Summary
Denne protokollen gir en kombinasjonsstrategi av to urter for å behandle skadede PC12-celler. Protokollen gir en referanse for å optimalisere den beste applikasjonsmodusen for tradisjonell kinesisk medisin (TCM).
Abstract
I lys av fordelene ved kombinasjonen av tradisjonell kinesisk medisin (TCM) i behandlingen av cerebral iskemi, studerte vi forskjellene i effekt og mekanisme mellom preparatkombinasjonen og komponentkombinasjonen for å utforske de to urtekombinasjonsstrategiene for å behandle skadede PC12-celler. Koboltklorid (CoCl2) kombinert med et glukosefritt medium ble brukt for å indusere oksidativ skade på PC12-celler. Deretter ble den optimale kombinasjonen av Astragalus mongholicus (Ast) og Erigeron breviscapus (Eri ) injeksjon valgt og kombinert etter ensartede designmetoder etter screening av sikker og effektiv konsentrasjon på PC12-celler. Videre består komponentkombinasjonen av 10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin og 75 μM klorogen syre i to urter. Deretter ble MTT, Annexin V-FITC / PI, immunfluorescens og Western blot-analyse brukt til å evaluere effekten og mekanismen til preparatkombinasjonen og komponentkombinasjonen på skadede PC12-celler. Resultatene viste at den optimale kombinasjonen for celleoverlevelse var ASAT-injeksjon og Eri-kapsel med en konsentrasjon på 6:1,8 (μM). Komponentkombinasjonen (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin og 75 μM klorogen syre) var mer effektiv enn preparatkombinasjonen. Begge kombinasjonene reduserte bemerkelsesverdig apoptotisk hastighet, fluorescensintensiteten til caspase-3 og intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) nivå; I mellomtiden oppregulerte de uttrykksnivåene til p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax og Nrf2. Disse effektene var tydeligere i komponentkombinasjonen. Avslutningsvis kan begge kombinasjonene hemme skaden forårsaket av CoCl2 kombinert med et glukosefritt medium på PC12-celler, og dermed fremme celleoverlevelse. Imidlertid kan effektiviteten til komponentkombinasjonen over preparatkombinasjonen skyldes dens sterkere regulering av PI3K / Akt / Nrf2-signalveien relatert til oksidativt stress og apoptose.
Introduction
Kronisk cerebral iskemi, forårsaket av cerebral hypoperfusjon, er en vanlig sykdom hos middelaldrende og eldre mennesker1. Som en langvarig okkult iskemi sykdom, kan det føre til progressiv eller vedvarende nevrologisk dysfunksjon. De viktigste patologiske mekanismene inkluderer celleapoptose og oksidativ skade, noe som fører til progressiv eller vedvarende nevrologisk dysfunksjon; Dette er det patologiske grunnlaget for Alzheimers sykdom, vaskulær demens og andre sykdommer, og påvirker pasientens livskvalitet alvorlig. Imidlertid er det fortsatt mangel på ideelle stoffer i moderne medisin for å behandle kronisk cerebral iskemi2. Samtidig har kombinasjonen av Astragalus mongholicus (Ast) og Erigeron breviscapus (Eri ) blitt mye brukt i klinisk praksis av tradisjonell kinesisk medisin (TCM)4. Kombinasjonsstrategien har bemerkelsesverdig forbedret seg for å fremme utvinning av nervefunksjon etter cerebral iskemi, noe som er bedre enn for et enkelt stoff; Det er imidlertid store forskjeller i doseringsforholdet i kombinasjonen av de to legemidlene4. De effektive komponentene og virkningsmekanismen er ikke godt definert, noe som er nøkkelproblemet som begrenser den kliniske anvendelsen.
Tidligere studier har vist den synergistiske effekten av preparatkombinasjonen av Ast injeksjon og Eri injeksjon ved behandling av cerebral iskemi hos rotter. Det kan oppregulere uttrykket av p-Akt-protein og nedregulere uttrykket av Bcl-2-assosiert dødspromotor (BAD) protein5,6, som er et av B-lymfoblastom 2 (Bcl-2) familieproteinene og har effekten av å fremme apoptose. Det materielle grunnlaget og mekanismen for dens synergistiske effekt er imidlertid ikke klart. Videre ble skademodellen for PC12-celler etablert med CoCl2 kombinert glukosefritt medium, og den optimale komponentkombinasjonen i Ast og Eri er screenet og definert7.
I denne studien screenes de effektive dosene av Ast og Eri ved hjelp av den skadede PC12-cellemodellen. Den optimale kombinasjonen av de to legemidlene screenes ved hjelp av denne modellen kombinert med den homogene designmetoden. Cellemodellen brukes til å evaluere forskjellen i effektene og mekanismene til preparatkombinasjonen og komponentkombinasjonen i skadede PC12-celler. Denne strategien tar sikte på å utforske den beskyttende effekten og reguleringsmekanismen til de to typer kombinasjoner på skadede PC12-celler gjennom PI3K / Akt / Nrf2-signalveien for å bestemme den beste kombinasjonsmodusen. Denne studien gir en referanse for å optimalisere den beste applikasjonsmodusen til TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av reagens
- Forbered hele mediet ved å tilsette 90 ml DMEM høyt sukkermedium, 10 ml føtal bovint serum (FBS) og 1 ml penicillin-streptomycinoppløsning i en 125 ml steril kulturkolbe. Bland hele mediet, og oppbevar ved 4 °C under lukkede forhold.
