Summary
Detta protokoll ger en kombinationsstrategi av två örter för att behandla skadade PC12-celler. Protokollet ger en referens för att optimera det bästa applikationsläget för traditionell kinesisk medicin (TCM).
Abstract
Med tanke på fördelarna med kombinationen av traditionell kinesisk medicin (TCM) vid behandling av cerebral ischemi studerade vi skillnaderna i effekt och mekanism mellan preparatkombinationen och komponentkombinationen för att utforska de två örtkombinationsstrategierna för att behandla skadade PC12-celler. Koboltklorid (CoCl2) kombinerat med ett glukosfritt medium användes för att inducera oxidativ skada på PC12-celler. Därefter valdes den optimala kombinationen av Astragalus mongholicus (Ast) och Erigeron breviscapus (Eri) injektion och kombinerades enligt enhetliga designmetoder efter screening av deras säkra och effektiva koncentration på PC12-celler. Vidare innefattar den screenade komponentkombinationen 10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin och 75 μM klorogensyra i två örter. Därefter användes MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescens och Western blot-analys för att utvärdera effekten och mekanismen för preparatkombinationen och komponentkombinationen på skadade PC12-celler. Resultaten visade att den optimala kombinationen för cellöverlevnad var Ast-injektion och Eri-kapsel med en koncentration på 6:1,8 (μM). Komponentkombinationen (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin och 75 μM klorogensyra) var effektivare än preparatkombinationen. Båda kombinationerna reducerade anmärkningsvärt apoptotisk hastighet, fluorescensintensiteten hos kaspas-3 och intracellulära reaktiva syrearter (ROS) nivå; under tiden uppreglerade de uttrycksnivåerna för p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax och Nrf2. Dessa effekter var tydligare i komponentkombinationen. Sammanfattningsvis kan båda kombinationerna hämma skadan inducerad av CoCl2 i kombination med ett glukosfritt medium på PC12-celler, vilket främjar cellöverlevnad. Komponentkombinationens effektivitet över preparatkombinationen kan emellertid bero på dess starkare reglering av PI3K / Akt / Nrf2-signalvägen relaterad till oxidativ stress och apoptos.
Introduction
Kronisk cerebral ischemi, orsakad av cerebral hypoperfusion, är en vanlig sjukdom hos medelålders ochäldre 1. Som en långvarig ockult ischemi sjukdom, Det kan leda till progressiv eller ihållande neurologisk dysfunktion. De huvudsakliga patologiska mekanismerna innefattar cellapoptos och oxidativ skada, vilket leder till progressiv eller ihållande neurologisk dysfunktion; detta är den patologiska grunden för Alzheimers sjukdom, vaskulär demens och andra sjukdomar, och påverkar allvarligt patienternas livskvalitet. Det saknas emellertid fortfarande ideala läkemedel i modern medicin för att behandla kronisk cerebral ischemi2. Samtidigt har kombinationen av Astragalus mongholicus (Ast) och Erigeron breviscapus (Eri) använts i stor utsträckning i klinisk praxis av traditionell kinesisk medicin (TCM)4. Kombinationsstrategin har anmärkningsvärt förbättrats för att främja återhämtningen av nervfunktionen efter cerebral ischemi, vilket är bättre än för ett enda läkemedel; Det finns emellertid stora skillnader i doseringsförhållandet i kombinationen av de två läkemedlen4. De effektiva komponenterna och verkningsmekanismen är inte väldefinierade, vilket är nyckelfrågan som begränsar dess kliniska tillämpning.
Tidigare studier har visat den synergistiska effekten av preparatkombinationen av ASAT-injektion och Eri-injektion vid behandling av cerebral ischemi hos råtta. Det kan uppreglera uttrycket av p-Akt-protein och nedreglera uttrycket av Bcl-2-associerat dödspromotorprotein (BAD) 5,6, vilket är ett av B-lymfoblastom 2(Bcl-2) familjeproteiner och har effekten att främja apoptos. Den materiella grunden och mekanismen för dess synergistiska effekt är emellertid inte klarlagda. Vidare etablerades skademodellen för PC12-celler med CoCl2 kombinerat glukosfritt medium, och den optimala komponentkombinationen i AST och Eri har screenats och definierats7.
I denna studie screenas de effektiva doserna av AST och Eri med hjälp av den skadade PC12-cellmodellen. Den optimala kombinationen av de två läkemedlen screenas med hjälp av denna modell i kombination med den homogena designmetoden. Cellmodellen används för att ytterligare utvärdera skillnaden i effekter och mekanismer av preparatkombinationen och komponentkombinationen i skadade PC12-celler. Denna strategi syftar till att utforska skyddseffekten och regleringsmekanismen för de två typerna av kombinationer på skadade PC12-celler genom PI3K / Akt / Nrf2-signalvägen för att bestämma det bästa kombinationsläget. Denna studie ger en referens för att optimera det bästa applikationsläget för TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagens
- Bered hela mediet genom att tillsätta 90 ml DMEM högsockermedium, 10 ml fetalt bovint serum (FBS) och 1 ml penicillin-streptomycinlösning i en 125 ml steril odlingskolv. Blanda hela mediet och förvara vid 4 °C under stängda förhållanden.
