Summary
Этот протокол обеспечивает комбинированную стратегию двух трав для лечения поврежденных клеток PC12. Протокол предоставляет справочник для оптимизации наилучшего режима применения традиционной китайской медицины (ТКМ).
Abstract
Учитывая преимущества комбинации традиционной китайской медицины (ТКМ) в лечении ишемии головного мозга, мы изучили различия в эффективности и механизме между комбинацией препарата и комбинацией компонентов, чтобы изучить стратегию комбинации двух трав для лечения поврежденных клеток PC12. Хлорид кобальта (CoCl2) в сочетании с безглюсодержащей средой использовали для индуцирования окислительного повреждения клеток PC12. Затем оптимальная комбинация инъекций Astragalus mongholicus (Ast) и Erigeron breviscapus (Eri) была выбрана и объединена в соответствии с методами унифицированного проектирования после скрининга их безопасной и эффективной концентрации на клетках PC12. Кроме того, проверенная комбинация компонентов содержит 10 мкМ астрагалозида А, 40 мкМ скутелларина и 75 мкМ хлорогеновой кислоты в двух травах. Затем MTT, Annexin V-FITC/PI, иммунофлуоресцентный и вестерн-блот-анализ использовались для оценки эффективности и механизма комбинации препарата и комбинации компонентов на поврежденных клетках PC12. Результаты показали, что оптимальной комбинацией препаратов для клеточной про-выживаемости была инъекция Ast и капсула Eri с концентрацией 6:1,8 (мкМ). Комбинация компонентов (10 мкМ астрагалозида А, 40 мкМ скутелларина и 75 мкМ хлорогеновой кислоты) была более эффективной, чем комбинация препарата. Обе комбинации заметно снижают апоптотическую скорость, интенсивность флуоресценции каспазы-3 и уровень внутриклеточных активных форм кислорода (АФК); между тем, они повысили уровни экспрессии p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax и Nrf2. Эти эффекты были более очевидны в комбинации компонентов. В заключение, обе комбинации могут ингибировать повреждение, вызванное CoCl2 в сочетании с безглюсодержащей средой на клетках PC12, тем самым способствуя выживанию клеток. Однако эффективность комбинации компонентов по сравнению с комбинацией препарата может быть обусловлена его более сильной регуляцией сигнального пути PI3K/Akt/Nrf2, связанного с окислительным стрессом и апоптозом.
Introduction
Хроническая церебральная ишемия, вызванная церебральной гипоперфузией, является распространенным заболеванием у людей среднего и пожилого возраста1. Как долгосрочная оккультная болезнь ишемии, она может привести к прогрессирующей или стойкой неврологической дисфункции. К основным патологическим механизмам относятся клеточный апоптоз и окислительное повреждение, приводящее к прогрессирующей или стойкой неврологической дисфункции; это патологическая основа болезни Альцгеймера, сосудистой деменции и других заболеваний, и серьезно влияет на качество жизни пациентов. Однако в современной медицине до сих пор не хватает идеальных препаратов для лечения хронической ишемииголовного мозга 2. В то же время комбинация Astragalus mongholicus (Ast) и Erigeron breviscapus (Eri) широко используется в клинической практике традиционной китайской медицины (TCM)4. Комбинированная стратегия значительно улучшилась в содействии восстановлению нервной функции после ишемии головного мозга, что лучше, чем у одного препарата; однако существуют большие различия в соотношении доз в комбинации двух препаратов4. Эффективные компоненты и механизм действия четко не определены, что является ключевым вопросом, ограничивающим его клиническое применение.
Предыдущие исследования продемонстрировали синергетический эффект комбинации препарата Ast injection и Eri injection при лечении ишемии головного мозга у крыс. Он может повышать экспрессию белка p-Akt и понижать экспрессию Bcl-2 ассоциированного промотора смерти (BAD) белка 5,6, который является одним из белков семейства B-лимфобластомы 2 (Bcl-2) и оказывает влияние на стимулирование апоптоза. Однако материальная основа и механизм его синергетического эффекта не ясны. Кроме того, модель повреждения клеток PC12 была установлена с комбинированной средой без глюкозы CoCl2, а оптимальная комбинация компонентов в Ast и Eri была проверена и определена7.
В этом исследовании эффективные дозы Ast и Eri проверяются с использованием поврежденной модели клеток PC12. Оптимальная комбинация двух препаратов проверяется с использованием этой модели в сочетании с методом однородного проектирования. Клеточная модель используется для дальнейшей оценки разницы в эффектах и механизмах комбинации препарата и комбинации компонентов в поврежденных клетках PC12. Эта стратегия направлена на изучение защитного эффекта и регуляторного механизма двух типов комбинаций на поврежденных клетках PC12 через сигнальный путь PI3K / Akt / Nrf2 для определения наилучшего комбинированного режима. Это исследование является справочным материалом для оптимизации наилучшего режима применения ТКМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление реагента
- Приготовьте полную среду, добавив 90 мл среды с высоким содержанием сахара DMEM, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1 мл раствора пенициллина-стрептомицина в 125 мл стерильной культуральной колбы. Перемешайте полную среду и храните при температуре 4 °C в закрытых условиях.