- Klargjør CoCl 2-oppløsning ved å tilsette 0,02 g CoCl2 pulver (nøyaktig veid) i 10 ml DMEM sukkerfritt medium (oppløst fullstendig) for å oppnå en 8,4 ml stamløsning. Filtrer oppløsningen med et 0,22 μm bakteriefilter, forsegl den og oppbevar den ved 4 °C, beskyttet mot lys.
MERK: CoCl2 er ustabil og skal oppbevares i en lufttett beholder, beskyttet mot lys; gyldighetsperioden for CoCl2-løsningen er 7 dager. - Forbered Tris-HCL bufret saltløsning (TBST).
- Nøyaktig veie 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid og 3 g Tris-base. Legg dem i et 1 L beger, og tilsett deretter 1000 ml RO-vann for å oppløse blandingen.
- Juster pH til 7,4, tilsett 1 ml Tween 20, og bland grundig for å oppnå TBST-oppløsningen.
MERK: Tween 20 fungerer som et overflateaktivt middel for å redusere den uspesifikke bindingen av antistoffer mot antigener og fungerer best ved 0,1% konsentrasjon.
- Klargjør MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2)-2,5-difenyltetrazoliumbromidsalt) oppløsning ved å veie 0,1 g MTT-pulver i 20 ml PBS-oppløsning for å oppnå en 5 mg/ml stamløsning. Filtrer oppløsningen med et 0,22 μm bakteriefilter, forsegl den og oppbevar den ved 4 °C fra lys, satt i standby.
MERK: MTT-pulver er ustabilt og absorberer lett fuktighet, så det bør oppbevares på et lukket og tørt sted borte fra lys. MTT-løsningen utløper etter 7 dager. MTT har kreftfremkallende effekt, så unngå direkte kontakt med huden. - Klargjør Eri kapseloppløsning ved å fjerne kapselskallet og veie 0,18 g av innholdet nøyaktig i 10 ml DMEM sukkerfritt medium for å fremstille en 100 μM stamløsning (basert på konsentrasjonen av scutellarin). Filtrer oppløsningen med et 0,2 μm bakteriefilter, forsegl den og oppbevar den i en lufttett beholder ved 4 °C.
MERK: Scutellarin er den viktigste aktive ingrediensen i Erigeron breviscapus. Konsentrasjonen av scutellarin i kapslene er bestemt av HPLC-UV til å være 2,56 mg/g, dvs. 5,54 μmol/g8. Konsentrasjonen av preparatet beregnes ut fra scutellarinkonsentrasjonen. Dette er praktisk for å evaluere preparatets farmakologiske aktivitet og komponenten. - Klargjør oppløsningen av Ast-injeksjonen ved å tilsette 5 ml injeksjon og 5 ml sukkerfritt DMEM-medium i et 15 ml sterilt sentrifugerør for å fremstille en 60 μM stamløsning (basert på konsentrasjonen av astragalosid A). Filtrer oppløsningen gjennom et 0,2 μm bakteriefilter, og oppbevar den i en lufttett beholder ved 4 °C.
MERK: Injeksjonsvolumet er 10 ml hver, og konsentrasjonen av astragalosid A i injeksjonen er bestemt av HPLC-ELSD til å være 0,094 mg/ml (dvs. 120 μM)9. Preparatet skal utføres i et biosikkerhetsskap og betjenes på en lystett måte hele tiden. Volumet av injeksjonsoppløsningen og det sukkerfrie mediet skal måles nøyaktig og blandes godt. - Forbered astragaloside A-løsning ved nøyaktig veiing av 7,85 mg astragalosid A-standard og oppløsning fullstendig i 2 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å fremstille en 5000 μM stamløsning. Filtrer det med et 0,22 μm bakteriefilter og oppbevar det lufttett ved 4 °C.
MERK: Astragaloside Et pulver er uoppløselig i det sukkerfrie mediet. Ved tilberedning av oppløsningen skal den oppløses med riktig mengde DMSO for å holde den endelige eksperimentelle konsentrasjonen av DMSO under 0,1 % for å sikre ingen cytotoksisitet. - Forbered scutellarinoppløsningen ved å veie 11,56 mg scutellarinstandard nøyaktig og fullstendig oppløse den med 5 ml sukkerfritt DMEM-medium for å fremstille en 5000 μM stamløsning. Filtrer det med et 0,22 μm bakteriefilter og oppbevar det lufttett ved 4 °C.
- Forbered klorogensyreoppløsningen ved å veie 8,86 mg klorogen syrestandard nøyaktig og fullstendig oppløse den med 5 ml sukkerfritt DMEM-medium for å fremstille en 5000 μM stamløsning. Filtrer det med et 0,22 μm bakteriefilter og oppbevar det lufttett ved 4 °C.
MERK: Klorogensyrepulver er ustabilt og absorberer lett vann. Den bør forsegles og oppbevares ved 4 °C, beskyttet mot lys. Eksponeringstiden bør minimeres under veiing.