- Bered CoCl2-lösning genom att tillsätta 0,02 gCoCl2-pulver (noggrant vägt) i 10 ml DMEM sockerfritt medium (löst fullständigt) för att erhålla en 8,4 mM stamlösning. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm bakteriefilter, försegla den och förvara den vid 4 °C från ljus.
OBS: CoCl2 är instabil och bör förvaras i en lufttät behållare, skyddad mot ljus; giltighetsperioden för CoCl2-lösningen är 7 dagar. - Bered Tris-Hcl buffrad saltlösning (TBST).
- Väg noggrant 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid och 3 g Tris-bas. Tillsätt dem i en 1 L bägare och tillsätt sedan 1 000 ml RO-vatten för att lösa upp blandningen.
- Justera pH till 7,4, tillsätt 1 ml Tween 20 och blanda noggrant för att få TBST-lösningen.
OBS: Tween 20 fungerar som ett ytaktivt medel för att minska den ospecifika bindningen av antikroppar till antigener och fungerar bäst vid 0,1% koncentration.
- Bered MTT-lösning (3-(4,5-dimetyltiazol-2)-2,5-difenyltetrazoliumbromidsalt) genom att väga 0,1 g MTT-pulver i 20 ml PBS-lösning för att erhålla en 5 mg/ml stamlösning. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm bakteriefilter, försegla den och förvara den vid 4 °C från ljus, placerad i standby.
MTT-pulver är instabilt och absorberar lätt fukt, så det bör förvaras på en stängd och torr plats borta från ljus. MTT-lösningen upphör att gälla efter 7 dagar. MTT har en cancerframkallande effekt, så undvik direktkontakt med huden. - Bered Eri-kapsellösningen genom att ta bort kapselhöljet och noggrant väga 0,18 g av innehållet i 10 ml DMEM sockerfritt medium för att bereda en 100 μM stamlösning (baserat på koncentrationen av scutellarin). Filtrera lösningen med ett 0,2 μm bakteriefilter, försegla den och förvara den i en lufttät behållare vid 4 °C.
OBS: Scutellarin är den huvudsakliga aktiva ingrediensen i Erigeron breviscapus. Koncentrationen av scutellarin i kapslarna har bestämts med HPLC-UV till 2,56 mg/g, dvs 5,54 μmol/g8. Koncentrationen av preparatet beräknas baserat på scutellarinkoncentrationen. Detta är lämpligt för att utvärdera preparatets farmakologiska aktivitet och komponenten. - Bered lösningen av ASAT-injektionen genom att tillsätta 5 ml injektion och 5 ml sockerfritt DMEM-medium i ett 15 ml sterilt centrifugrör för att bereda en 60 μM stamlösning (baserat på koncentrationen av astragalosid A). Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm bakteriefilter och förvara den i en lufttät behållare vid 4 °C.
OBS: Injektionsvolymen är 10 ml vardera och koncentrationen av astragalosid A i injektionen har bestämts av HPLC-ELSD till 0,094 mg/ml (dvs. 120 μM)9. Beredningen ska utföras i ett biosäkerhetsskåp och användas på ett ljustätt sätt hela tiden. Volymen av injektionslösningen och det sockerfria mediet bör mätas noggrant och blandas väl. - Bered astragalosid A-lösning genom att noggrant väga 7,85 mg astragalosid A-standard och lösa den fullständigt i 2 ml dimetylsulfoxid (DMSO) för att bereda en 5 000 μM stamlösning. Filtrera det med ett 0,22 μm bakteriefilter och förvara det lufttätt vid 4 °C.
OBS: Astragalosid A-pulver är olösligt i det sockerfria mediet. Vid beredning av lösningen, lös upp den med lämplig mängd DMSO för att hålla den slutliga experimentella koncentrationen av DMSO under 0,1% för att säkerställa ingen cytotoxicitet. - Bered scutellarinlösningen genom att väga 11,56 mg scutellarinstandard noggrant och fullständigt lösa den med 5 ml sockerfritt DMEM-medium för att bereda en 5 000 μM stamlösning. Filtrera det med ett 0,22 μm bakteriefilter och förvara det lufttätt vid 4 °C.
- Bered klorogensyralösningen genom att väga 8,86 mg klorogensyrastandard noggrant och fullständigt och lös den med 5 ml sockerfritt DMEM-medium för att bereda en 5 000 μM stamlösning. Filtrera det med ett 0,22 μm bakteriefilter och förvara det lufttätt vid 4 °C.
OBS: Klorogensyrapulver är instabilt och absorberar lätt vatten. Den ska förseglas och förvaras vid 4 °C avstånd från ljus. Exponeringstiden bör minimeras under vägning.
2. Analys av cellviabilitet
- Skaffa PC12-celler och odla dem i DMEM kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin.
