Summary
Este protocolo fornece uma estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O protocolo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação da medicina tradicional chinesa (MTC).
Abstract
Tendo em vista as vantagens da combinação da medicina tradicional chinesa (MTC) no tratamento da isquemia cerebral, estudamos as diferenças na eficácia e no mecanismo entre a combinação de preparação e a combinação de componentes, a fim de explorar a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O cloreto de cobalto (CoCl2) combinado com um meio livre de glicose foi empregado para induzir danos oxidativos das células PC12. Em seguida, a combinação ideal de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) foi selecionada e combinada seguindo métodos de design uniformes após a triagem de sua concentração segura e eficaz em células PC12. Além disso, a combinação de componentes rastreados compreende 10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico em duas ervas. Em seguida, MTT, anexina V-FITC/PI, imunofluorescência e Western blot foram utilizados para avaliar a eficácia e o mecanismo da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Os resultados mostraram que a combinação de preparação ideal para a pró-sobrevivência celular foi a injeção de Ast e a cápsula de Eri com uma concentração de 6:1,8 (μM). A combinação de componentes (10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico) foi mais eficaz do que a combinação de preparação. Ambas as combinações reduziram notavelmente a taxa apoptótica, a intensidade de fluorescência da caspase-3 e o nível de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular; enquanto isso, eles regularam positivamente os níveis de expressão de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax e Nrf2. Esses efeitos foram mais evidentes na combinação de componentes. Em conclusão, ambas as combinações podem inibir a lesão induzida pela CoCl2 combinada com um meio livre de glicose nas células PC12, promovendo assim a sobrevivência celular. No entanto, a eficiência da combinação de componentes sobre a combinação de preparação pode ser devida à sua regulação mais forte da via de sinalização PI3K/Akt/Nrf2 relacionada ao estresse oxidativo e à apoptose.
Introduction
A isquemia cerebral crônica, causada por hipoperfusão cerebral, é uma doença comum em pessoas de meia-idade e idosos1. Como uma doença de isquemia oculta a longo prazo, pode levar a disfunção neurológica progressiva ou persistente. Os principais mecanismos patológicos incluem apoptose celular e dano oxidativo, levando a disfunção neurológica progressiva ou persistente; esta é a base patológica da doença de Alzheimer, demência vascular e outras doenças, e afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, ainda há uma falta de drogas ideais na medicina moderna para tratar a isquemia cerebral crônica2. Ao mesmo tempo, a combinação de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) tem sido amplamente utilizada na prática clínica da medicina tradicional chinesa (MTC)4. A estratégia de combinação melhorou notavelmente na promoção da recuperação da função nervosa após isquemia cerebral, que é melhor do que a de uma única droga; no entanto, existem grandes diferenças na razão de dosagem na combinação das duas drogas4. Os componentes efetivos e o mecanismo de ação não estão bem definidos, o que é a questão-chave que restringe sua aplicação clínica.
Estudos anteriores demonstraram o efeito sinérgico da combinação de preparação da injeção de Ast e da injeção de Eri no tratamento da isquemia cerebral em ratos. Pode regular positivamente a expressão da proteína p-Akt e regular negativamente a expressão da proteína promotora de morte associada (TAB)Bcl-2 5,6, que é uma das proteínas da família do linfoblastoma B 2 (Bcl-2) e tem o efeito de promover a apoptose. No entanto, a base material e o mecanismo de seu efeito sinérgico não são claros. Além disso, o modelo de lesão de células PC12 foi estabelecido com o meio combinado livre de glicose CoCl2, e a combinação ótima de componentes em Ast e Eri foi rastreada e definida7.
Neste estudo, as doses efetivas de Ast e Eri são rastreadas usando o modelo de célula PC12 lesionado. A combinação ideal das duas drogas é rastreada usando este modelo combinado com o método de design homogêneo. O modelo celular é usado para avaliar melhor a diferença nos efeitos e mecanismos da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Esta estratégia visa explorar o efeito protetor e o mecanismo regulador dos dois tipos de combinações em células PC12 lesadas através da via de sinal PI3K/Akt/Nrf2 para determinar o melhor modo de combinação. Este estudo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação do TCM.
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Protocol
1. Preparação do reagente
- Preparar o meio completo adicionando 90 mL de meio DMEM com alto teor de açúcar, 10 mL de soro fetal bovino (FBS) e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina em um frasco de cultura estéril de 125 mL. Misturar o meio completo e conservar a 4 °C em condições fechadas.
- Preparar a solução de CoCl 2 adicionando 0,02 g de pó de CoCl2 (pesado com precisão) em 10 ml de meio DMEM sem açúcar (dissolvido completamente) para obter uma solução-mãe de 8,4 mM. Filtrar a solução com um filtro bacteriano de 0,22 μm, selá-la e guardá-la a 4 °C de distância da luz.