2. Celle levedyktighetsanalyse
- Få PC12-celler og dyrk dem i DMEM supplert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
MERK: I denne studien er cellene hentet fra det kinesiske vitenskapsakademiet. PC12-celler er adherente celler som har de generelle egenskapene til nevroendokrine celler og er mye brukt i nevrofysiologi og nevrofarmakologi. - Dyrk cellene ved 37 ° C i en inkubator supplert med 5% CO 2 og subkultur dem hver2-3 dager. Bruk celler i passasje 4-8 for alle eksperimenter.
- Cellekultur
- Behandle PC12-celler i den logaritmiske vekstfasen (70% -80% cellekonfluens) med 1 ml trypsin (0,25%) og observere cellene under et mikroskop. Når cellene blir runde, stopp trypsinfordøyelsen ved å tilsette 3 ml av hele mediet.
- Overfør cellene til et sterilt 15 ml sentrifugerør og sentrifuge cellene ved 840 x g i 5 minutter. Kast supernatanten, resuspender med hele mediet og overfør cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Tell deretter antall celler ved hjelp av et flowcytometer.
- Start flowcytometriprogramvaren, velg det tilsvarende fortynningsmultiplumet av celleløsningen i telleinnstillingen, og klikk på Tetthetsdiagram etter å ha lastet celleprøven fra 1,5 ml mikrosentrifugerøret.
- Sett ring rundt cellepopulasjonen bort fra X-aksen og Y-aksen, høyreklikk datatabellen under figuren, og velg X, Y, Antall og Abs-antall. Dataene under Abs Count i datatabellen gir resultatet av celletellingen.
- Juster cellekonsentrasjonen til 1 x 10 5 celler / ml, inokuler 100 μL / brønn i 96-brønnsplater og kultur ved 37 ° C og5 % CO2 i en inkubator i 24 timer.
- Screening av sikre konsentrasjoner av to legemidler på normale PC12-celler
- Dyrk cellene som beskrevet i trinn 2.1-2.2. Kast supernatanten og behandle de normale cellene med forskjellige endelige konsentrasjoner av Ast injeksjon (4, 8, 12, 16, 20 og 24 μM) og Eri kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 og 20 μM). Behandle seks replikasjonsbrønner i hver gruppe i 24 timer.
MERK: Legemidlene tilsettes mediet for å oppnå den endelige konsentrasjonen av legemidlet (nevnt i trinn 2.4.1), og deretter tilsettes et likt volum media til hver brønn. Ved aspirasjon av supernatanten skal pipettespissen plasseres forsiktig mot brønnveggen for å unngå å komme i kontakt med cellene i bunnen av brønnen. Når du legger til forskjellige løsninger, legg dem forsiktig og raskt langs kantene på brønnene, og vær oppmerksom når du bytter pipettepistolhodet for å unngå å påvirke de eksperimentelle resultatene. - Kast supernatanten, tilsett 120 mikrol MTT-oppløsning (1 mg/ml) i hver brønn og inkuber cellene i 4 timer ved 37 °C.
- Etter inkubasjonen, kast supernatanten igjen og tilsett 150 μL DMSO til hver brønn. Rist platen i 10 minutter med en hastighet på 240 ganger / min (antall horisontale vibrasjoner per minutt) ved hjelp av en virveloscillator.
- Mål absorbansen til hver prøve ved 490 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Beregn cellens levedyktighet (%), som er absorbans av den behandlede gruppen/absorbans av normal gruppen (kontroll) x 100.
MERK: Kontroller at MTT-løsningen er innenfor gyldighetsperioden; Hvis fargen har endret seg (til mørkegrønn), kan den ikke brukes. Ved testing av absorbans av celler, bør en tom brønn (kulturmedium og MTT, uten celler eller legemidler) settes for å eliminere interferens av andre reagenser. Et volum på 150 μL DMSO tilsettes hver brønn og ristes i 10 minutter for å oppløse de blålilla krystallene bedre. Absorbansen bør detekteres så snart som mulig for å sikre nøyaktigheten av resultatene.
- Dyrk cellene som beskrevet i trinn 2.1-2.2. Kast supernatanten og behandle de normale cellene med forskjellige endelige konsentrasjoner av Ast injeksjon (4, 8, 12, 16, 20 og 24 μM) og Eri kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 og 20 μM). Behandle seks replikasjonsbrønner i hver gruppe i 24 timer.
- Screening av effektive konsentrasjoner av to legemidler på skadde PC12-celler
- Dyrk cellene i 24 timer som nevnt i trinn 2.1-2.2, kast supernatanten, og behandle deretter cellene med 20 μL/brønnCoCl2 (0,4 mM) kombinert med det sukkerfrie mediet.
- Behandle cellene samtidig med 100 μL/brønn Ast-injeksjon (endelige konsentrasjoner er 2, 6, 8, 10 og 12 μM) eller 100 μL Eri-kapsel (endelige konsentrasjoner er 1, 2, 3, 4 og 5 μM) ved 37 °C i ytterligere 24 timer. Legg til 120 μL/brønn komplett medium i kontrollgruppen.