OBS: I denna studie erhålls cellerna från den kinesiska vetenskapsakademin. PC12-celler är vidhäftande celler som har de allmänna egenskaperna hos neuroendokrina celler och används ofta inom neurofysiologi och neurofarmakologi. - Odla cellerna vid 37 °C i en inkubator kompletterad med 5% CO 2 och subkultur dem var2-3 dagar. Använd celler vid passagerna 4-8 för alla experiment.
- Cellodling
- Behandla PC12-celler i den logaritmiska tillväxtfasen (70% -80% cellsammanflöde) med 1 ml trypsin (0,25%) och observera cellerna under ett mikroskop. När cellerna blir runda, stoppa trypsinsmältningen genom att tillsätta 3 ml av hela mediet.
- Överför cellerna till ett sterilt 15 ml centrifugrör och centrifugera cellerna vid 840 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten, suspendera igen med hela mediet och överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Räkna sedan antalet celler med hjälp av en flödescytometer.
- Starta flödescytometriprogramvaran, välj motsvarande utspädningsmultipel av celllösningen i räkningsinställningen och klicka på densitetsdiagram efter att ha laddat cellprovet från 1,5 ml mikrocentrifugröret.
- Cirkel cellpopulationen bort från X-axeln och Y-axeln, högerklicka på datatabellen under bilden och välj X, Y, Antal och Abs-antal. Data under Abs Count i datatabellen ger cellräkningsresultatet.
- Justera cellkoncentrationen till 1 x 10 5 celler/ml, inokulera 100 μl/brunn i plattor med 96 brunnar och odla vid 37 °C och5 %CO2 i en inkubator i 24 timmar.
- Screening av säkra koncentrationer av två läkemedel på normala PC12-celler
- Odla cellerna enligt beskrivningen i steg 2.1-2.2. Kassera supernatanten och behandla de normala cellerna med olika slutliga koncentrationer av AST injektion (4, 8, 12, 16, 20 och 24 μM) och Eri kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 och 20 μM). Behandla sex replikatbrunnar i varje grupp i 24 timmar.
OBS: Läkemedlen tillsätts till media för att uppnå den slutliga koncentrationen av läkemedlet (nämns i steg 2.4.1), och sedan tillsätts en lika stor volym media till varje brunn. Vid aspirering av supernatanten ska pipettspetsen placeras försiktigt mot brunnväggen för att undvika kontakt med cellerna i botten av brunnen. När du lägger till olika lösningar, lägg dem försiktigt och snabbt längs brunnarnas kanter och var uppmärksam när du byter pipettpistolhuvud för att undvika att påverka experimentresultaten. - Kassera supernatanten, tillsätt 120 μl MTT-lösning (1 mg/ml) till varje brunn och inkubera cellerna i 4 timmar vid 37 °C.
- Efter inkubationen, kassera supernatanten igen och tillsätt 150 μL DMSO till varje brunn. Skaka plattan i 10 minuter med en hastighet av 240 gånger/min (antal horisontella vibrationer per minut) med en virveloscillator.
- Mät absorptionsförmågan hos varje prov vid 490 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Beräkna cellviabiliteten (%), vilket är absorbansen hos den behandlade gruppen/absorbansen hos normal grupp (kontroll) x 100.
Säkerställ att MTT-lösningen ligger inom giltighetsperioden. Om färgen har ändrats (till mörkgrön) kan den inte användas. Vid testning av cellernas absorbans bör en blindbrunn (odlingsmedium och MTT, utan celler eller läkemedel) ställas in för att eliminera interferens av andra reagens. En volym på 150 μL DMSO tillsätts till varje brunn och skakas i 10 minuter för att lösa upp de blålila kristallerna bättre. Absorbansen bör detekteras så snart som möjligt för att säkerställa resultatens noggrannhet.
- Odla cellerna enligt beskrivningen i steg 2.1-2.2. Kassera supernatanten och behandla de normala cellerna med olika slutliga koncentrationer av AST injektion (4, 8, 12, 16, 20 och 24 μM) och Eri kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 och 20 μM). Behandla sex replikatbrunnar i varje grupp i 24 timmar.
- Screening av effektiva koncentrationer av två läkemedel på skadade PC12-celler
- Odla cellerna i 24 timmar som nämns i steg 2.1-2.2, kassera supernatanten och behandla sedan cellerna med 20 μl/brunnCoCl2 (0,4 mM) kombinerat med det sockerfria mediet.
- Behandla cellerna samtidigt med 100 μl/brunn ASAT-injektion (slutliga koncentrationer är 2, 6, 8, 10 och 12 μM) eller 100 μl Eri-kapsel (slutliga koncentrationer är 1, 2, 3, 4 och 5 μM) vid 37 °C i ytterligare 24 timmar. Tillsätt 120 μl/brunn komplett medium till kontrollgruppen.
OBS: CoCl2 inducerar hypoxiska tillstånd i cellerna. - Mät absorptionsförmågan hos varje prov med MTT-metoden och beräkna cellviabiliteten enligt beskrivningen tidigare i steg 2.4.2 och 2.4.3.