- Приготовьте раствор CoCl2 , добавив 0,02 г порошка CoCl2 (точно взвешенного) в 10 мл среды без сахара DMEM (полностью растворенной) для получения 8,4 мМ запасного раствора. Отфильтруйте раствор бактериальным фильтром 0,22 мкм, запечатайте его и храните при температуре 4 °C вдали от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: CoCl2 нестабилен и должен храниться в герметичном контейнере, защищенном от света; срок действия раствора CoCl2 составляет 7 дней. - Приготовьте раствор буферной соли Tris-Hcl (TBST).
- Точно взвесьте 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия и 3 г трис-основания. Добавьте их в стакан объемом 1 л, а затем добавьте 1000 мл воды обратного осмоса, чтобы растворить смесь.
- Отрегулируйте рН до 7,4, добавьте 1 мл Tween 20 и тщательно перемешайте для получения раствора TBST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Tween 20 действует как поверхностно-активное вещество для снижения неспецифического связывания антител с антигенами и лучше всего работает при концентрации 0,1%.
- Готовят раствор МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2)-2,5-дифенилтетразолия бромидной соли) путем взвешивания 0,1 г порошка МТТ в 20 мл раствора PBS для получения исходного раствора 5 мг/мл. Отфильтруйте раствор бактериальным фильтром 0,22 мкм, запечатайте его и храните при температуре 4 °C вдали от света, помещенного в режим ожидания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок МТТ нестабилен и легко впитывает влагу, поэтому его следует хранить в закрытом и сухом месте вдали от света. Срок действия решения MTT истекает через 7 дней. МТТ обладает канцерогенным действием, поэтому избегайте прямого контакта с кожей. - Приготовьте раствор капсулы Эри, удалив оболочку капсулы и точно взвесив 0,18 г содержимого в 10 мл среды без сахара DMEM, чтобы приготовить 100 мкМ запасного раствора (в зависимости от концентрации скутелларина). Отфильтруйте раствор бактериальным фильтром 0,2 мкм, запечатайте его и храните в герметичном контейнере при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скутелларин является основным активным ингредиентом в Erigeron breviscapus. Концентрация скутелларина в капсулах была определена методом ВЭЖХ-УФ как составляющая 2,56 мг/г, т.е. 5,54 мкмоль/г8. Концентрация препарата рассчитывается исходя из концентрации скутелларина. Это удобно для оценки фармакологической активности препарата и компонента. - Готовят раствор АСТ для инъекций, добавляя 5 мл инъекционного и 5 мл безсахарной ДМЭМ-среды в 15 мл стерильной центрифужной трубки для приготовления исходного раствора 60 мкМ (в зависимости от концентрации астрагалозида А). Отфильтруйте раствор через бактериальный фильтр 0,2 мкм и храните его в герметичном контейнере при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции составляет 10 мл каждый, а концентрация астрагалозида А в инъекции была определена ВЭЖХ-ЭЛСР как 0,094 мг/мл (т.е. 120 мкМ)9. Подготовка должна проводиться в шкафу биобезопасности и эксплуатироваться светонепроницаемым способом во всем. Объем раствора для инъекций и среды без сахара следует измерять точно и хорошо перемешивать. - Готовят раствор астрагалозида А путем точного взвешивания 7,85 мг стандарта астрагалозида А и полного растворения его в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для получения исходного раствора 5000 мкМ. Отфильтруйте его бактериальным фильтром 0,22 мкм и храните его герметично при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок астрагалозида А нерастворим в среде без сахара. При приготовлении раствора растворите его с соответствующим количеством ДМСО, чтобы сохранить конечную экспериментальную концентрацию ДМСО ниже 0,1%, чтобы обеспечить отсутствие цитотоксичности. - Приготовьте раствор скутелларина, взвесив 11,56 мг стандартного скутелларина точно и полностью растворив его 5 мл безсахарной среды DMEM для приготовления 5000 мкМ запасного раствора. Отфильтруйте его бактериальным фильтром 0,22 мкм и храните его герметично при 4 °C.
- Приготовьте раствор хлорогеновой кислоты, точно взвесив 8,86 мг хлорогеновой кислоты и полностью растворив его 5 мл безсахарной DMEM-среды для приготовления исходного раствора 5000 мкМ. Отфильтруйте его бактериальным фильтром 0,22 мкм и храните его герметично при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок хлорогеновой кислоты нестабилен и легко впитывает воду. Он должен быть запечатан и храниться при 4 °C вдали от света; время воздействия должно быть сведено к минимуму во время взвешивания.