NOTA: CoCl2 é instável e deve ser armazenado em um recipiente hermético, protegido da luz; o período de validade da solução de CoCl2 é de 7 dias. - Preparar solução salina tamponada de Tris-Hcl (TBST).
- Pesar com precisão 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio e 3 g de Tris-base. Adicione-os em um copo de 1 L e, em seguida, adicione 1.000 mL de água RO para dissolver a mistura.
- Ajustar o pH para 7,4, adicionar 1 ml de Tween 20 e misturar cuidadosamente para obter a solução TBST.
NOTA: Tween 20 atua como um surfactante para reduzir a ligação inespecífica de anticorpos a antígenos e funciona melhor na concentração de 0,1%.
- Preparar a solução de MTT (sal de brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazólio) pesando 0,1 g de MTT em pó em 20 ml de solução PBS para obter uma solução-mãe de 5 mg/ml. Filtrar a solução com um filtro bacteriano de 0,22 μm, selá-la e guardá-la a 4 °C da luz, colocada em modo de espera.
NOTA: O pó de MTT é instável e absorve facilmente a umidade, por isso deve ser armazenado em um local fechado e seco, longe da luz. A solução de MTT expira após 7 dias. O MTT tem um efeito cancerígeno, por isso evite o contacto direto com a pele. - Preparar a solução da cápsula de Eri removendo o invólucro da cápsula e pesando com precisão 0,18 g do conteúdo em 10 ml de meio sem açúcar DMEM para preparar uma solução-mãe de 100 μM (com base na concentração de escutelarina). Filtrar a solução com um filtro bacteriano de 0,2 μm, selá-la e guardá-la num recipiente hermético a 4 °C.
NOTA: A escutelarina é o principal ingrediente ativo do Erigeron breviscapus. A concentração de escutelarina nas cápsulas foi determinada por HPLC-UV como sendo de 2,56 mg/g, ou seja, 5,54 μmol/g8. A concentração da preparação é calculada com base na concentração de escutelarina. Isso é conveniente para avaliar a atividade farmacológica da preparação e do componente. - Preparar a solução da injeção Ast adicionando 5 ml de injeção e 5 ml de meio DMEM sem açúcar num tubo centrífugo estéril de 15 ml para preparar uma solução-mãe de 60 μM (com base na concentração de astragalosídeo A). Filtrar a solução através de um filtro bacteriano de 0,2 μm e armazená-la num recipiente hermético a 4 °C.
NOTA: O volume de injeção é de 10 mL cada, e a concentração de astragalosídeo A na injeção foi determinada pela HPLC-ELSD como sendo de 0,094 mg/mL (ou seja, 120 μM)9. A preparação deve ser realizada em um gabinete de biossegurança e operada de maneira à prova de luz por toda parte. O volume da solução injetável e do meio sem açúcar deve ser medido com precisão e bem misturado. - Preparar a solução de astragalosídeo A pesando com precisão 7,85 mg de astragalosídeo A padrão e dissolvendo-a completamente em 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar uma solução-mãe de 5.000 μM. Filtrá-lo com um filtro bacteriano de 0,22 μm e armazená-lo hermético a 4 °C.
NOTA: O pó de astragalosídeo A é insolúvel no meio sem açúcar. Ao preparar a solução, dissolvê-la com a quantidade apropriada de DMSO para manter a concentração experimental final de DMSO abaixo de 0,1% para garantir que não haja citotoxicidade. - Preparar a solução de escutelarina pesando 11,56 mg de scutellarin standard com precisão e dissolvendo-a completamente com 5 ml de meio DMEM sem açúcar para preparar uma solução-mãe de 5.000 μM. Filtrá-lo com um filtro bacteriano de 0,22 μm e armazená-lo hermético a 4 °C.
- Preparar a solução de ácido clorogénico pesando 8,86 mg de ácido clorogénico padrão com precisão e completa dissolvendo-a com 5 ml de meio DMEM sem açúcar para preparar uma solução-mãe de 5.000 μM. Filtrá-lo com um filtro bacteriano de 0,22 μm e armazená-lo hermético a 4 °C.
NOTA: O pó de ácido clorogênico é instável e absorve facilmente a água. Deve ser selado e armazenado a 4 °C de distância da luz; o tempo de exposição deve ser minimizado durante a pesagem.
2. Ensaio de viabilidade celular
- Obter células PC12 e cultivá-las em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
NOTA: Neste estudo, as células são obtidas da Academia Chinesa de Ciências. As células PC12 são células aderentes que têm as características gerais das células neuroendócrinas e são amplamente utilizadas em neurofisiologia e neurofarmacologia. - Cultivar as células a 37 °C numa incubadora suplementada com 5% de CO 2 e subcultivá-las a cada2-3 dias. Use células nas passagens 4-8 para todos os experimentos.