- Screening av den optimala kombinationen av två läkemedel baserat på den homogena designmetoden
OBS: Efter att ha erhållit det effektiva koncentrationsintervallet för Astragalus-injektionen och breviscapus-kapseln användes tabellen för enhetlig designmetod U 7 (7 4) för att erhålla sex olika kombinationer av de två läkemedlen. Ast-injektion:Eri-kapsel: 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM och 6)12:3,4 μM.- Odla cellerna enligt beskrivningen ovan i steg 2.3.1 och behandla de skadade PC12-cellerna med sex andelar koncentrationer av Ast-injektion: Eri-kapsel som nämnts ovan.
- Behandla cellerna i 24 timmar och beräkna cellviabiliteten enligt beskrivningen tidigare i steg 2.4.2 och 2.4.3.
- Utvärdering av den skyddande effekten av två optimala kombinationer på skadade PC12-celler
OBS: Efter att ha erhållit den optimala preparatkombinationen (Ast-injektion: Eri-kapsel på 6: 1.8 μM) och den optimala komponentkombinationen7 (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin och 75 μM klorogensyra) utförs ytterligare utvärdering för att kontrollera deras skyddande effekter på skadade PC12-celler.- Odla cellerna som beskrivits ovan i steg 2.3.1 och behandla de skadade PC12-cellerna med de två typerna av kombinationer av läkemedel som diskuterats i NOTE ovan.
- Behandla cellerna i 24 timmar och beräkna cellviabiliteten enligt beskrivningen tidigare i steg 2.4.2 och 2.4.3.
3. Annexin V-FITC / PI-analys för apoptoshastighet
- Ymp PC12-cellerna i en platta med 12 brunnar i en koncentration av 1,3 x 105 celler/brunn och odla dem vid 37 °C i 24 timmar.
- Gruppera cellerna: kontrollgrupp, modellgrupp och två kombinationer av läkemedel. Tillsätt 1,2 ml/brunn komplett medium till kontrollgruppen, tillsätt 1,2 ml/brunn media innehållande 0,4 mM CoCl2 till modellgruppen och tillsätt 1,2 ml/brunn av var och en av de två kombinationerna innehållande 0,4 mMCoCl2. Inkubera cellerna vid 37 °C i ytterligare 24 timmar.
- Efter läkemedelsbehandling, behandla cellerna med 250 μL / brunn trypsin, överför cellerna i ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 840 xg i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 500 μl av bindningsbufferten.
- Inkubera cellerna i mörker med 5 μL Annexin V-FITC och 10 μL propidiumjodid (PI) i 15 minuter vid RT och kontrollera sedan apoptos med flödescytometri. Ställ in tre replikatbrunnar i varje grupp.
OBS: Trypsinet som används i detta test kan inte innehålla EDTA eftersom EDTA är ett metalljonkelatbildande medel som konkurrerar med annexin V för att binda kalciumjoner och påverkar affiniteten hos annexin för PI. När apoptos inträffar vänder fosfoserin, ursprungligen på insidan av cellmembranet, utåt mot cellytan, och Annexin V-FITC binder selektivt till fosfoserin utanför membranet för att visa grön fluorescens. - Klicka på Automatisk kompensation på Start-menyn , välj FITC, PE, PerCP och APC i Välj kanal och välj Kompensation vid: Höjd. Klicka på OK i statistikobjektet: median. Med samma cellräkningsmetod som nämns i steg 2.3.2 samlar du in cellproverna, klickar på densitetskartan och cirklar in den effektiva cellpopulationen.
- Med FITC-fluorescens som X-axelparameter och andra fluorescensparametrar som Y-axelparameter skapar du ett densitetsschema. Klicka på Kompensationsmatris i Start-menyn och Koefficient i överflödesmatrisen. Information om densitetskartan visas för analys av apoptoshastigheten.
- Inkubera cellerna i mörker med 5 μL Annexin V-FITC och 10 μL propidiumjodid (PI) i 15 minuter vid RT och kontrollera sedan apoptos med flödescytometri. Ställ in tre replikatbrunnar i varje grupp.
4. Immunofluorescensdetektion av kaspas-3-generationen
- Frö PC12-cellerna på täckglas med en densitet av 8 x 104 celler/täckglas och placera dem i plattor med 24 brunnar vid 37 °C i 24 timmar. Gruppera cellerna enligt ovan i steg 3.2; Ställ in tre replikerade täckglas för varje grupp.
- Efter läkemedelsbehandling, skölj täckglasen två gånger med PBS (37 ° C) i 5 minuter vardera, fixa dem med 4% paraformaldehyd i 15 minuter och permeabilisera med 0,5% Triton X-100 i 20 minuter vid RT.
- Skölj cellerna igen och blockera dem med 10% getserum i 1 h vid RT.