MERK: CoCl2 induserer hypoksiske forhold i cellene. - Mål absorbansen til hver prøve ved hjelp av MTT-metoden og beregne cellens levedyktighet som beskrevet tidligere i trinn 2.4.2 og 2.4.3.
- Screening av den optimale kombinasjonen av to legemidler basert på den homogene designmetoden
MERK: Etter å ha oppnådd det effektive konsentrasjonsområdet for Astragalus-injeksjonen og breviscapuskapselen, ble den ensartede designmetoden U 7 (7 ,4) brukt til å oppnå seks forskjellige kombinasjoner av de to legemidlene. AST injeksjon: Eri kapsel: 1) 2: 2, 6 μM, 2) 4: 5 μM, 3) 6: 1, 8 μM, 4) 8: 4, 2 μM, 5) 10: 1 μM og 6) 12: 3, 4 μM.- Dyrk cellene som beskrevet ovenfor i trinn 2.3.1, og behandle de skadede PC12-cellene med seks proporsjonskonsentrasjoner av Ast-injeksjon: Eri kapsel som nevnt ovenfor.
- Behandle cellene i 24 timer og beregne cellens levedyktighet som beskrevet tidligere i trinn 2.4.2 og 2.4.3.
- Evaluering av den beskyttende effekten av to optimale kombinasjoner på skadede PC12-celler
MERK: Etter å ha oppnådd den optimale preparatkombinasjonen (Ast injeksjon: Eri kapsel på 6: 1,8 μM) og den optimale komponentkombinasjonen7 (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellinin og 75 μM klorogen syre), utføres ytterligere evaluering for å kontrollere deres beskyttende effekter på skadede PC12-celler.- Dyrk cellene som beskrevet ovenfor i trinn 2.3.1, og behandle de skadde PC12-cellene med de to typer kombinasjoner av legemidler som diskutert i NOTE ovenfor.
- Behandle cellene i 24 timer og beregne cellens levedyktighet som beskrevet tidligere i trinn 2.4.2 og 2.4.3.
3. Vedlegg V-FITC / PI-analyse for apoptoserate
- Frø PC12-cellene i en 12-brønnsplate i en konsentrasjon på 1,3 x 105 celler / brønn og dyrk dem ved 37 ° C i 24 timer.
- Grupper cellene: kontrollgruppe, modellgruppe og to kombinasjoner av legemidler. Legg til 1,2 ml/brønn komplett medium i kontrollgruppen, tilsett 1,2 ml/brønn medier inneholdende 0,4 mM CoCl 2 i modellgruppen, og tilsett 1,2 ml/brønn for hver av de to kombinasjonene som inneholder 0,4 mM CoCl2. Inkuber cellene ved 37 °C i ytterligere 24 timer.
- Etter medikamentell behandling, behandle cellene med 250 μL / brønn trypsin, overføre cellene i et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 840 xg i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og resuspender pelleten i 500 mikrol av bindingsbufferen.
- Inkuber cellene i mørket med 5 μL Annexin V-FITC og 10 μL propidiumjodid (PI) i 15 minutter ved RT, og sjekk deretter for apoptose ved flowcytometri. Sett tre replikasjonsbrønner i hver gruppe.
MERK: Trypsinet som brukes i denne testen kan ikke inneholde EDTA fordi EDTA er et metallionchelaterende middel som konkurrerer med vedlegg V for å binde kalsiumioner og påvirker affiniteten til vedlegg for PI. Når apoptose oppstår, vender fosfoserin, opprinnelig på innsiden av cellemembranen, utover til celleoverflaten, og Annexin V-FITC binder seg selektivt til fosfoserin utenfor membranen for å vise grønn fluorescens. - Klikk på Automatisk kompensasjon i Start-menyen , velg FITC, PE, PerCP og APC i Velg-kanalen , og velg Kompensasjon på: Høyde. Klikk OK i det statistiske elementet: median. Med samme celletellingsmetode som nevnt i trinn 2.3.2, samle celleprøvene, klikk på tetthetskartet og sirkle den effektive cellepopulasjonen.
- Med FITC-fluorescens som X-akseparameter, og andre fluorescensparametere som Y-akseparameter, lager du et tetthetskart. Klikk på Kompensasjonsmatrise i Start-menyen og Koeffisient i overløpsmatrisen. Tetthetskartinformasjonen vises for analyse av apoptosehastigheten.
- Inkuber cellene i mørket med 5 μL Annexin V-FITC og 10 μL propidiumjodid (PI) i 15 minutter ved RT, og sjekk deretter for apoptose ved flowcytometri. Sett tre replikasjonsbrønner i hver gruppe.
4. Immunfluorescensdeteksjon av caspase-3 generasjon
- Frø PC12-cellene på deksler med en tetthet på 8 x 104 celler/dekkslipp og legg dem i 24-brønnsplater ved 37 °C i 24 timer. Grupper cellene som nevnt ovenfor i trinn 3.2; Sett opp tre replikere coverslips for hver gruppe.
- Etter medikamentell behandling, skyll dekselene to ganger med PBS (37 ° C) i 5 min hver, fest dem med 4% paraformaldehyd i 15 min, og permeabiliser med 0,5% Triton X-100 i 20 minutter ved RT.