- Cultura celular
- Trate as células PC12 na fase de crescimento logarítmico (70%-80% de confluência celular) com 1 mL de tripsina (0,25%) e observe as células ao microscópio. Quando as células se tornarem redondas, pare a digestão da tripsina adicionando 3 mL do meio completo.
- Transfira as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrifugar as células a 840 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuscite com o meio completo e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, conte o número de células usando um citômetro de fluxo.
- Inicie o software de citometria de fluxo, selecione o múltiplo de diluição correspondente da solução celular na configuração de contagem e clique em Gráfico de Densidade depois de carregar a amostra de célula do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Circule a população de células para longe dos eixos X e Y, clique com o botão direito do mouse na tabela de dados abaixo da figura e selecione Contagem X, Y, Contagem e Contagem de Abs. Os dados em Abs Count na tabela de dados fornecem o resultado da contagem de células.
- Ajustar a concentração celular para 1 x 10 5 células/mL, inocular 100 μL/poço em placas de 96 poços e cultivar a 37 °C e5 % de CO2 em uma incubadora por 24 h.
- Triagem de concentrações seguras de dois fármacos em células PC12 normais
- Cultivar as células conforme descrito nas etapas 2.1-2.2. Descarte o sobrenadante e trate as células normais com diferentes concentrações finais de injeção de Ast (4, 8, 12, 16, 20 e 24 μM) e cápsula de Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 μM). Trate seis poços replicados de cada grupo por 24 h.
NOTA: As drogas são adicionadas à mídia para atingir a concentração final da droga (mencionada na etapa 2.4.1) e, em seguida, um volume igual de mídia é adicionado a cada poço. Ao aspirar o sobrenadante, a ponta da pipeta deve ser colocada suavemente contra a parede do poço para evitar o contato com as células no fundo do poço. Ao adicionar soluções diferentes, adicione-as suave e rapidamente ao longo das bordas dos poços e preste atenção ao mudar a cabeça da pistola de pipeta para evitar afetar os resultados experimentais. - Rejeitar o sobrenadante, adicionar 120 μL de solução de MTT (1 mg/ml) a cada alvéolo e incubar as células durante 4 h a 37 °C.
- Após a incubação, descarte o sobrenadante novamente e adicione 150 μL de DMSO a cada poço. Agite a placa durante 10 minutos a uma velocidade de 240 vezes/min (número de vibrações horizontais por minuto) utilizando um oscilador de vórtice.
- Medir a absorvância de cada amostra a 490 nm utilizando um leitor de microplacas. Calcular a viabilidade celular (%), que é a absorvância do grupo tratado/absorvância do grupo normal (controle) x 100.
NOTA: Certifique-se de que a solução MTT está dentro do período de validade; se a cor mudou (para verde escuro), ela não pode ser usada. Ao testar a absorvância das células, um poço em branco (meio de cultura e MTT, sem células ou drogas) deve ser ajustado para eliminar a interferência de outros reagentes. Um volume de 150 μL de DMSO é adicionado a cada poço e agitado por 10 minutos para dissolver melhor os cristais azul-púrpura. A absorvância deve ser detectada o mais rapidamente possível para garantir a precisão dos resultados.
- Cultivar as células conforme descrito nas etapas 2.1-2.2. Descarte o sobrenadante e trate as células normais com diferentes concentrações finais de injeção de Ast (4, 8, 12, 16, 20 e 24 μM) e cápsula de Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 μM). Trate seis poços replicados de cada grupo por 24 h.
- Triagem de concentrações efetivas de dois fármacos em células PC12 lesadas
- Cultivar as células por 24 h, conforme mencionado nas etapas 2.1-2.2, descartar o sobrenadante e, em seguida, tratar as células com 20 μL/poço de CoCl2 (0,4 mM) combinado com o meio livre de açúcar.
- Tratar simultaneamente as células com 100 μL/poço de injeção de Ast (as concentrações finais são 2, 6, 8, 10 e 12 μM) ou 100 μL de cápsula de Eri (as concentrações finais são 1, 2, 3, 4 e 5 μM) a 37 °C por mais 24 h. Adicionar 120 μL/poço de meio completo ao grupo de controlo.
NOTA: CoCl2 induz condições hipóxicas nas células. - Medir a absorvância de cada amostra pelo método MTT e calcular a viabilidade celular descrita anteriormente nas etapas 2.4.2 e 2.4.3.
- Triagem da combinação ótima de dois fármacos com base no método de delineamento homogêneo
NOTA: Após a obtenção da faixa de concentração efetiva da injeção de Astragalus e da cápsula de breviscapus,utilizou-se a tabela do método de delineamento uniforme U 7 (74) para obter seis combinações diferentes dos dois fármacos. Injeção de Ast:Eri cápsula: 1) 2:2.6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1.8 μM, 4) 8:4.2 μM, 5) 10:1 μM, e 6)12:3.4 μM.- Cultive as células, conforme descrito acima na etapa 2.3.1, e trate as células PC12 lesadas com concentrações de seis proporções de injeção de Ast:cápsula de Eri, conforme mencionado acima.