- Inkubera varje täckglas med 200 μl primär antikropp kaspas-3 (ett viktigt exekutivt protein av apoptos) utspätt i en koncentration av 1:250 i 1x TBST, över natten vid 4 °C. Tvätta med 1x TBST (tre gånger i 3 min vardera) och inkubera med 200 μL sekundär antikropp (1:300 spädning i 1x TBST) i 1 timme vid RT i mörker.
OBS: Fluorescensen släcks lätt; Således, efter inkubation av den sekundära antikroppen, bör glasen hållas borta från ljus. De primära och sekundära antikropparna ska förvaras vid 4 °C borta från ljus. - Tillsätt 300 μL DAPI (0,5 μg/ml) till täckglasen (för att detektera kärnorna) i 10 minuter och tvätta cellerna tre gånger med 1x TBST i 5 minuter vardera.
- Observera täckglasen under fluorescensmikroskopet och ta bilder10. Utför statistisk analys av fluorescensintensiteten med hjälp av bildbehandlingsprogrammet.
OBS: De glas och täckglas som används ska vara rena och sterila. Vid färgning, var uppmärksam på färglösningens pH, koncentration och temperatur och undvik fluorescenssläckning. Det fluorescerande mikroskopet ska slås på minst 15 minuter i förväg för att förvärma kvicksilverlampan och stängas av i 30 minuter innan det slås på igen. Vid förvärv av bilder bör exponeringsparametrarna för samma färgämne i samma sats experiment vara konsekventa för att säkerställa resultatens noggrannhet.
5. Immunofluorescensanalys av ROS-nivå
- Odla och behandla cellerna enligt beskrivningen i steg 4.1.
- Efter läkemedelsbehandling, tvätta varje täckglas tre gånger med PBS i 3 minuter och inkubera med 400 μL DCFH-DA (10 μM) vid 37 °C i 20 minuter.
OBS: DCFH-DA är en universell indikator på oxidativ stress. Den har cellmembranpermeabilitet och ingen fluorescens. När den kommer in i cellen hydrolyseras den av esteras för att producera 2',7'-diklorodihydrofluorescein (DCFH) och oxideras sedan snabbt för att producera en stark fluorescerande produkt. - Tvätta cellerna igen med serumfritt DMEM (två gånger i 3 minuter vardera) och observera omedelbart täckglaset efter tillsats av fluorescenssläckningsmedlet under fluorescensmikroskopet. Beräkna den relativa fluorescensintensiteten med bildbehandlingsprogrammet.
OBS: När du har laddat DCFH-DA-sonden, var noga med att rengöra restsonden som inte kommer in i cellen, annars blir bakgrunden hög.
6. Western blot-detektion av proteinuttryck av Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 och Bax11,12
- Inokulera PC12-celler i 6-brunnsplattor i en koncentration av 1 x 106 celler/brunn och odla vid 37 °C i 24 timmar. Gruppera och behandla cellerna enligt ovan i steg 4.1 och ställ in tre replikatbrunnar i varje grupp.
- Efter läkemedelsbehandling i 24 timmar, tvätta cellerna tre gånger med PBS i 5 minuter vardera och inkubera på is i 30 minuter i beredd lysbuffert. Efter lys, centrifugera cellerna i 20 minuter vid 16 000 x g och 4 °C och samla upp supernatanterna.
- Upptäck proteinkoncentrationen och justera enligt instruktionerna genom Bradford-analysen. Späd proverna och denaturera vid 100 °C i 10 minuter.
OBS: Lysbufferten består av fosfatashämmare, proteashämmare och RIPA-lysat i ett volymförhållande på 1:1:50. I kontrollgruppen krävs 200 μl/brunn lysbuffert och 100 μl/brunn lysbuffert i de andra grupperna. I allmänhet är proteinkoncentrationerna för kontroll-, modell- och två typer av kombinationsgrupper 0,45 mg / ml, 0,25 mg / ml respektive 0,32-0,39 mg / ml; deras proteinkoncentrationer efter utspädning med laddningsbufferten är 0,36, 0,2 respektive 0,256-0,312 mg / ml. - För att detektera proteiner med olika molekylvikter, ladda 25 μg protein i varje körfält, kör en 12% SDS-PAGE-elektrofores och överför gelén till PVDF-membran.
OBS: Under beredningen av SDS-gel måste den blandas fullständigt utan bubblor eller olösliga partiklar; Annars kan ojämna eller oregelbundna band uppstå. Vid överföring av membranen, se till att det inte finns några bubblor mellan PVDF-membranet och gelén. Annars kommer vita fläckar att visas i remsan. Dessutom måste detta steg utföras vid låga temperaturer, och ispåsen ska bytas var 30: e minut. - Blockera membranen med 5 % fettfri mjölk i 1,5 h vid rumstemperatur och inkubera med 5 ml av motsvarande primära antikroppar (Nrf2 1:1 000, Akt 1:2 000, p-Akt 1:2 000, Bcl-2 1:5 000 och Bax 1:1 000) i 24 timmar vid 4 °C. Använd β-aktin (1:5 000) antikropp som en intern kontroll.