2. Анализ жизнеспособности клеток
- Получить клетки PC12 и культивировать их в DMEM с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании клетки получены из Китайской академии наук. Клетки PC12 являются адгезивными клетками, которые имеют общие характеристики нейроэндокринных клеток и широко используются в нейрофизиологии и нейрофармакологии. - Культивируйте клетки при 37 °C в инкубаторе, дополненном 5% CO2 , и субкультурируйте их каждые 2-3 дня. Используйте клетки в проходах 4-8 для всех экспериментов.
- Клеточная культура
- Обработайте клетки PC12 в логарифмической фазе роста (70%-80% клеточного слияния) 1 мл трипсина (0,25%) и наблюдайте за клетками под микроскопом. Когда клетки станут круглыми, остановите переваривание трипсина, добавив 3 мл полной среды.
- Переложите ячейки в стерильную центрифужную трубку объемом 15 мл и центрифугируйте ячейки при 840 х г в течение 5 мин. Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте с полной средой и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Затем подсчитайте количество клеток с помощью проточного цитометра.
- Запустите программное обеспечение для проточной цитометрии, выберите соответствующее кратное разбавление клеточного раствора в параметре подсчета и нажмите на диаграмму плотности после загрузки образца ячейки из микроцентрифужной трубки объемом 1,5 мл.
- Обведите популяцию ячеек в стороне от осей X и Y, щелкните правой кнопкой мыши таблицу данных под рисунком и выберите X, Y, Count и Abs Count. Данные в разделе Abs Count в таблице данных дают результат подсчета ячеек.
- Отрегулируйте концентрацию в клетках до 1 х 105 клеток/мл, инокулируйте 100 мкл/лунку в 96-луночных пластинах и культивируйте при 37 °C и 5% CO2 в инкубаторе в течение 24 ч.
- Скрининг безопасных концентраций двух препаратов на нормальных клетках PC12
- Культивируйте клетки, как описано в шагах 2.1-2.2. Откажитесь от надосадочного вещества и обработайте нормальные клетки различными конечными концентрациями инъекции Ast (4, 8, 12, 16, 20 и 24 мкМ) и капсулы Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкМ). Обрабатывают шесть реплицированных лунок каждой группы в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты добавляют в среду для достижения конечной концентрации лекарственного средства (упомянутой на этапе 2.4.1), а затем к каждой лунке добавляют равный объем среды. При аспирации надосадочного вещества наконечник пипетки следует аккуратно прижимать к стенке скважины, чтобы избежать контакта с ячейками на дне скважины. При добавлении различных растворов добавляйте их аккуратно и быстро по краям колодцев, а также обращайте внимание при смене головки пипетки, чтобы не влиять на результаты эксперимента. - Откажитесь от надосадочного вещества, добавьте 120 мкл раствора МТТ (1 мг/мл) в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение 4 ч при 37 °C.
- После инкубации снова выбросьте супернатант и добавьте 150 мкл ДМСО в каждую лунку. Встряхните пластину в течение 10 мин со скоростью 240 раз/мин (количество горизонтальных колебаний в минуту) с помощью вихревого генератора.
- Измерьте поглощение каждого образца при 490 нм с помощью считывателя микропластин. Рассчитайте жизнеспособность клетки (%), которая представляет собой абсорбцию обработанной группы/абсорбцию нормальной группы (контрольная) х 100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что решение MTT находится в пределах срока действия; если цвет изменился (на темно-зеленый), его нельзя использовать. При тестировании абсорбции клеток следует установить пустой колодец (культуральная среда и МТТ, без клеток или лекарственных средств) для устранения помех других реагентов. В каждую лунку добавляют объем 150 мкл ДМСО и встряхивают в течение 10 мин, чтобы лучше растворить сине-фиолетовые кристаллы. Абсорбция должна быть обнаружена как можно скорее, чтобы обеспечить точность результатов.
- Культивируйте клетки, как описано в шагах 2.1-2.2. Откажитесь от надосадочного вещества и обработайте нормальные клетки различными конечными концентрациями инъекции Ast (4, 8, 12, 16, 20 и 24 мкМ) и капсулы Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкМ). Обрабатывают шесть реплицированных лунок каждой группы в течение 24 ч.
- Скрининг эффективных концентраций двух препаратов на поврежденных клетках PC12
- Культивируйте клетки в течение 24 ч, как указано на этапах 2,1-2,2, отбросьте надосадочный агент, а затем обработайте клетки 20 мкл/лунку CoCl2 (0,4 мМ) в сочетании со средой без сахара.
- Одновременно обрабатывают клетки 100 мкл/лунку инъекции Ast (конечные концентрации 2, 6, 8, 10 и 12 мкМ) или 100 мкл капсулы Eri (конечные концентрации 1, 2, 3, 4 и 5 мкМ) при 37 °C в течение еще 24 ч. Добавьте 120 мкл/лунку полной среды в контрольную группу.
ПРИМЕЧАНИЕ: CoCl2 индуцирует гипоксические состояния в клетках. - Измерьте поглощение каждого образца с помощью метода МТТ и рассчитайте жизнеспособность клеток, как описано ранее на этапах 2.4.2 и 2.4.3.