- Skyll cellene igjen og blokker dem med 10% geitserum i 1 time ved RT.
- Inkuber hver dekkslipp med 200 μL primært antistoff caspase-3 (et sentralt utøvende protein for apoptose) fortynnet i en konsentrasjon på 1:250 i 1x TBST, over natten ved 4 °C. Vask med 1x TBST (tre ganger i 3 minutter hver), og inkuber med 200 μL sekundært antistoff (1:300 fortynning i 1x TBST) i 1 time ved RT i mørket.
MERK: Fluorescensen slukkes lett; Således, etter inkubering av det sekundære antistoffet, bør lysbildene holdes vekk fra lys. De primære og sekundære antistoffene bør oppbevares ved 4 °C, beskyttet fra lys. - Tilsett 300 μL DAPI (0,5 μg / ml) til dekselene (for å oppdage kjernene) i 10 minutter og vask cellene tre ganger med 1x TBST i 5 minutter hver.
- Observer dekslene under fluorescensmikroskopet og ta bilder10. Utfør statistisk analyse av fluorescensintensiteten ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren.
MERK: Lysbildene og dekslene som brukes, skal være rene og sterile. Når du farger, vær oppmerksom på pH, konsentrasjon og temperatur på fargeløsningen, og unngå fluorescensslukking. Det fluorescerende mikroskopet bør slås på minst 15 minutter på forhånd for å forvarme kvikksølvlampen og slås av i 30 minutter før det slås på igjen. Ved anskaffelse av bilder bør eksponeringsparametrene for samme fargestoff i samme gruppe eksperimenter være konsistente for å sikre nøyaktigheten av resultatene.
5. Immunfluorescensanalyse av ROS-nivå
- Dyrkning og behandle cellene som diskutert i trinn 4.1.
- Etter medikamentell behandling, vask hver dekkslipp tre ganger med PBS i 3 minutter, og inkuber med 400 μL DCFH-DA (10 μM) ved 37 °C i 20 minutter.
MERK: DCFH-DA er en universell indikator på oksidativt stress. Den har cellemembranpermeabilitet og ingen fluorescens. Når den kommer inn i cellen, hydrolyseres den av esterase for å produsere 2',7'-diklordihydrofluorescein (DCFH) og oksideres deretter raskt for å produsere et sterkt fluorescerende produkt. - Vask cellene igjen med serumfri DMEM (to ganger i 3 minutter hver) og følg umiddelbart dekselet etter tilsetning av fluorescensslukkemiddelet under fluorescensmikroskopet. Beregn den relative fluorescensintensiteten av bildebehandlingsprogramvaren.
MERK: Etter at du har lastet DCFH-DA-sonden, må du rengjøre den gjenværende sonden som ikke kommer inn i cellen, ellers blir bakgrunnen høy.
6. Western blot deteksjon av protein ekspresjon av Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2, og Bax11,12
- Inokuler PC12-celler i 6-brønnsplater i en konsentrasjon på 1 x 106 celler/brønn og kultur ved 37 °C i 24 timer. Grupper og behandle cellene som nevnt i trinn 4.1, og sett tre replikatbrønner i hver gruppe.
- Etter medikamentell behandling i 24 timer, vask cellene tre ganger med PBS i 5 min hver og inkuber på is i 30 min i forberedt lysisbuffer. Etter lysis, sentrifuger cellene i 20 minutter ved 16.000 x g og 4 ° C og samle supernatantene.
- Oppdag proteinkonsentrasjonen og juster i henhold til instruksjonene gjennom Bradford-analysen. Fortynn prøvene og denaturer ved 100 °C i 10 minutter.
MERK: Lysisbufferen består av fosfatasehemmer, proteasehemmer og RIPA-lysat i et volumforhold på 1:1:50. I kontrollgruppen kreves 200 μL/brønn lysisbuffer, og det kreves 100 μL/brønn lysisbuffer i de andre gruppene. Generelt er proteinkonsentrasjonene av kontroll, modell og to typer kombinasjonsgrupper henholdsvis 0,45 mg / ml, 0,25 mg / ml og 0,32-0,39 mg / ml; Proteinkonsentrasjonene etter fortynning med startbufferen er henholdsvis 0,36, 0,2 og 0,256-0,312 mg/ml. - For å oppdage proteiner med forskjellige molekylvekter, last 25 μg protein i hver bane, kjør en 12% SDS-PAGE elektroforese og overfør gelen til PVDF-membraner.
MERK: Under fremstilling av SDS-gel må den blandes fullstendig uten bobler eller uoppløselige partikler; Ellers kan det oppstå ujevne eller uregelmessige bånd. Når du overfører membranene, må du sørge for at det ikke er bobler mellom PVDF-membranen og gelen; Ellers vises hvite flekker i stripen. I tillegg må dette trinnet utføres ved lave temperaturer, og isposen skal skiftes hvert 30. minutt. - Blokker membranene med 5% fettfri melk i 1,5 timer ved RT og inkuber med 5 ml av de tilsvarende primære antistoffene (Nrf2 1: 1,000, Akt 1: 2,000, p-Akt 1: 2,000, Bcl-2 1: 5,000 og Bax 1: 1,000) i 24 timer ved 4 ° C. Bruk β-aktin (1:5000) antistoff som internkontroll.