- Tvätta membranen med TBST (tre gånger i 10 minuter vardera) och inkubera sedan med 5 ml sekundära HPR-konjugerade antikroppar (1:5 000) vid rumstemperatur i 2 timmar.
OBS: Utspädningsförhållandet för antikropparna bör inte ändras godtyckligt och membranen bör tvättas med TBST tillräckligt i strikt överensstämmelse med kraven för att undvika att bandets bakgrundsfärg blir för svart. - Slutligen tvätta membranet med TBST igen och behandla det med kemiluminescerande HRP-substrat (enligt tillverkarens instruktioner) för detektering av proteinband. Ta bilderna med hjälp av kemiluminiscensavbildningssystemet och kvantifiera virusens gråvärden med hjälp av bildbehandlingsprogrammet, med β-aktin som jämförande intern kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screening av den optimala kombinationen av AST injektion och Eri-kapsel visas i figur 1. Cellöverlevnaden för ASAT-injektion och Eri-kapsel på normala PC12-celler visas i figur 1A. Cellviabiliteten var lägre än 95 % vid ASAT-injektion vid koncentrationer högre än 12 μM (figur 1A) och Eri-kapsel vid koncentrationer större än 5 μM (figur 1A), vilket indikerar att den maximala icke-toxiska koncentrationen var 12 μM respektive 5 μM. Deras cytotoxicitet var större än för astragalosid A och scutellarin som användes ensamt. Viabiliteten för ASAT-injektion och Eri-kapsel på de skadade PC12-cellerna inducerade av CoCl2 visas i figur 1B, C. Jämfört med modellgruppen kan ASAT-injektion förbättra överlevnaden för de skadade PC12-cellerna i koncentrationsområdet 6-12 μM (p < 0,05 eller p < 0,01), och Eri-kapslar vid koncentrationen 2-5 μM kan förbättra överlevnaden (p < 0,05 eller p < 0,01). ASAT-injektion och Eri-kapsel i förhållandet 10:1, 8:4,2 och 6:1,8 μM kan avsevärt öka livskraften hos PC12-skadecellerna (p < 0,01) (figur 1D). Förhållandet 6:1,8 μM uppvisade den högsta cellviabiliteten, vilket indikerar att det är den optimala preparatkombinationen och farmakologiska aktiviteten jämfört med den bästa komponentkombinationen.
Utvärderingen av de skyddande effekterna av två typer av kombinationer på de skadade PC12-cellerna visas i figur 2. Jämfört med modellgruppen främjades cellviabiliteten hos de två kombinationerna signifikant (p < 0,001) och komponentkombinationen var överlägsen preparatkombinationen (figur 2A). Detta tyder på att komponentkombinationen kan främja cellöverlevnad bättre än preparatkombinationen. Apoptoshastigheten testades med flödescytometri (figur 2B,C). Jämfört med normalgruppen var procentandelen tidiga, sena och totala apoptotiska celler signifikant högre i modellgruppen (p < 0,01 eller p < 0,001 ). Jämfört med modellgruppen var procentandelen apoptotiska celler i varje steg signifikant lägre i behandlingsgrupperna (p < 0,05 eller p < 0,01 eller p < 0,001). Fluorescensintensiteten för kaspas-3-proteinuttryck i varje grupp visas i figur 2D,E. Jämfört med normalgruppen var fluorescensintensiteten för kaspas-3 signifikant högre i modellgruppen. Jämfört med modellgruppen var fluorescensintensiteten för kaspas-3 signifikant lägre i varje behandlingsgrupp (p < 0,001 eller p < 0,01) och var relativt lägre i komponentkombinationsgruppen än preparatkombinationsgruppen. Dessa resultat tyder på att cellmodellen kan inducera apoptos, och anti-apoptoseffekten av komponentkombinationen är bättre än för preparatkombinationen.
Western blot detekterade proteinuttrycket p-Akt, Akt, Bcl-2 och Bax (figur 3). Jämfört med normalgruppen var uttrycksnivåerna för p-Akt/Akt och Bcl-2/Bax signifikant lägre i modellgruppen (p < 0,01 eller p < 0,001). Jämfört med modellgruppen var uttrycket av p-Akt/Akt och Bcl-2/Bax signifikant högre i de två kombinationerna (p < 0,05 eller p < 0,01, eller p < 0,001), specifikt högre i komponentkombinationen. Resultaten tyder på att komponentkombinationen är överlägsen preparatkombinationen för att främja cellöverlevnad, vilket är relaterat till den starkare anti-apoptoseffekten som produceras genom uppreglering av Akt/Bcl-2/Bax-signalvägen.