- Скрининг оптимальной комбинации двух препаратов на основе метода однородного проектирования
ПРИМЕЧАНИЕ: После получения эффективного диапазона концентраций препарата Астрагал для инъекций и капсулы бревискапа, для получения шести различных комбинаций двух лекарственных средств использовали таблицу единообразной конструкцииU 7 (74). Первая инъекция: капсула Эри: 1) 2: 2,6 мкМ, 2) 4: 5 мкМ, 3) 6: 1,8 мкМ, 4) 8: 4,2 мкМ, 5) 10: 1 мкМ и 6) 12: 3,4 мкМ.- Культивируйте клетки, как описано выше на этапе 2.3.1, и обрабатывайте поврежденные клетки PC12 шестью пропорциями концентрации инъекции Ast: капсула Eri, как упоминалось выше.
- Обработайте клетки в течение 24 ч и рассчитайте жизнеспособность клеток, как описано ранее на этапах 2.4.2 и 2.4.3.
- Оценка защитного эффекта двух оптимальных комбинаций на поврежденные клетки PC12
ПРИМЕЧАНИЕ: После получения оптимальной комбинации препаратов (инъекция АСТ: капсула Эри 6:1,8 мкМ) и оптимальной комбинации компонентов7 (10 мкМ астрагалозида А, 40 мкМ скутелларина и 75 мкМ хлорогеновой кислоты) проводится дальнейшая оценка для проверки их защитного действия на поврежденные клетки PC12.- Культивируйте клетки, как описано выше на этапе 2.3.1, и обрабатывайте поврежденные клетки PC12 двумя типами комбинаций лекарственных средств, как обсуждалось в ПРИМЕЧАНИИ выше.
- Обработайте клетки в течение 24 ч и рассчитайте жизнеспособность клеток, как описано ранее на этапах 2.4.2 и 2.4.3.
3. Приложение V-FITC/PI анализ скорости апоптоза
- Засейте клетки PC12 в 12-луночную пластину в концентрации 1,3 х 105 клеток/лунку и культивируйте их при 37 °C в течение 24 ч.
- Группируйте клетки: контрольная группа, модельная группа и две комбинации препаратов. Добавить 1,2 мл/лунку полной среды в контрольную группу, добавить 1,2 мл/лунку среды, содержащей 0,4 мМ CoCl2 , в модельную группу и добавить 1,2 мл/лунку каждой из двух комбинаций, содержащих 0,4 мМ CoCl2. Инкубируют клетки при 37 °C еще 24 ч.
- После медикаментозного лечения обработайте клетки 250 мкл/лунку трипсина, перенесите клетки в центрифужную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 840 хг в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл связывающего буфера.
- Инкубируйте клетки в темноте с 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл йодида пропидия (PI) в течение 15 мин при RT, а затем проверьте наличие апоптоза с помощью проточной цитометрии. Установите три реплицированные скважины в каждой группе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин, используемый в этом испытании, не может содержать ЭДТА, поскольку ЭДТА является хелатирующим агентом ионов металлов, который конкурирует с аннексином V в связывании ионов кальция и влияет на сродство аннексина к ПИ. Когда происходит апоптоз, фосфосерин, первоначально на внутренней стороне клеточной мембраны, поворачивается наружу к поверхности клетки, а Annexin V-FITC избирательно связывается с фосфосерином вне мембраны, чтобы показать зеленую флуоресценцию. - Нажмите кнопку Автоматическая компенсация в меню Пуск , выберите FITC, PE, PerCP и APC в канале Выбрать , а затем выберите Компенсация по адресу: Высота. Нажмите кнопку ОК в разделе Статистический элемент: Медиана. С помощью того же метода подсчета клеток, который описан на шаге 2.3.2, соберите образцы клеток, щелкните Карту плотности и обведите вокруг эффективной популяции клеток.
- С флуоресценцией FITC в качестве параметра оси X и другими параметрами флуоресценции в качестве параметра оси Y создайте карту плотности. Нажмите « Матрица компенсаций» в меню «Пуск» и «Коэффициент» в матрице переполнения. Для анализа скорости апоптоза отображается информация карты плотности.
- Инкубируйте клетки в темноте с 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл йодида пропидия (PI) в течение 15 мин при RT, а затем проверьте наличие апоптоза с помощью проточной цитометрии. Установите три реплицированные скважины в каждой группе.
4. Иммунофлуоресцентное обнаружение генерации каспазы-3
- Высевайте ячейки PC12 на крышки с плотностью 8 x 104 ячейки/крышку и поместите их в 24-луночные пластины при 37 °C в течение 24 ч. сгруппируйте ячейки, как указано выше на этапе 3.2; настройте три реплицированных обложек для каждой группы.
- После лечения препаратом дважды промойте крышки PBS (37 °C) в течение 5 мин каждый, зафиксируйте их 4% параформальдегидом в течение 15 мин и пермеабилизируйте 0,5% Triton X-100 в течение 20 мин при RT.