- Tratar as células durante 24 h e calcular a viabilidade celular conforme descrito anteriormente nos passos 2.4.2 e 2.4.3.
- Avaliação do efeito protetor de duas combinações ótimas em células PC12 lesadas
NOTA: Após a obtenção da combinação de preparação ideal (injeção de Ast:cápsula de Eri de 6:1,8 μM) e a combinação ótima de componentes7 (astragalosídeo A de 10 μM, escutelarina de 40 μM e ácido clorogênico de 75 μM), uma avaliação adicional é realizada para verificar seus efeitos protetores nas células PC12 lesadas.- Cultive as células conforme descrito acima na etapa 2.3.1 e trate as células PC12 lesadas com os dois tipos de combinações de drogas, conforme discutido na NOTA acima.
- Tratar as células durante 24 h e calcular a viabilidade celular conforme descrito anteriormente nos passos 2.4.2 e 2.4.3.
3. Ensaio de anexina V-FITC/PI para a taxa de apoptose
- Semeia as células PC12 numa placa de 12 poços a uma concentração de 1,3 x 105 células/poço e cultura-as a 37 °C durante 24 h.
- Agrupe as células: grupo controle, grupo modelo e duas combinações de drogas. Adicionar 1,2 mL/poço de meio completo ao grupo controle, adicionar 1,2 mL/poço de meio contendo 0,4 mM de CoCl 2 ao grupo modelo e adicionar 1,2 mL/poço de cada uma das duas combinações contendo 0,4 mM CoCl2. Incubar as células a 37 °C durante mais 24 h.
- Após o tratamento medicamentoso, tratar as células com 250 μL/poço de tripsina, transferir as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 840 xg por 5 min à temperatura ambiente (RT). Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL do tampão de ligação.
- Incubar as células no escuro com 5 μL de anexina V-FITC e 10 μL de iodeto de propídio (PI) por 15 min no RT e, em seguida, verificar se há apoptose por citometria de fluxo. Defina três poços replicados em cada grupo.
NOTA: A tripsina utilizada neste ensaio não pode conter EDTA porque o EDTA é um agente quelante de iões metálicos que compete com a anexina V para ligar os iões cálcio e afecta a afinidade da anexina pelo PI. Quando ocorre apoptose, a fosfoserina, originalmente no lado interno da membrana celular, volta-se para fora para a superfície celular, e a anexina V-FITC se liga seletivamente à fosfoserina fora da membrana para mostrar fluorescência verde. - Clique em Compensação Automática no menu Iniciar , selecione FITC, PE, PerCP e APC no canal Selecionar e selecione Compensação em: Altura. Clique em OK no item estatístico: mediana. Com o mesmo método de contagem de células mencionado na etapa 2.3.2, colete as amostras de células, clique no Mapa de Densidade e circule a população de células efetiva.
- Com a fluorescência FITC como o parâmetro do eixo X e outros parâmetros de fluorescência como o parâmetro do eixo Y, crie um mapa de densidade. Clique em Matriz de compensação no menu Iniciar e Coeficiente na matriz de estouro. As informações do mapa de densidade são exibidas para a análise da taxa de apoptose.
- Incubar as células no escuro com 5 μL de anexina V-FITC e 10 μL de iodeto de propídio (PI) por 15 min no RT e, em seguida, verificar se há apoptose por citometria de fluxo. Defina três poços replicados em cada grupo.
4. Detecção por imunofluorescência da geração de caspase-3
- Semeia as células PC12 em folhas de cobertura a uma densidade de 8 x 104 células/folha de cobertura e coloque-as em placas de 24 poços a 37 °C durante 24 h. Agrupar as células como mencionado acima na etapa 3.2; configurar três folhas de cobertura replicadas para cada grupo.
- Após o tratamento medicamentoso, enxaguar as coberturas duas vezes com PBS (37 °C) por 5 min cada, fixá-las com paraformaldeído a 4% por 15 min e permeabilizar com Triton X-100 a 0,5% por 20 min no TR.
- Enxaguar as células novamente e bloqueá-las com soro de cabra a 10% por 1 h no RT.
- Incubar cada folha de cobertura com 200 μL de anticorpo primário caspase-3 (uma proteína executiva chave da apoptose) diluído a uma concentração de 1:250 em 1x TBST, durante a noite a 4 °C. Lavar com 1x TBST (três vezes por 3 min cada) e incubar com 200 μL de anticorpo secundário (diluição de 1:300 em 1x TBST) por 1 h em RT no escuro.