- Vask membranene med TBST (tre ganger i 10 minutter hver), inkuber deretter med 5 ml sekundære HPR-konjugerte antistoffer (1:5000) ved RT i 2 timer.
MERK: Fortynningsforholdet mellom antistoffene bør ikke endres vilkårlig, og membranene skal vaskes med TBST tilstrekkelig i strengt samsvar med kravene for å unngå at bakgrunnsfargen på båndet blir for svart. - Til slutt, vask membranen med TBST igjen, og behandle den med kjemiluminescerende HRP-substrat (i henhold til produsentens instruksjoner) for proteinbånddeteksjon. Ta bildene ved hjelp av kjemiluminescensavbildningssystemet og kvantifiser de grå verdiene til proteinene ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren, med β-aktin som komparativ internkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screening av optimal kombinasjon av Ast injeksjon og Eri kapsel er vist i figur 1. Celleoverlevelsen av Ast-injeksjon og Eri-kapsel på de normale PC12-cellene er vist i figur 1A. Cellens levedyktighet var lavere enn 95 % med ASAT-injeksjon ved konsentrasjoner større enn 12 μM (figur 1A) og Eri-kapsel ved konsentrasjoner større enn 5 μM (figur 1A), noe som indikerer at maksimal ikke-toksisk konsentrasjon var henholdsvis 12 μM og 5 μM. Deres cytotoksisitet var større enn for astragalosid A og scutellarin brukt alene. Levedyktigheten til Ast-injeksjon og Eri-kapsel på de skadede PC12-cellene indusert av CoCl2 er vist i figur 1B,C. Sammenlignet med modellgruppen kan ASAT-injeksjon forbedre overlevelsesraten til de skadede PC12-cellene i konsentrasjonsområdet 6-12 μM (p < 0,05 eller p < 0,01), og Eri-kapsler i konsentrasjonen 2-5 μM kan forbedre overlevelsesraten (p < 0,05 eller p < 0,01). Ast-injeksjon og Eri kapsel i forholdet 10: 1, 8: 4.2 og 6: 1.8 μM kan øke levedyktigheten til skaden PC12-celler (p < 0.01) (figur 1D). Forholdet på 6: 1, 8 μM viste den høyeste cellelevedyktigheten, noe som indikerer at det er den optimale preparatkombinasjonen og farmakologisk aktivitet sammenlignet med den beste komponentkombinasjonen.
Evalueringen av de beskyttende effektene av to typer kombinasjoner på de skadde PC12-cellene er vist i figur 2. Sammenlignet med modellgruppen ble cellelevedyktigheten til de to kombinasjonene signifikant fremmet (p < 0,001), og komponentkombinasjonen var bedre enn preparatkombinasjonen (figur 2A). Dette antyder at komponentkombinasjonen kan fremme celleoverlevelse bedre enn preparatkombinasjonen. Apoptoseraten ble testet med flowcytometri (figur 2B,C). Sammenlignet med normalgruppen var prosentandelen av tidlige, sene og totale apoptotiske celler signifikant høyere i modellgruppen (p < 0,01 eller p < 0,001 ). Sammenlignet med modellgruppen var prosentandelene av apoptotiske celler i hvert stadium signifikant lavere i behandlingsgruppene (p < 0,05 eller p < 0,01 eller p < 0,001). Fluorescensintensiteten av caspase-3-proteinuttrykk i hver gruppe er vist i figur 2D,E. Sammenlignet med normalgruppen var fluorescensintensiteten til caspase-3 signifikant høyere i modellgruppen. Sammenlignet med modellgruppen var fluorescensintensiteten av caspase-3 signifikant lavere i hver behandlingsgruppe (p < 0,001 eller p < 0,01 ) og var relativt lavere i komponentkombinasjonsgruppen enn i kombinasjonsgruppen for preparat. Disse resultatene tyder på at cellemodellen kan indusere apoptose, og anti-apoptoseeffekten av komponentkombinasjonen er bedre enn for preparatkombinasjonen.
Western blot påviste proteinuttrykket p-Akt, Akt, Bcl-2 og Bax (figur 3). Sammenlignet med normalgruppen var ekspresjonsnivåene av p-Akt/Akt og Bcl-2/Bax signifikant lavere i modellgruppen (p < 0,01 eller p < 0,001). Sammenlignet med modellgruppen var uttrykket av p-Akt/Akt og Bcl-2/Bax signifikant høyere i de to kombinasjonene (p < 0,05 eller p < 0,01 eller p < 0,001), spesifikt høyere i komponentkombinasjonen. Resultatene tyder på at komponentkombinasjonen er overlegen preparatkombinasjonen når det gjelder å fremme celleoverlevelse, noe som er relatert til den sterkere antiapoptoseeffekten som produseres ved å oppregulere Akt / Bcl-2 / Bax-signalveien.