- Снова промыть клетки и заблокировать их 10% козьей сывороткой в течение 1 ч при РТ.
- Инкубировать каждый покров с 200 мкл первичного антитела каспазы-3 (ключевого исполнительного белка апоптоза), разбавленного в концентрации 1:250 в 1x TBST, на ночь при 4 °C. Промыть 1x TBST (три раза по 3 мин каждый) и инкубировать с 200 мкл вторичного антитела (разведение 1:300 в 1x TBST) в течение 1 ч при RT в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция легко гасится; таким образом, после инкубации вторичного антитела слайды следует держать подальше от света. Первичные и вторичные антитела должны храниться на расстоянии 4 °C от света. - Добавьте 300 мкл DAPI (0,5 мкг/мл) в крышки (для обнаружения ядер) в течение 10 минут и промывайте клетки три раза с 1x TBST в течение 5 минут каждая.
- Наблюдайте за обшивками под флуоресцентным микроскопом и делайте снимки10. Выполните статистический анализ интенсивности флуоресценции с помощью программного обеспечения для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые слайды и крышки должны быть чистыми и стерильными. При окрашивании обращайте внимание на рН, концентрацию и температуру раствора красителя и избегайте закалки флуоресценцией. Люминесцентный микроскоп следует включить не менее чем за 15 минут до предварительного нагрева ртутной лампы и выключить на 30 минут, прежде чем снова включить. При получении изображений параметры экспозиции одного и того же красителя в одной и той же партии экспериментов должны быть согласованными для обеспечения точности результатов.
5. Иммунофлуоресцентный анализ уровня АФК
- Культивируйте и обрабатывайте клетки, как описано на этапе 4.1.
- После лечения препаратом промывайте каждый покров три раза PBS в течение 3 мин и инкубируйте с 400 мкл DCFH-DA (10 мкМ) при 37 °C в течение 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: DCFH-DA является универсальным индикатором окислительного стресса. Обладает проницаемостью клеточной мембраны и отсутствием флуоресценции. Как только он попадает в клетку, он гидролизуется эстеразой с образованием 2',7'-дихлордигидрофлюоресцеина (DCFH), а затем быстро окисляется для получения сильного флуоресцентного продукта. - Снова промыть клетки бессывороточным DMEM (дважды по 3 мин каждая) и сразу же наблюдать за крышкой после добавления флуоресцентного закалочного агента под флуоресцентным микроскопом. Рассчитайте относительную интенсивность флуоресценции с помощью программного обеспечения для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: После загрузки зонда DCFH-DA обязательно очистите остаточный зонд, который не попадает в ячейку, иначе фон станет высоким.
6. Обнаружение вестерн-блоттинга экспрессии белка Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 и Bax 11,12
- Инокулируют клетки PC12 в 6-луночные пластины в концентрации 1 х 106 клеток/лунку и культивируют при 37 °C в течение 24 ч. Сгруппируйте и обработайте клетки, как указано выше на этапе 4.1, и установите три реплицируемые лунки в каждой группе.
- После лечения препаратом в течение 24 ч промыть клетки трижды PBS по 5 мин каждая и инкубировать на льду в течение 30 мин в подготовленном лизисном буфере. После лизиса центрифугируют клетки в течение 20 мин при 16 000 х г и 4 °C и собирают супернатанты.
- Определите концентрацию белка и отрегулируйте ее в соответствии с инструкциями с помощью анализа Брэдфорда. Разбавить образцы и денатурировать при 100 °C в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса состоит из ингибитора фосфатазы, ингибитора протеазы и лизата RIPA в объемном соотношении 1:1:50. В контрольной группе требуется 200 мкл/лунка лизисного буфера, а в других группах требуется 100 мкл/лунка лизисного буфера. Как правило, концентрации белка контрольной, модельной и двух типов комбинаций групп составляют 0,45 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0,32-0,39 мг/мл соответственно; их концентрации белка после разведения нагрузочным буфером составляют соответственно 0,36, 0,2 и 0,256-0,312 мг/мл. - Чтобы обнаружить белки с различной молекулярной массой, загрузите 25 мкг белка в каждую полосу, запустите 12% электрофорез SDS-PAGE и перенесите гель на мембраны PVDF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приготовления геля SDS он должен быть полностью перемешан без пузырьков или нерастворимых частиц; в противном случае могут возникать неравномерные или нерегулярные полосы. При переносе мембран убедитесь, что между мембраной PVDF и гелем нет пузырьков; в противном случае на полосе появятся белые пятна. Кроме того, этот этап необходимо выполнять при низких температурах, а мешок со льдом следует менять каждые 30 минут. - Блокируют мембраны с 5% обезжиренным молоком в течение 1,5 ч при РТ и инкубируют с 5 мл соответствующих первичных антител (Nrf2 1:1000, Akt 1:2000, p-Akt 1:2000, Bcl-2 1:5000 и Bax 1:1000) в течение 24 ч при 4 °C. Используйте β-актиновые (1:5000) антитела в качестве внутреннего контроля.