NOTA: A fluorescência é facilmente extinta; assim, após a incubação do anticorpo secundário, as lâminas devem ser mantidas longe da luz. Os anticorpos primários e secundários devem ser armazenados a 4 °C de distância da luz. - Adicione 300 μL de DAPI (0,5 μg/mL) às coberturas (para detectar os núcleos) por 10 min e lave as células três vezes com 1x TBST por 5 min cada.
- Observe as coberturas sob o microscópio de fluorescência e capture as imagens10. Realizar análise estatística da intensidade de fluorescência utilizando o software de imagem.
NOTA: As corrediças e as tampas utilizadas devem ser limpas e estéreis. Ao colorir, preste atenção ao pH, concentração e temperatura da solução de tingimento e evite a têmpera por fluorescência. O microscópio fluorescente deve ser ligado com pelo menos 15 min de antecedência para pré-aquecer a lâmpada de mercúrio e desligado por 30 min antes de ser ligado novamente. Ao adquirir imagens, os parâmetros de exposição do mesmo corante no mesmo lote de experimentos devem ser consistentes para garantir a precisão dos resultados.
5. Ensaio de imunofluorescência do nível de EROs
- Cultivar e tratar as células conforme discutido na etapa 4.1.
- Após o tratamento medicamentoso, lavar cada folha de cobertura três vezes com PBS por 3 min e incubar com 400 μL de DCFH-DA (10 μM) a 37 °C por 20 min.
NOTA: DCFH-DA é um indicador universal de estresse oxidativo. Tem permeabilidade à membrana celular e sem fluorescência. Uma vez que entra na célula, é hidrolisado pela esterase para produzir 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH) e, em seguida, rapidamente oxidado para produzir um produto fluorescente forte. - Lave as células novamente com DMEM sem soro (duas vezes por 3 min cada) e observe imediatamente a tampa após adicionar o agente de têmpera de fluorescência sob o microscópio de fluorescência. Calcule a intensidade relativa de fluorescência pelo software de imagem.
Observação : depois de carregar o teste DCFH-DA, certifique-se de limpar o teste residual que não entra na célula, caso contrário, o plano de fundo ficará alto.
6. Detecção de Western blot da expressão proteica de Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax11,12
- Inocular células PC12 em placas de 6 poços na concentração de 1 x 106 células/poço e cultura a 37 °C durante 24 h. Agrupe e trate as células como mencionado na etapa 4.1 e defina três poços replicantes em cada grupo.
- Após o tratamento medicamentoso por 24 h, lavar as células três vezes com PBS por 5 min cada e incubar no gelo por 30 min em tampão de lise preparado. Após a lise, centrifugar as células por 20 min a 16.000 x g e 4 °C e coletar os sobrenadantes.
- Detectar a concentração de proteína e ajustar de acordo com as instruções através do ensaio de Bradford. Diluir as amostras e desnaturar a 100 °C durante 10 minutos.
NOTA: O tampão de lise é composto por inibidor de fosfatase, inibidor de protease e lisado de RIPA em uma proporção de volume de 1:1:50. No grupo controle, são necessários 200 μL/poço de tampão de lise e 100 μL/poço de tampão de lise nos outros grupos. Geralmente, as concentrações proteicas dos grupos controle, modelo e dois tipos de combinações são 0,45 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,32-0,39 mg/mL, respectivamente; suas concentrações de proteína após diluição com o tampão de carga são de 0,36, 0,2 e 0,256-0,312 mg/mL, respectivamente. - Para detectar proteínas com diferentes pesos moleculares, carregue 25 μg de proteína em cada pista, execute uma eletroforese SDS-PAGE de 12% e transfira o gel para membranas PVDF.
NOTA: Durante a preparação do gel SDS, ele deve ser totalmente misturado sem bolhas ou partículas insolúveis; caso contrário, bandas irregulares ou irregulares podem ocorrer. Ao transferir as membranas, certifique-se de que não há bolhas entre a membrana PVDF e o gel; caso contrário, manchas brancas aparecerão na tira. Além disso, essa etapa deve ser realizada em baixas temperaturas, e o saco de gelo deve ser trocado a cada 30 min. - Bloquear as membranas com leite desnatado a 5% por 1,5 h no RT e incubar com 5 mL dos anticorpos primários correspondentes (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 e Bax 1:1.000) por 24 h a 4 °C. Use β-actina (1:5.000) como controle interno.
- Lavar as membranas com TBST (três vezes por 10 min cada) e, em seguida, incubar com 5 mL de anticorpos secundários conjugados com HPR (1:5.000) no RT por 2 h.