Fluorescensen hos DCFH kan mätas med ett fluorescensmikroskop för att bestämma nivån av ROS i cellerna (figur 4A,B). Som visas i figur 4A var fluorescensen nästan osynlig i de normala cellerna, och fluorescensen i modellgruppen förbättrades signifikant. Fluorescensen i båda kombinationerna reducerades signifikant jämfört med modellgruppen. Som visas i figur 4B var den relativa fluorescensintensiteten signifikant svagare i varje behandlingsgrupp jämfört med modellgruppen (p < 0,001). Fluorescens hade en tendens att minska i komponentkombinationsgruppen jämfört med preparatkombinationsgruppen, vilket indikerar att cellmodellen kan inducera oxidativ skada. Den antioxidativa skadeeffekten av komponentkombinationen är bättre än den för preparatkombinationen.
Western blot detekterade uttrycket av Nrf2-proteinet (figur 4C). Jämfört med normalgruppen reducerades uttrycket av Nrf2 signifikant i modellgruppen (p < 0,05). Jämfört med modellgruppen var uttrycket av Nrf2-protein signifikant högre i behandlingsgrupperna (p < 0,01 eller p < 0,05), särskilt högre i komponentkombinationsgruppen (figur 4D). Detta tyder på att komponentkombinationen är bättre än preparatkombinationen för att främja cellöverlevnad, vilket är relaterat till den starkare antioxidativa skadan som produceras genom uppreglering av Nrf2-signalvägen.
Sammanfattningsvis kan komponentkombinationen (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin och 75 μM klorogensyra) främja överlevnaden av skadade celler bättre än preparatkombinationen (6 μM Ast-injektion och 1,8 μM Eri-kapsel) genom starkare reglering av signalvägar relaterade till apoptos och oxidativ skada.
SPSS statistisk programvara 26.0 användes för statistisk analys, och alla data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelse (SD). För jämförelser mellan grupper utvärderades data med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys test. p < 0,05 ansågs indikera en statistiskt signifikant skillnad.
Figur 1: Effekter av läkemedel på livskraften hos normala och skadade PC12-celler. (A) Effekter av olika koncentrationer av ASAT-injektion och olika koncentrationer av Eri-kapsel på normala PC12-celler. (B) Screening av den effektiva koncentrationen av ASAT-injektion på skadade PC12-celler. (C) Screening av den effektiva koncentrationen av Eri-kapseln på skadade PC12-celler. (D) Effekter av kombinationer av två läkemedel i olika proportioner på överlevnadsgraden för skadade PC12-celler. Statistiska värden uttrycks som medelvärdet ± SD från sex oberoende experiment. &&p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. *p < 0,05 och **p < 0,01 jämfört med modellgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekter av två kombinationer på överlevnad och apoptos hos skadade PC12-celler. (A) Effekten av komponentkombinationen och preparatkombinationen på överlevnadsgraden för skadade PC12-celler. (B) Diagram över apoptoshastighet detekterad av bilaga V-PI. (C) Statistiskt histogram över apoptoshastigheten. (D) Den relativa fluorescensintensiteten för kaspas-3-proteinuttryck (400x). Skalstreck: 20 μm. (E) Statistiskt histogram över fluorescensintensiteten hos kaspas-3-proteinuttryck. Statistiska värden uttrycks som medelvärdet ± SD från tre oberoende experiment, förutom cellviabilitet för sex oberoende experiment. *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001 jämfört med modellgruppen. ##p < 0,01 jämfört med beredningskombinationsgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekter av de två kombinationerna på uttrycksnivåerna för p-Akt, Akt, Bcl-2 och Bax. (A) Proteinuttryck av p-Akt och Akt bestämt genom Western blot-analys. (B) Statistiskt histogram över statistik över förhållandet p-Akt/Akt i varje grupp. (C) Proteinuttryck av Bcl-2 och Bax bestämt genom Western blot-analys. D) Statistiskt histogram över förhållandet Bcl-2/Bax i varje grupp. Statistiska värden uttrycks som medelvärdet ± SD från tre oberoende experiment. *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001 jämfört med modellgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekt av två kombinationer på Nrf2-proteinuttrycket och ROS-nivåerna. (A) Nivåer av ROS detekterades genom fluorescensmikroskopi (400x). Skalstapeler: 20 μm. (B) Statistiskt histogram över ROS-fluorescensintensiteten i varje grupp. (C) Nrf2-proteinuttryck bestämt genom Western blot-analys. (D) Statistiskt histogram över Nrf2-proteinuttryck. Statistiska värden uttrycks som medelvärdet ± SD från tre oberoende experiment. *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001 jämfört med modellgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det saknas fortfarande ideala läkemedel för behandling av cerebral ischemi i modern klinisk praxis2. Under ledning av komplettering av qi och aktivering av blodcirkulationsmetoden har Ast, Eri och andra preparat använts i kombination i klinisk praxis av TCM och har uppnått goda omfattande fördelar13,14,15. Ett stort antal studier har visat att AST kan förbättra permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären, öka cerebralt blodflöde, förbättra nervcellernas förmåga att tolerera hypoxi och motstå syrefria radikaler och kan avsevärt förbättra neurologisk dysfunktion16,17. Det är särskilt lämpligt för senil ischemisk cerebrovaskulär sjukdom16,17. Eri kan vidga blodkärlen, öka blodtillförseln till hjärnan, ta bort ROS och minska lipidperoxidation18,19. Den synergistiska effekten, farmakodynamiska komponenter och mekanismen för kombinationen av de två läkemedlen är dock fortfarande oklara, vilket är ett vanligt problem som begränsar den kliniska tillämpningen av TCM.
