Summary
여기에 제시된 프로토콜은 강력한 접착성 하이드로겔 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드(젤라틴-NB)의 합성을 보여줍니다. Gelatin-NB는 빠르고 효율적인 조직 접착 능력을 가지고 있어 상처 표면을 보호하기 위해 강력한 물리적 장벽을 형성할 수 있으므로 부상 복구 생명 공학 분야에 적용될 것으로 기대됩니다.
Abstract
접착 재료는 생물 의학 및 조직 공학 분야에서 널리 사용되는 생체 재료가되었습니다. 이전 연구에서 우리는 주로 조직 재생에 사용되며 각막 손상 및 염증성 장 질환의 동물 모델에서 검증된 새로운 물질인 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드(젤라틴-NB)를 제시했습니다. 이것은 생물학적 젤라틴을 o-니트로소벤즈알데히드(NB)로 변형하여 형성된 새로운 하이드로겔입니다. 젤라틴-NB는 NB-COOH의 카르복실기를 활성화하고 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 통해 젤라틴과 반응시켜 합성되었습니다. 얻어진 화합물을 정제하여 최종 생성물을 생성하고, 이는 적어도 18개월 동안 안정하게 저장될 수 있다. NB는 조직 상의 -NH2 에 대해 강한 접착력을 가지며, 이는 많은 C=N 결합을 형성할 수 있고, 따라서 조직 계면에 대한 젤라틴-NB의 접착을 증가시킨다. 제조 공정은 NB-COOH 기의 합성, 기의 변형, 젤라틴-NB 화합물의 합성 및 정제를 위한 단계를 포함한다. 목표는 젤라틴-NB의 특정 합성 과정을 자세히 설명하고 손상 복구에 젤라틴-NB를 적용하는 것을 입증하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 보다 적용 가능한 시나리오를 위해 과학계에서 생산한 자료의 특성을 더욱 강화하고 확장하기 위해 제시됩니다.
Introduction
하이드로겔은 물이 팽윤되어 형성된 3차원 폴리머의 일종입니다. 특히, 세포외기질 유래의 하이드로젤은 우수한 생체적합성 및 치료효과로 인해 생합성 및 재생의학 분야에서 널리 사용되고 있다1. 하이드로겔은 위궤양, 신경염, 심근경색 2,3,4 및 기타 질환의 치료에 대해 보고되었다. 또한, 젤라틴-NB가 염증성 염증성 장 질환(IBD)의 결과를 촉진할 수 있음이 입증되었습니다5. 전통적인 하이드로겔에는 젤란검, 젤라틴, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 층상, 소수성/친수성, 알지네이트/폴리아크릴아미드, 이중 네트워크 및 다양쪽성 하이드로겔6이 포함되며, 이들 모두는 우수한 조직적합성 및 기계적 특성을 가지고 있다. 그러나 이러한 전통적인 하이드로겔은 환경의 습기와 공기에 취약합니다. 장시간 공기에 노출되면 물이 없어지고 건조해집니다. 장시간 물에 담그면 물을 흡수하고팽창하여 7, 따라서 유연성과 기계적 기능이 감소합니다. 또한, 종래의 하이드로겔의 조직 부착을 유지하는 것은 주요한 과제이다8.
이를 바탕으로 생물학적 젤라틴을 NB로 변형하여 형성된 새로운 하이드로겔인 나노스케일 하이드로겔 젤라틴-NB를 설계하고 합성했습니다(그림 1). NB는 조직 상의 -NH2 에 대한 강한 접착 능력을 가지며, 이는 많은 수의 C=N 결합을 형성할 수 있고, 따라서 하이드로겔-조직 계면의 접착성을 증가시킨다. 이 강한 접착력은 하이드로겔을 조직 표면에 단단히 부착시켜 나노 수준의 분자 코팅을 형성할 수 있습니다. 연구팀의 이전 연구에서, 이러한 종류의 변형된 하이드로겔 코팅이 조직 접착력을 향상시킨다는 것이 확인되었다9; 각막 및 장 장기 및 조직에 안정적으로 부착할 수 있으며 항염, 장벽 격리 및 재생 촉진 역할을 합니다. 목표는 젤라틴-NB의 특정 합성 과정을 여기에 자세히 소개하여 젤라틴-NB가 손상 복구의 더 많은 시나리오에 적용될 수 있도록 하는 것입니다. 또한, 우리는 다른 연구자들이 더 많은 응용 시나리오에 적합하도록 이 재료의 특성을 더욱 강화하고 확장할 것을 권장합니다.
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Protocol
C57BL/6 마우스는 Zhejiang University School of Medicine, Sir Run Run Shaw Hospital에서 구입하였다. 뉴질랜드 토끼는 절강 대학교에서 구입했습니다. 동물들은 자연의 빛-어둠 주기 조건에서 유지되었고 음식과 식수를 자유롭게 제공받았습니다. 모든 실험 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(SRRSH202107106)를 준수하는 Zhejiang University Ethics Committee 표준 지침(ZJU20200156) 및 Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee의 기관 지침에 의해 윤리적으로 승인되었습니다.