NOTA: A razão de diluição dos anticorpos não deve ser alterada arbitrariamente, e as membranas devem ser lavadas com TBST suficientemente de acordo com os requisitos para evitar que a cor de fundo da banda seja demasiado preta. - Finalmente, lave a membrana com TBST novamente e trate-a com substrato quimioluminescente HRP (de acordo com as instruções do fabricante) para detecção de banda de proteína. Capturar as imagens utilizando o sistema de imagem quimioluminescência e quantificar os valores de cinza das proteínas utilizando o software de imagem, com β-actina como controle interno comparativo.
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Representative Results
A triagem da combinação ideal de injeção de Ast e cápsula de Eri é mostrada na Figura 1. A taxa de sobrevivência celular da injeção de Ast e da cápsula de Eri nas células PC12 normais é mostrada na Figura 1A. A viabilidade celular foi inferior a 95% com injeção de Ast em concentrações superiores a 12 μM (Figura 1A) e cápsula de Eri em concentrações superiores a 5 μM (Figura 1A), indicando que a concentração máxima não tóxica foi de 12 μM e 5 μM, respectivamente. Sua citotoxicidade foi maior do que a do astragalosídeo A e da escutelarina usados isoladamente. A viabilidade da injeção de Ast e da cápsula de Eri nas células PC12 lesadas induzidas por CoCl2 é mostrada na Figura 1B,C. Em comparação com o grupo modelo, a injeção de Ast poderia melhorar a taxa de sobrevivência das células PC12 lesadas na faixa de concentração de 6-12 μM (p < 0,05 ou p < 0,01), e as cápsulas de Eri na concentração de 2-5 μM poderiam melhorar a taxa de sobrevivência (p < 0,05 ou p < 0,01). A injeção de Ast e a cápsula de Eri nas proporções de 10:1, 8:4,2 e 6:1,8 μM podem aumentar significativamente a viabilidade das células PC12 da lesão (p < 0,01) (Figura 1D). A proporção de 6:1,8 μM exibiu a maior viabilidade celular, indicando que é a combinação de preparação ideal e a atividade farmacológica em comparação com a melhor combinação de componentes.
A avaliação dos efeitos protetores de dois tipos de combinação sobre as células PC12 lesadas é mostrada na Figura 2. Em comparação com o grupo modelo, a viabilidade celular das duas combinações foi significativamente promovida (p < 0,001), e a combinação de componentes foi superior à combinação de preparação (Figura 2A). Isso sugere que a combinação de componentes pode promover a sobrevivência celular melhor do que a combinação de preparação. A taxa de apoptose foi testada por citometria de fluxo (Figura 2B,C). Em comparação com o grupo normal, as porcentagens de células apoptóticas precoces, tardias e totais foram significativamente maiores no grupo modelo (p < 0,01 ou p < 0,001). Em comparação com o grupo modelo, as porcentagens de células apoptóticas em cada estágio foram significativamente menores nos grupos de tratamento (p < 0,05 ou p < 0,01, ou p < 0,001). A intensidade de fluorescência da expressão da proteína caspase-3 em cada grupo é mostrada na Figura 2D,E. Em comparação com o grupo normal, a intensidade de fluorescência da caspase-3 foi significativamente maior no grupo modelo. Em comparação com o grupo modelo, a intensidade de fluorescência da caspase-3 foi significativamente menor em cada grupo de tratamento (p < 0,001 ou p < 0,01) e foi relativamente menor no grupo de combinação de componentes do que no grupo de combinação de preparação. Esses resultados sugerem que o modelo celular pode induzir apoptose, e o efeito anti-apoptose da combinação de componentes é melhor do que o da combinação de preparação.
Western blot detectou a expressão das proteínas p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax (Figura 3). Em comparação com o grupo normal, os níveis de expressão de p-Akt/Akt e Bcl-2/Bax foram significativamente menores no grupo modelo (p < 0,01 ou p < 0,001). Em comparação com o grupo modelo, a expressão de p-Akt/Akt e Bcl-2/Bax foi significativamente maior nas duas combinações (p < 0,05 ou p < 0,01, ou p < 0,001), especificamente maior na combinação de componentes. Os resultados sugerem que a combinação de componentes é superior à combinação de preparação na promoção da sobrevivência celular, o que está relacionado ao efeito anti-apoptose mais forte produzido pela regulação positiva da via de sinal Akt/Bcl-2/Bax.
A fluorescência da DCFH pode ser medida por um microscópio de fluorescência para determinar o nível de EROs nas células (Figura 4A,B). Como mostrado na Figura 4A, a fluorescência foi quase invisível nas células normais, e a fluorescência no grupo modelo foi significativamente aumentada. A fluorescência em ambas as combinações foi significativamente reduzida em comparação com o grupo modelo. Como mostra a Figura 4B, a intensidade relativa de fluorescência foi significativamente mais fraca em cada grupo de tratamento em comparação com o grupo modelo (p < 0,001). A fluorescência teve uma tendência a diminuir no grupo de combinação de componentes em comparação com o grupo de combinação de preparação, indicando que o modelo celular pode induzir danos oxidativos. O efeito de dano antioxidante da combinação de componentes é melhor do que o da combinação de preparação.