- Промыть мембраны TBST (три раза по 10 мин каждая), затем инкубировать с 5 мл вторичных HPR-конъюгированных антител (1:5000) при RT в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разведения антител не должен быть произвольно изменен, а мембраны должны быть промыты TBST достаточно в строгом соответствии с требованиями, чтобы избежать слишком черного цвета фона полосы. - Наконец, снова промыть мембрану TBST и обработать ее хемилюминесцентным субстратом HRP (в соответствии с инструкциями производителя) для обнаружения белковой полосы. Захват изображений с использованием системы визуализации хемилюминесценции и количественная оценка серых значений белков с помощью программного обеспечения для визуализации с β-актином в качестве сравнительного внутреннего контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Скрининг оптимальной комбинации инъекций Ast и капсулы Eri показан на рисунке 1. Выживаемость клеток при инъекции Ast и капсуле Eri на нормальных клетках PC12 показана на рисунке 1A. Жизнеспособность клеток была ниже 95% при инъекции Ast при концентрациях более 12 мкМ (Фиг.1А) и капсуле Эри при концентрациях более 5 мкМ (Фиг.1А), что указывает на то, что максимальная нетоксичная концентрация составляла 12 мкМ и 5 мкМ соответственно. Их цитотоксичность была больше, чем у астрагалозида А и скутелларина, используемого отдельно. Жизнеспособность инъекции Ast и капсулы Eri на поврежденных клетках PC12, индуцированных CoCl2, показана на рисунке 1B,C. По сравнению с модельной группой, инъекция Ast может улучшить выживаемость поврежденных клеток PC12 в диапазоне концентраций 6-12 мкМ (p < 0,05 или p < 0,01), а капсулы Eri при концентрации 2-5 мкМ могут улучшить выживаемость (p < 0,05 или p < 0,01). Инъекция АСТ и капсула Эри в соотношении 10:1, 8:4,2 и 6:1,8 мкМ могут значительно повысить жизнеспособность поврежденных клеток PC12 (p < 0,01) (рисунок 1D). Соотношение 6:1,8 мкМ показало наивысшую жизнеспособность клеток, что свидетельствует о том, что это оптимальная комбинация препарата и фармакологическая активность по сравнению с наилучшей комбинацией компонентов.
Оценка защитных эффектов двух видов комбинаций на поврежденные клетки PC12 показана на рисунке 2. По сравнению с модельной группой жизнеспособность клеток двух комбинаций была значительно повышена (p < 0,001), а комбинация компонентов превосходила комбинацию препаратов (рисунок 2A). Это говорит о том, что комбинация компонентов может способствовать выживанию клеток лучше, чем комбинация препаратов. Скорость апоптоза проверяли с помощью проточной цитометрии (рисунок 2B,C). По сравнению с нормальной группой, процент ранних, поздних и общих апоптотических клеток был значительно выше в модельной группе (p < 0,01 или p < 0,001). По сравнению с модельной группой процентное содержание апоптотических клеток на каждой стадии было значительно ниже в группах лечения (p < 0,05 или p < 0,01 или p < 0,001). Интенсивность флуоресценции экспрессии белка каспазы-3 в каждой группе показана на рисунке 2D,E. По сравнению с нормальной группой, интенсивность флуоресценции каспазы-3 была значительно выше в модельной группе. По сравнению с модельной группой интенсивность флуоресценции каспазы-3 была достоверно ниже в каждой группе лечения (p < 0,001 или p < 0,01) и была относительно ниже в группе комбинации компонентов, чем в группе комбинации препаратов. Эти результаты свидетельствуют о том, что клеточная модель может индуцировать апоптоз, а антиапоптозный эффект комбинации компонентов лучше, чем у комбинации препаратов.
Вестерн-блот обнаружил экспрессию белка p-Akt, Akt, Bcl-2 и Bax (рисунок 3). По сравнению с нормальной группой уровни экспрессии p-Akt/Akt и Bcl-2/Bax были значительно ниже в модельной группе (p < 0,01 или p < 0,001). По сравнению с модельной группой экспрессия p-Akt/Akt и Bcl-2/Bax была значительно выше в двух комбинациях (p < 0,05 или p < 0,01 или p < 0,001), особенно выше в комбинации компонентов. Результаты показывают, что комбинация компонентов превосходит комбинацию препаратов в содействии выживанию клеток, что связано с более сильным эффектом антиапоптоза, вызванным повышением регулирования сигнального пути Akt / Bcl-2 / Bax.