Fluorescensen av DCFH kan måles med et fluorescensmikroskop for å bestemme nivået av ROS i cellene (figur 4A, B). Som vist i figur 4A var fluorescensen nesten usynlig i normalcellene, og fluorescensen i modellgruppen ble signifikant forbedret. Fluorescensen i begge kombinasjonene var signifikant redusert sammenlignet med modellgruppen. Som vist i figur 4B var den relative fluorescensintensiteten signifikant svakere i hver behandlingsgruppe sammenlignet med modellgruppen (p < 0,001). Fluorescens hadde en tendens til å avta i komponentkombinasjonsgruppen sammenlignet med preparatkombinasjonsgruppen, noe som indikerer at cellemodellen kan indusere oksidativ skade. Den antioksidative skadeeffekten av komponentkombinasjonen er bedre enn for preparatkombinasjonen.
Western blot oppdaget uttrykket av Nrf2-proteinet (figur 4C). Sammenlignet med normalgruppen var uttrykket av Nrf2 signifikant redusert i modellgruppen (p < 0,05). Sammenlignet med modellgruppen var ekspresjonen av Nrf2-protein signifikant høyere i behandlingsgruppene (p < 0,01 eller p < 0,05 ), spesifikt høyere i komponentkombinasjonsgruppen (figur 4D). Dette antyder at komponentkombinasjonen er bedre enn preparatkombinasjonen for å fremme celleoverlevelse, noe som er relatert til den sterkere antioksidative skaden som produseres ved å oppregulere Nrf2-signalveien.
Avslutningsvis kan komponentkombinasjonen (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin og 75 μM klorogen syre) fremme overlevelsen av skadede celler bedre enn preparatkombinasjonen (6 μM Ast-injeksjon og 1,8 μM Eri kapsel) gjennom sterkere regulering av signalveier relatert til apoptose og oksidativ skade.
SPSS statistisk programvare 26.0 ble brukt til statistisk analyse, og alle data er uttrykt som middel ± standardavvik (SD). For sammenligninger mellom grupper ble dataene evaluert av en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys test. p < 0,05 ble ansett å indikere en statistisk signifikant forskjell.
Figur 1: Effekter av legemidler på levedyktigheten til normale og skadede PC12-celler. (A) Effekter av ulike konsentrasjoner av Ast injeksjon og ulike konsentrasjoner av Eri kapsel på normale PC12 celler. (B) Screening av effektiv konsentrasjon av ASAT-injeksjon på skadede PC12-celler. (C) Screening av effektiv konsentrasjon av Eri kapsel på skadede PC12 celler. (D) Effekter av kombinasjonene av to legemidler i forskjellige proporsjoner på overlevelsesraten til skadede PC12-celler. Statistiske verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SD fra seks uavhengige eksperimenter. &&p < 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. *p < 0,05 og **p < 0,01 sammenlignet med modellgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av to kombinasjoner på overlevelse og apoptose av skadde PC12-celler. (A) Effekt av komponentkombinasjonen og preparatkombinasjonen på overlevelsesraten til skadede PC12-celler. (B) Graf over apoptoserate påvist i vedlegg V-PI. (C) Statistisk histogram for apoptoserate. (D) Den relative fluorescensintensiteten av caspase-3 proteinuttrykk (400x). Skala barer: 20 μm. (E) Statistisk histogram av fluorescensintensitet av caspase-3 proteinuttrykk. Statistiske verdier uttrykkes som gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, bortsett fra cellelevedyktighet for seks uavhengige eksperimenter. *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001 sammenlignet med modellgruppen. ##p < 0,01 sammenlignet med preparatkombinasjonsgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av de to kombinasjonene på ekspresjonsnivåene av p-Akt, Akt, Bcl-2 og Bax. (A) Proteinuttrykk av p-Akt og Akt bestemt av Western blot-analyse. (B) Statistisk histogram for p-Akt/Akt-forholdsstatistikk i hver gruppe. (C) Proteinuttrykk av Bcl-2 og Bax bestemt av Western blot-analyse. (D) Statistisk histogram for Bcl-2/Bax-forholdet i hver gruppe. Statistiske verdier uttrykkes som gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001 sammenlignet med modellgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekt av to kombinasjoner på Nrf2-proteinuttrykk og ROS-nivå. (A) Nivåer av ROS ble detektert ved fluorescensmikroskopi (400x). Skalastenger: 20 μm. (B) Statistisk histogram for ROS-fluorescensintensitet i hver gruppe. (C) Nrf2 proteinuttrykk bestemt ved Western blot-analyse. (D) Statistisk histogram for Nrf2-proteinuttrykk. Statistiske verdier uttrykkes som gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001 sammenlignet med modellgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er fortsatt mangel på ideelle stoffer for behandling av cerebral iskemi i moderne klinisk praksis2. Under veiledning av supplere qi og aktivere blodsirkulasjonsmetoden, har Ast, Eri og andre preparater blitt brukt i kombinasjon i klinisk praksis av TCM og har oppnådd gode omfattende fordeler13,14,15. Et stort antall studier har vist at Ast kan forbedre permeabiliteten til blod-hjernebarrieren, øke cerebral blodstrøm, forbedre nervecellenes evne til å tolerere hypoksi og motstå oksygenfrie radikaler, og kan forbedre nevrologisk dysfunksjonbetydelig 16,17. Det er spesielt egnet for senil iskemisk cerebrovaskulær sykdom16,17. Eri kan utvide blodårene, øke blodtilførselen til hjernen, fjerne ROS og redusere lipidperoksidasjon18,19. Imidlertid er den synergistiske effekten, farmakodynamiske komponenter og mekanismen for kombinasjonen av de to legemidlene fortsatt uklare, noe som er et vanlig problem som begrenser den kliniske anvendelsen av TCM.