Western blot detectou a expressão da proteína Nrf2 (Figura 4C). Em comparação com o grupo normal, a expressão de Nrf2 foi significativamente reduzida no grupo modelo (p < 0,05). Em comparação com o grupo modelo, a expressão da proteína Nrf2 foi significativamente maior nos grupos de tratamento (p < 0,01 ou p < 0,05), especificamente maior no grupo de combinação de componentes (Figura 4D). Isso sugere que a combinação de componentes é melhor do que a combinação de preparação na promoção da sobrevivência celular, o que está relacionado ao dano antioxidante mais forte produzido pela regulação positiva da via de sinal Nrf2.
Em conclusão, a combinação de componentes (10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico) poderia promover a sobrevivência das células lesadas melhor do que a combinação de preparação (injeção de 6 μM de Ast e cápsula de 1,8 μM de Eri) através de uma regulação mais forte das vias de sinal relacionadas à apoptose e dano oxidativo.
Para a análise estatística foi utilizado o software estatístico SPSS 26.0, e todos os dados são expressos como a média ± desvio padrão (DP). Para comparações entre os grupos, os dados foram avaliados por ANOVA one-way seguida do teste de Tukey. Considerou-se que p < 0,05 indicava diferença estatisticamente significante.
Figura 1: Efeitos das drogas na viabilidade de células PC12 normais e lesadas. (A) Efeitos de várias concentrações de injeção de Ast e várias concentrações de cápsula de Eri em células PC12 normais. (B) Rastreio da concentração efetiva da injeção de Ast nas células PC12 lesadas. (C) Rastreio da concentração efetiva da cápsula de Eri nas células PC12 lesadas. (D) Efeitos das combinações de duas drogas em proporções diferentes sobre a taxa de sobrevivência de células PC12 lesadas. Os valores estatísticos são expressos como a média ± DP de seis experimentos independentes. &&p < 0,01 em comparação com o grupo controle. *p < 0,05 e **p < 0,01 em comparação com o grupo modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos de duas combinações na sobrevivência e apoptose de células PC12 lesadas. (A) Efeito da combinação de componentes e da combinação de preparação na taxa de sobrevivência de células PC12 lesadas. (B) Gráfico da taxa de apoptose detectada pela anexina V-PI. (C) Histograma estatístico da taxa de apoptose. (D) A intensidade relativa de fluorescência da expressão da proteína caspase-3 (400x). Barras de escala: 20 μm. (E) Histograma estatístico da intensidade de fluorescência da expressão da proteína caspase-3. Os valores estatísticos são expressos como a média ± DP de três experimentos independentes, exceto para a viabilidade celular de seis experimentos independentes. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação com o grupo modelo. ##p < 0,01 em comparação com o grupo de combinação de preparação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos das duas combinações sobre os níveis de expressão de p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax. (A) Expressão proteica de p-Akt e Akt determinada pela análise de Western blot. (B) Histograma estatístico da razão p-Akt/Akt em cada grupo. (C) Expressão proteica de Bcl-2 e Bax determinada por análise de Western blot. (D) Histograma estatístico da relação Bcl-2/Bax em cada grupo. Os valores estatísticos são expressos como a média ± DP de três experimentos independentes. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação com o grupo modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito de duas combinações sobre a expressão da proteína Nrf2 e os níveis de EROs. (A) Os níveis de EROs foram detectados por microscopia de fluorescência (400x). Barras de escala: 20 μm. (B) Histograma estatístico da intensidade de fluorescência de EROs em cada grupo. (C) Expressão da proteína Nrf2 determinada pela análise de Western blot. (D) Histograma estatístico da expressão da proteína Nrf2. Os valores estatísticos são expressos como a média ± DP de três experimentos independentes. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação com o grupo modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ainda há carência de medicamentos ideais para o tratamento da isquemia cerebral na prática clínica moderna2. Sob a orientação da suplementação de qi e ativação do método de circulação sanguínea, Ast, Eri e outras preparações têm sido utilizadas em combinação na prática clínica da MTC e têm alcançado boas vantagens abrangentes13,14,15. Um grande número de estudos tem demonstrado que o Ast pode melhorar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, aumentar o fluxo sanguíneo cerebral, melhorar a capacidade das células nervosas de tolerar a hipóxia e resistir aos danos dos radicais livres de oxigênio, além de melhorar significativamente a disfunção neurológica16,17. É particularmente adequado para a doença cerebrovascular isquêmica senil16,17. Eri pode dilatar os vasos sanguíneos, aumentar o suprimento sanguíneo para o cérebro, remover ERO e reduzir a peroxidação lipídica18,19. No entanto, o efeito sinérgico, os componentes farmacodinâmicos e o mecanismo da combinação das duas drogas ainda não estão claros, o que é um problema comum que restringe a aplicação clínica da MTC.
