み合わせの影響。統計値は、6つの独立した実験からのSD±平均値として表されます。& &p <対照群と比較して0.01である。*p <0.05、**p <モデル群と比較して0.01です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:損傷したPC12細胞の生存とアポトーシスに対する2つの組み合わせの影響。 (a)損傷したPC12細胞の生存率に及ぼす成分の組み合わせおよび調製の組み合わせの影響。(B)アネキシンV-PIにより検出されたアポトーシス率のグラフ。(C)アポトーシス率の統計的ヒストグラム。(d)カスパーゼ-3タンパク質発現の相対蛍光強度(400倍)。スケールバー:20μm。 (E)カスパーゼ-3タンパク質発現の蛍光強度の統計的ヒストグラム。統計値は、6つの独立した実験の細胞生存率を除いて、3つの独立した実験からのSD±平均値として表されます。モデル群と比較して、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 ##p<調製併用群と比較して0.01であった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:p-Akt、Akt、Bcl-2、およびBaxの発現レベルに対する2つの組み合わせの影響。 (A)ウェスタンブロット解析により決定されたp-AktおよびAktのタンパク質発現。(B)各グループのp-Akt/Akt比統計量の統計ヒストグラム。(C)ウェスタンブロット解析により測定したBcl-2およびBaxのタンパク質発現。(D)各群におけるBcl-2/Bax比の統計的ヒストグラム。統計値は、3つの独立した実験からのSD±平均値として表されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 モデルグループと比較しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Nrf2タンパク質発現およびROSレベルに対する2つの組み合わせの影響。 (a)ROSのレベルは、蛍光顕微鏡(400倍)によって検出されました。スケールバー:20μm。 (B)各群におけるROS蛍光強度の統計的ヒストグラム。(C)ウェスタンブロット解析により測定されたNrf2タンパク質発現。(D)Nrf2タンパク質発現の統計的ヒストグラム。統計値は、3つの独立した実験からのSD±平均値として表されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 モデルグループと比較しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現代の臨床診療では、脳虚血の治療に理想的な薬がまだ不足しています2。気を補い、血液循環法を活性化するという指導の下で、Ast、Eri、およびその他の製剤は、TCMの臨床診療で組み合わせて使用 され、優れた包括的な利点を達成しています13,14,15。多くの研究により、Astは血液脳関門の透過性を改善し、脳血流を増加させ、神経細胞が低酸素症に耐え、酸素フリーラジカル損傷に抵抗する能力を改善し、神経機能障害を大幅に改善できることが示されています16,17。老人性虚血性脳血管疾患に特に適しています16,17。Eriは血管を拡張し、脳への血液供給を増加させ、ROSを除去し、脂質過酸化を減らすことができます18,19。しかし、相乗効果、薬力学的成分、および2つの薬物の組み合わせのメカニズムはまだ不明であり、これはTCMの臨床応用を制限する一般的な問題です。
慢性脳虚血の虚血性および低酸素環境は、酸化ストレス損傷を誘発すると同時に、脳細胞のアポトーシスシグナル伝達経路を活性化してニューロンのアポトーシスを促進します20,21。PI3K/Akt経路は、古典的な抗アポトーシスおよび生存促進シグナル伝達経路22,23であり、その中でBcl-2ファミリータンパク質およびカスパーゼファミリーがこのシグナル経路の下流実行タンパク質である。リン酸化Aktは、Bcl−2ファミリーを直接的または間接的に調節し、カスパーゼ−3の下流経路の活性化を阻害し、それによって抗アポトーシス効果を発揮することができる11。さらに、低酸素症によって生成された過剰なROSは酸化ストレス傷害を誘発する可能性があり、一方、リン酸化AktはNrf2を活性化して過剰なROSを排除し、酸化ストレス損傷と戦うことができます12,24。したがって、PI3K/Akt/Nrf2経路の活性化は、酸化ストレスとアポトーシスを効果的に予防および制御することができ、それによって低酸素虚血性脳損傷を軽減することができます25,26。
この研究では、損傷したPC12細胞モデルを使用して製剤の組み合わせをスクリーニングし、このモデルにおける効果とメカニズムを以前にスクリーニングされた成分の組み合わせと比較しました7。さらに、Ast注射およびエリカプセルの最大無毒性濃度はそれぞれ12μM(アストラガロシドAによって計算)および5μM(スクテラリンによって計算)であり、アストラガロシドAおよびスクテラリンの最大無毒性濃度はそれぞれ20μMおよび50μMである7。これは、成分の組み合わせが製剤の組み合わせよりも安全であり、より制御可能な品質と高効率と低毒性の包括的な利点を備えていることを示しています。
脳虚血をシミュレートするために使用できる現在の細胞モデルには、主に物理的低酸素症(OGDによって誘発される)および化学的低酸素症(Na2S2O4またはCoCl2によって誘発される)が含まれる27。その中で、OGDおよびNa2S2O4傷害はいずれも低酸素時間が短く、慢性虚血のシミュレーションには適していない27。CoCl2誘発性低酸素症は、OGDおよび他の低酸素模倣物の使用と比較して最も一般的に使用される低酸素模倣物の1つである。それはROSによる持続的で安定した酸化的損傷をもたらし、異なる細胞株において典型的なアポトーシス変化を生じ得る27。したがって、この研究では、CoCl2を24時間使用して、ニューロン低酸素症をシミュレートしました28,29。そのモデリング濃度(0.1、0.2、0.4、および0.8 mM)および有効期間(1および7日)をスクリーニングした。さらに、脳虚血後のグルコースと酸素の必然的な不足を考えると、グルコースフリーおよび低酸素環境は脳虚血損傷をよりよくシミュレートすることができます。この研究は、0.4 mM CoCl2をグルコースフリー培地と24時間組み合わせることで、安定で制御可能な慢性低酸素細胞モデルを確立できることを示しました。フォローアップ研究では、慢性脳虚血の動物モデルを使用して、 in vivoでの成分の組み合わせの治療上の利点をさらに検証します。
この細胞モデルは、アポトーシス率、カスパーゼ-3蛍光強度、および細胞内ROSレベルを増加させることができ(図2 および 図4)、アポトーシス、酸化ストレスなどの慢性脳虚血の病理学的変化をよりよくシミュレートできます。このモデルに基づいて、2種類の組み合わせがアポトーシスと酸化ストレス損傷を抑制できることがわかりました。細胞生存の促進に対する成分の組み合わせの効果は、調製の組み合わせよりも有意に優れていました(図1)。どちらの組み合わせも、P-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、およびNrf2の発現レベルを異なる程度でアップレギュレートする可能性があります(図3 および 図4)。特に、成分の組み合わせは、Akt/Bcl-2/BaxおよびNrf2シグナル伝達経路のアップレギュレーションに対してより強い影響を及ぼしました。これらの結果は、成分の組み合わせが、より強い抗アポトーシスおよび抗酸化ストレスに関連する製剤の組み合わせよりも細胞損傷に強く抵抗できることを示しています。
結論として、これらの結果は、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を提供し、2つのハーブの組み合わせ適用モードを評価および最適化するための新しいアイデアを提供します。全体として、この研究は、TCMの有効成分の組み合わせを選択するための参照を提供します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、四川省科学技術局の主要な研究開発プロジェクト(2020YFS0325)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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