Den ischemiska och hypoxiska miljön av kronisk cerebral ischemi inducerar oxidativ stressskada och aktiverar samtidigt signalvägen för hjärncellsapoptos för att främja neuronal apoptos20,21. PI3K / Akt-vägen är en klassisk anti-apoptotisk och pro-överlevnadssignaltransduktionsväg22,23, bland vilka Bcl-2-familjeproteiner och kaspasfamiljen är nedströms verkställande proteiner i denna signalväg. Fosforylerat Akt kan direkt eller indirekt reglera Bcl-2-familjen och hämma aktiveringen av nedströms vägen caspase-3 och därigenom utöva en anti-apoptotisk effekt11. Dessutom kan överskott av ROS genererat av hypoxi inducera oxidativ stressskada, medan fosforylerad Akt kan aktivera Nrf2 för att eliminera överskott av ROS för att bekämpa oxidativ stressskada12,24. Därför kan aktivering av PI3K / Akt / Nrf2-vägen effektivt förebygga och kontrollera oxidativ stress och apoptos och därigenom minska hypoxisk-ischemisk hjärnskada25,26.
I studien screenades preparatkombinationen med hjälp av den skadade PC12-cellmodellen, och effekten och mekanismen i denna modell jämfördes med komponentkombinationen som screenats tidigare7. Dessutom är den maximala icke-toxiska koncentrationen av Ast-injektion och Eri-kapsel 12 μM (beräknad med astragalosid A) respektive 5 μM (beräknad med scutellarin), medan den maximala icke-toxiska koncentrationen av astragalosid A och scutellarin är 20 μM respektive 50 μM7. Det visar att komponentkombinationen är säkrare än preparatkombinationen, med mer kontrollerbar kvalitet och omfattande fördelar med hög effektivitet och låg toxicitet.
De nuvarande cellmodellerna som kan användas för att simulera cerebral ischemi inkluderar huvudsakligen fysisk hypoxi (inducerad av OGD) och kemisk hypoxi (inducerad avNa2S2O4ellerCoCl2)27. Bland dem har både OGD- och Na2S2O4-skador en kort hypoxitid och är inte lämpliga för simulering av kronisk ischemi27. CoCl2-inducerad hypoxi är en av de vanligaste hypoxihärmningarna jämfört med OGD och användningen av andra hypoxihärmare. Det kan leda till ihållande och stabil oxidativ skada av ROS och producera typiska apoptotiska förändringar i olika cellinjer27. Därför användes CoCl2 i denna studie i 24 timmar för att simulera neuronal hypoxi28,29. Dess modelleringskoncentration (0,1, 0,2, 0,4 och 0,8 mM) och giltighetsperioden (1 och 7 dagar) screenades. Dessutom, med tanke på den oundvikliga bristen på glukos och syre efter cerebral ischemi, kan den glukosfria och hypoxiska miljön bättre simulera cerebral ischemisk skada. Denna studie visade att 0,4 mMCoCl2 kombinerat med ett glukosfritt medium under 24 timmar kunde etablera en stabil och kontrollerbar kronisk hypoxisk cellmodell. I uppföljningsstudien kommer djurmodellen för kronisk cerebral ischemi att användas för att ytterligare validera de terapeutiska fördelarna med komponentkombinationen in vivo.
Denna cellmodell kan öka apoptoshastigheten, kaspas-3-fluorescensintensiteten och intracellulär ROS-nivå (figur 2 och figur 4), vilket bättre kan simulera de patologiska förändringarna av kronisk cerebral ischemi, såsom apoptos, oxidativ stress etc. Baserat på denna modell fann man att de två typerna av kombinationer kan hämma apoptos och oxidativ stressskada. Effekten av komponentkombinationen på att främja cellöverlevnad var signifikant bättre än för preparatkombinationen (figur 1); båda kombinationerna kan uppreglera uttrycksnivåerna för P-Akt/Akt, Bcl-2/Bax och Nrf2 i olika grader (figur 3 och figur 4). I synnerhet hade komponentkombinationen en starkare effekt på uppregleringen av Akt/Bcl-2/Bax och Nrf2 signalväg. Dessa resultat indikerar att komponentkombinationen bättre kan motstå cellskador än preparatkombinationen, som är relaterad till starkare anti-apoptos och antioxidativ stress.
Sammanfattningsvis ger dessa resultat en kombinationsstrategi av två örter för att behandla skadade PC12-celler och ger en ny idé för att utvärdera och optimera det kombinerade applikationsläget för två örter. Sammantaget ger denna studie en referens för att välja den aktiva komponentkombinationen av TCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av viktiga FoU-projekt från Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2020YFS0325).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924 (2020).
- Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592 (2020).
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