O ambiente isquêmico e hipóxico da isquemia cerebral crônica induz dano ao estresse oxidativo e, ao mesmo tempo, ativa a via de sinalização da apoptose das células cerebrais para promover a apoptose neuronal20,21. A via PI3K/Akt é uma via clássica de transdução de sinal anti-apoptótica e pró-sobrevivência22,23, entre as quais as proteínas da família Bcl-2 e a família da caspase são as proteínas executivas a jusante dessa via de sinal. A Akt fosforilada pode regular direta ou indiretamente a família Bcl-2 e inibir a ativação da via a jusante da caspase-3, exercendo assim um efeito antiapoptótico11. Além disso, o excesso de EROs geradas pela hipóxia pode induzir lesão por estresse oxidativo, enquanto a Akt fosforilada pode ativar o Nrf2 para eliminar o excesso de ERO e combater o dano do estresse oxidativo12,24. Portanto, a ativação da via PI3K/Akt/Nrf2 pode efetivamente prevenir e controlar o estresse oxidativo e a apoptose, reduzindo assim a lesão cerebral hipóxico-isquêmica25,26.
No estudo, a combinação de preparação foi rastreada usando o modelo de célula PC12 lesada, e o efeito e o mecanismo neste modelo foram comparados com a combinação de componentes rastreada anteriormente7. Além disso, a concentração máxima não tóxica da injeção de Ast e da cápsula de Eri é de 12 μM (calculada pelo astragalosídeo A) e 5 μM (calculada pela escutelarina), respetivamente, enquanto a concentração máxima não tóxica de astragalosídeo A e escutelarina é de 20 μM e 50 μM, respetivamente7. Isso mostra que a combinação de componentes é mais segura do que a combinação de preparação, com qualidade mais controlável e vantagens abrangentes de alta eficiência e baixa toxicidade.
Os modelos celulares atuais que podem ser utilizados para simular isquemia cerebral incluem principalmente hipóxia física (induzida por OGD) e hipóxia química (induzida por Na2S 2 O4 ou CoCl2)27. Dentre elas, tanto a OGD quanto as lesões de Na2S2O4 têm um curto tempo de hipóxia e não são adequadas para simular isquemia crônica27. A hipóxia induzida por CoCl2 é uma das imitações de hipóxia mais comumente usadas em comparação com a OGD e o uso de outras mímica de hipóxia. Pode levar a danos oxidativos persistentes e estáveis por ERO e produzir alterações apoptóticas típicas em diferentes linhagens celulares27. Portanto, neste estudo, a CoCl2 foi utilizada por 24 h para simular a hipóxia neuronal28,29. Sua concentração de modelagem (0,1, 0,2, 0,4 e 0,8 mM) e o período de validade (1 e 7 dias) foram rastreados. Além disso, dada a inevitável falta de glicose e oxigênio após a isquemia cerebral, o ambiente livre de glicose e hipóxico pode simular melhor a lesão isquêmica cerebral. Este estudo mostrou que o CoCl2 de 0,4 mM combinado com um meio livre de glicose por 24 h poderia estabelecer um modelo de células hipóxicas crônicas estável e controlável. No estudo de acompanhamento, o modelo animal de isquemia cerebral crônica será usado para validar ainda mais as vantagens terapêuticas da combinação de componentes in vivo.
Esse modelo celular pode aumentar a taxa de apoptose, a intensidade de fluorescência da caspase-3 e o nível de EROs intracelulares (Figura 2 e Figura 4), o que pode simular melhor as alterações patológicas da isquemia cerebral crônica, como apoptose, estresse oxidativo, etc. Com base nesse modelo, verificou-se que os dois tipos de combinações podem inibir a apoptose e o dano do estresse oxidativo. O efeito da combinação de componentes na promoção da sobrevivência celular foi significativamente melhor do que o da combinação de preparo (Figura 1); ambas as combinações poderiam regular positivamente os níveis de expressão de P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax e Nrf2 em diferentes graus (Figura 3 e Figura 4). Em particular, a combinação de componentes teve um efeito mais forte na regulação positiva da via de sinalização Akt/Bcl-2/Bax e Nrf2. Esses resultados indicam que a combinação de componentes pode resistir melhor ao dano celular do que a combinação de preparação, que está relacionada a anti-apoptose mais forte e estresse antioxidante.
Em conclusão, estes resultados fornecem uma estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas e fornece uma nova ideia para avaliar e otimizar o modo de aplicação combinado de duas ervas. No geral, este estudo fornece uma referência para selecionar a combinação de componentes ativos da MTC.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada por projetos-chave de P & D do Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