Флуоресценция DCFH может быть измерена флуоресцентным микроскопом для определения уровня АФК в клетках (рисунок 4A,B). Как показано на рисунке 4А, флуоресценция была почти незаметна в нормальных клетках, а флуоресценция в модельной группе была значительно усилена. Флуоресценция в обеих комбинациях была значительно снижена по сравнению с модельной группой. Как показано на рисунке 4B, относительная интенсивность флуоресценции была значительно слабее в каждой группе лечения по сравнению с модельной группой (p < 0,001). Флуоресценция имела тенденцию к снижению в группе комбинации компонентов по сравнению с комбинированной группой препарата, что указывает на то, что клеточная модель может индуцировать окислительное повреждение. Антиокислительный эффект комбинации компонентов лучше, чем у комбинации препаратов.
Вестерн-блот обнаружил экспрессию белка Nrf2 (рисунок 4C). По сравнению с нормальной группой экспрессия Nrf2 была значительно снижена в модельной группе (p < 0,05). По сравнению с модельной группой экспрессия белка Nrf2 была значительно выше в группах лечения (p < 0,01 или p < 0,05), особенно выше в группе комбинации компонентов (рисунок 4D). Это говорит о том, что комбинация компонентов лучше, чем комбинация препаратов, способствует выживанию клеток, что связано с более сильным антиоксидантным повреждением, вызванным повышением регулирования сигнального пути Nrf2.
В заключение, комбинация компонентов (10 мкМ астрагалозида А, 40 мкМ скутелларина и 75 мкМ хлорогеновой кислоты) может способствовать выживанию поврежденных клеток лучше, чем комбинация препарата (инъекция 6 мкМ Ast и капсула 1,8 мкМ Эри) за счет более сильной регуляции сигнальных путей, связанных с апоптозом и окислительным повреждением.
Для статистического анализа использовалось статистическое программное обеспечение SPSS 26.0, и все данные выражаются как средства ± стандартного отклонения (SD). Для сравнения между группами данные оценивались односторонним ANOVA, за которым следовал тест Туки. p < 0,05 было сочтено указывающим на статистически значимую разницу.
Рисунок 1: Влияние лекарств на жизнеспособность нормальных и поврежденных клеток PC12. (A) Влияние различных концентраций инъекции Ast и различных концентраций капсулы Eri на нормальные клетки PC12. (B) Скрининг эффективной концентрации инъекции Ast на поврежденных клетках PC12. (C) Скрининг эффективной концентрации капсулы Eri на поврежденных клетках PC12. (D) Влияние комбинаций двух препаратов в разных пропорциях на выживаемость поврежденных клеток PC12. Статистические значения выражаются как среднее ± SD из шести независимых экспериментов. &&p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. *p < 0,05 и **p < 0,01 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние двух комбинаций на выживаемость и апоптоз поврежденных клеток PC12. (A) Влияние комбинации компонентов и комбинации препаратов на выживаемость поврежденных клеток PC12. (B) График скорости апоптоза, обнаруженный Приложением V-PI. (C) Статистическая гистограмма скорости апоптоза. (D) Относительная интенсивность флуоресценции экспрессии белка каспазы-3 (400x). Шкала баров: 20 мкм. (E) Статистическая гистограмма интенсивности флуоресценции экспрессии белка каспазы-3. Статистические значения выражаются как среднее ± SD из трех независимых экспериментов, за исключением жизнеспособности клеток для шести независимых экспериментов. *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001 по сравнению с модельной группой. ##p < 0,01 по сравнению с комбинированной группой препарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние двух комбинаций на уровни экспрессии p-Akt, Akt, Bcl-2 и Bax. (A) Экспрессия белка p-Akt и Akt определяется анализом вестерн-блоттинга. (B) Статистическая гистограмма статистических данных о соотношении p-Akt/Akt в каждой группе. (C) Экспрессия белка Bcl-2 и Bax, определяемая с помощью вестерн-блот-анализа. (D) Статистическая гистограмма соотношения Bcl-2/Bax в каждой группе. Статистические значения выражаются как среднее ± SD из трех независимых экспериментов. *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние двух комбинаций на экспрессию белка Nrf2 и уровни АФК. (А) Уровни АФК были обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии (400x). Шкала: 20 мкм. (B) Статистическая гистограмма интенсивности флуоресценции АФК в каждой группе. (C) Экспрессия белка Nrf2, определяемая анализом вестерн-блоттинга. (D) Статистическая гистограмма экспрессии белка Nrf2. Статистические значения выражаются как среднее ± SD из трех независимых экспериментов. *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
До сих пор не хватает идеальных препаратов для лечения ишемии головного мозга в современной клинической практике2. Под руководством дополнения ци и активации метода кровообращения АСТ, Эри и другие препараты были использованы в комбинации в клинической практике ТКМ и достигли хороших комплексных преимуществ 13,14,15. Большое количество исследований показало, что АСТ может улучшить проницаемость гематоэнцефалического барьера, увеличить мозговой кровоток, улучшить способность нервных клеток переносить гипоксию и противостоять повреждению свободными радикалами кислорода, а также может значительно улучшить неврологическую дисфункцию16,17. Особенно подходит при старческих ишемических цереброваскулярных заболеваниях16,17. Эри может расширять кровеносные сосуды, увеличивать кровоснабжение мозга, удалять АФК и уменьшать перекисное окисление липидов18,19. Однако синергетический эффект, фармакодинамические компоненты и механизм комбинации двух препаратов до сих пор неясны, что является общей проблемой, ограничивающей клиническое применение ТКМ.