Det iskemiske og hypoksiske miljøet ved kronisk cerebral iskemi induserer oksidativ stressskade og aktiverer samtidig hjernecelleapoptosesignalveien for å fremme nevronal apoptose20,21. PI3K / Akt-banen er en klassisk anti-apoptotisk og pro-overlevelse signaltransduksjonsvei22,23, blant hvilke Bcl-2-familieproteiner og caspasefamilien er nedstrøms utøvende proteiner i denne signalveien. Fosforylert Akt kan direkte eller indirekte regulere Bcl-2-familien og hemme aktivering av nedstrømsbanen caspase-3, og derved utøve en anti-apoptotisk effekt11. I tillegg kan overflødig ROS generert av hypoksi indusere oksidativ stressskade, mens fosforylert Akt kan aktivere Nrf2 for å eliminere overflødig ROS for å bekjempe oksidativ stressskade12,24. Derfor kan aktivering av PI3K / Akt / Nrf2-banen effektivt forhindre og kontrollere oksidativt stress og apoptose, og dermed redusere hypoksisk-iskemisk hjerneskade25,26.
I studien ble preparatkombinasjonen screenet ved hjelp av den skadde PC12-cellemodellen, og effekten og mekanismen i denne modellen ble sammenlignet med komponentkombinasjonen screenet tidligere7. I tillegg er maksimal ikke-toksisk konsentrasjon av Ast-injeksjon og Eri kapsel henholdsvis 12 μM (beregnet av astragaloside A) og 5 μM (beregnet av scutellarin), mens den maksimale ikke-toksiske konsentrasjonen av astragalosid A og scutellarin er henholdsvis 20 μM og 50 μM, henholdsvis7. Det viser at komponentkombinasjonen er tryggere enn preparatkombinasjonen, med mer kontrollerbar kvalitet og omfattende fordeler med høy effektivitet og lav toksisitet.
De nåværende cellemodellene som kan brukes til å simulere cerebral iskemi, inkluderer hovedsakelig fysisk hypoksi (indusert av OGD) og kjemisk hypoksi (indusert avNa2S2O4ellerCoCl2)27. Blant dem har både OGD og Na 2 S2O4 skaderkort hypoksitid og er ikke egnet for å simulere kronisk iskemi27. CoCl 2-indusert hypoksi er en av de mest brukte hypoksietterligningene sammenlignet med OGD og bruk av andre hypoksietterligninger. Det kan føre til vedvarende og stabil oksidativ skade av ROS og produsere typiske apoptotiske forandringer i forskjellige cellelinjer27. Derfor ble CoCl2 i denne studien brukt i 24 timer for å simulere nevronal hypoksi28,29. Modelleringskonsentrasjonen (0,1, 0,2, 0,4 og 0,8 mM) og validitetsperioden (1 og 7 dager) ble screenet. I tillegg, gitt den uunngåelige mangelen på glukose og oksygen etter cerebral iskemi, kan det glukosefrie og hypoksiske miljøet bedre simulere cerebral iskemisk skade. Denne studien viste at 0,4 mM CoCl2kombinert med et glukosefritt medium i 24 timer kunne etablere en stabil og kontrollerbar kronisk hypoksisk cellemodell. I oppfølgingsstudien vil dyremodellen for kronisk cerebral iskemi bli brukt til ytterligere å validere de terapeutiske fordelene ved komponentkombinasjonen in vivo.
Denne cellemodellen kan øke apoptosehastigheten, caspase-3-fluorescensintensiteten og intracellulært ROS-nivå (figur 2 og figur 4), som bedre kan simulere de patologiske endringene i kronisk cerebral iskemi, som apoptose, oksidativt stress, etc. Basert på denne modellen ble det funnet at de to typer kombinasjoner kan hemme apoptose og oksidativ stressskade. Effekten av komponentkombinasjonen på å fremme celleoverlevelse var signifikant bedre enn for preparatkombinasjonen (figur 1); begge kombinasjonene kan oppregulere uttrykksnivåene av P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax og Nrf2 i forskjellige grader (figur 3 og figur 4). Spesielt hadde komponentkombinasjonen en sterkere effekt på oppreguleringen av Akt/Bcl-2/Bax og Nrf2 signalvei. Disse resultatene indikerer at komponentkombinasjonen bedre kan motstå celleskader enn preparatkombinasjonen, som er relatert til sterkere anti-apoptose og antioksidativt stress.
Avslutningsvis gir disse resultatene en kombinasjonsstrategi av to urter for å behandle skadede PC12-celler og gir en ny ide for å evaluere og optimalisere den kombinerte applikasjonsmodusen til to urter. Samlet sett gir denne studien en referanse for valg av aktiv komponentkombinasjon av TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av viktige FoU-prosjekter fra Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