Ишемическая и гипоксическая среда хронической ишемии головного мозга вызывает повреждение окислительным стрессом и, в то же время, активирует сигнальный путь апоптоза клеток головного мозга для содействия апоптозу нейронов20,21. Путь PI3K/Akt является классическим антиапоптотическим и про-выживанием сигнальным путем трансдукции22,23, среди которых белки семейства Bcl-2 и семейство каспазы являются последующими исполнительными белками этого сигнального пути. Фосфорилированный Akt может прямо или косвенно регулировать семейство Bcl-2 и ингибировать активацию нисходящего пути каспазы-3, тем самым оказывая антиапоптотический эффект11. Кроме того, избыток АФК, генерируемый гипоксией, может вызвать повреждение окислительным стрессом, в то время как фосфорилированный Akt может активировать Nrf2 для устранения избытка АФК для борьбы с повреждением окислительным стрессом12,24. Таким образом, активация пути PI3K/Akt/Nrf2 может эффективно предотвращать и контролировать окислительный стресс и апоптоз, тем самым уменьшая гипоксически-ишемическую черепно-мозговую травму25,26.
В исследовании комбинацию препаратов проверяли с использованием поврежденной модели клеток PC12, а эффект и механизм в этой модели сравнивали с комбинацией компонентов, экранированной ранее7. Кроме того, максимальная нетоксичная концентрация инъекции Ast и капсулы Eri составляет 12 мкМ (рассчитывается по астрагалозиду А) и 5 мкМ (рассчитывается по скутелларину) соответственно, в то время как максимальная нетоксичная концентрация астрагалозида А и скутелларина составляет 20 мкМ и 50 мкМ соответственно7. Это показывает, что комбинация компонентов безопаснее, чем комбинация препаратов, с более контролируемым качеством и всеобъемлющими преимуществами высокой эффективности и низкой токсичности.
Современные клеточные модели, которые могут быть использованы для моделирования ишемии головного мозга, в основном включают физическую гипоксию (индуцированную OGD) и химическую гипоксию (индуцированную Na2S2O4 или CoCl2)27. Среди них травмы как OGD, так и Na2S2O4 имеют короткое время гипоксии и не подходят для моделирования хронической ишемии27. CoCl 2-индуцированная гипоксия является одной из наиболее часто используемых имитаций гипоксии по сравнению с OGD и использованием других имитаций гипоксии. Это может привести к стойкому и стабильному окислительному повреждению АФК и вызвать типичные апоптотические изменения в различных клеточных линиях27. Поэтому в этом исследовании CoCl2 использовали в течение 24 ч для моделирования гипоксии нейронов28,29. Была проведена проверка его концентрации моделирования (0,1, 0,2, 0,4 и 0,8 мМ) и срока действия (1 и 7 дней). Кроме того, учитывая неизбежную нехватку глюкозы и кислорода после ишемии головного мозга, безглюголовая и гипоксическая среда может лучше имитировать ишемическое повреждение головного мозга. Это исследование показало, что 0,4 мМ CoCl2 в сочетании с безглюсодержащей средой в течение 24 ч может создать стабильную и контролируемую модель хронических гипоксических клеток. В последующем исследовании животная модель хронической ишемии головного мозга будет использоваться для дальнейшего подтверждения терапевтических преимуществ комбинации компонентов in vivo.
Эта клеточная модель может увеличить скорость апоптоза, интенсивность флуоресценции каспазы-3 и внутриклеточный уровень АФК (рисунок 2 и рисунок 4), что может лучше имитировать патологические изменения хронической ишемии головного мозга, такие как апоптоз, окислительный стресс и т. Д. На основе этой модели было обнаружено, что два типа комбинаций могут ингибировать апоптоз и повреждение окислительным стрессом. Влияние комбинации компонентов на повышение выживаемости клеток было значительно лучше, чем у комбинации препаратов (рисунок 1); обе комбинации могут в разной степени повышать уровни экспрессии P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax и Nrf2 (рисунок 3 и рисунок 4). В частности, комбинация компонентов оказывала более сильное влияние на повышение регуляции сигнального пути Akt/Bcl-2/Bax и Nrf2. Эти результаты показывают, что комбинация компонентов может лучше противостоять повреждению клеток, чем комбинация препаратов, которая связана с более сильным антиапоптозом и антиоксидантным стрессом.
В заключение, эти результаты обеспечивают комбинированную стратегию двух трав для лечения поврежденных клеток PC12 и дают новую идею для оценки и оптимизации режима комбинированного применения двух трав. В целом, это исследование является справочным материалом для выбора комбинации активных компонентов ТКМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось ключевыми научно-исследовательскими проектами Департамента науки и техники провинции Сычуань (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