1. NB-COOH의 합성
- 4-히드록시-3-(메톡시-D3)벤즈알데히드(8.90 g, 58.5 mM, 1.06 당량[eq.]), 탄산칼륨(10.2 g, 73.8 mM, 1.34 eq.) 및 메틸 4-브로모부티레이트(9.89 g, 55.0 mM, 1.0 eq.)를 이전 연구10에서 제안된 프로토콜에 기초하여 준비한다. 화합물을 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 40mL에 녹이고 상온에서 16시간 동안 저어줍니다.
- 혼합물에 0°C의 물 200mL를 첨가하고 혼합물을 침전시켜 조생성물을 얻었다.
- 원유 생성물을 DMF에 반복적으로 용해시킨 다음 5 사이클 동안 침전시킵니다. 조 생성물을 침전시키고 80°C에서 2시간 동안 건조시켜 초기 생성물을 얻는다.
2. 화학적 개질 및 가공
- 후술하는 바와 같이 메틸 4-(4-포르밀-2-메톡시페녹시메톡시페닐)부탄산 메틸 에스테르의 입소 치환을 수행한다.
- 9.4 g의 메틸 4-(4-포르밀-2-메톡시페녹시)부타노에이트(37.3 mM, 1 eq.)를 70% 질산(140 mL)의 예냉(-2°C) 용액에 천천히 첨가하고 -2°C에서 3시간 동안 교반한다.
참고: 니트로화 반응의 온도에 따라 포르밀 부분의 입소 치환이 발생합니다. - 혼합물(~9.0g)을 0°C의 물 200mL로 여과한 다음 DMF로 정제하여 고체 생성물을 침전시킵니다.
- 90°C에서 트리플루오로아세트산(TFA)/H2O, 1:10 v/v(100mL)에서 고체 생성물을 가수분해하고 건조시킵니다. 용매를 80 kPa 하에서 제거하여 최종 중간 생성물인 무수 옅은 황색 분말을 얻었다.
- 중간 생성물(7.4g, 23.8mM, 1.0당량)을 테트라히드로퓨란(THF)/에탄올, 1:1 v/v(100mL)에 녹입니다. 그런 다음 0°C에서 1.43g의NaBH4 (35.7 mM, 1.5당량)를 천천히 첨가한다. 3시간 후, 진공 하에서 모든 용매를 제거하고 잔류물을 1:1 물과 디클로로메탄 용액(각각 50mL)에 현탁시킵니다.
- 수성 층으로부터 생성물을 추출하기 위해 디클로로메탄을 준비한다. 유기층을 제거하고 황산마그네슘으로 건조시킵니다.
- DCM/MeOH를 10:1 비율(1% TEA)로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조 생성물을 정제합니다. 마지막으로, 비교적 순수한 황색 분말 NB-COOH 5.31 g (18.6 mM, 78.3 %)을 얻는다.
3. 젤라틴-NB의 합성
- 한 배치의 변형을 위해 5g의 젤라틴을 준비하십시오. 5 g의 젤라틴을 탈이온수 100 mL에 용해시켜 균질한 젤라틴 용액을 제조하고 37°C에서 보관한다.
참고: 여기에서 원래 33 x 10-5 moles ε- 아미노 그룹/g 젤라틴11 이 정의됩니다. - 공급 비율(FR)을 젤라틴의 NB 그룹과 1차 아미노 그룹 사이의 몰 비율로 정의합니다. 이 연구에서는 53mg의 NB와 1g의 젤라틴을 FRNB = 1로 정의했습니다.
- 1,060mg의 NB-COOH를 5mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 NB-COOH의 카르복실기를 활성화합니다. NB 그룹은 용액에 있을 때 자외선(UV)에 민감하므로 항상 빛에서 멀리 두십시오.
- 746mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디미드 염산염(EDC)을 NB-COOH DMSO 용액에 넣고 5분 동안 저어줍니다. EDC가 용해되면 N-하이드록시석신이미드(NHS) 448mg을 넣고 5분 동안 저어줍니다.
- 적하 깔때기를 사용하여 용해된 젤라틴 용액에 0.5mL/min의 속도로 혼합물을 천천히 떨어뜨리고 격렬하게 저어주면서 45°C에서 4시간 동안 반응시킵니다.
4. 제품의 정제 그리고 저장
- 젤라틴-NB 용액을 과량의 탈이온수에 대해 최소 3일 동안 투석한 다음 수집, 동결 및 동결건조하여 젤라틴-NB 폼을 얻습니다. 추가 사용을 위해 거품을 어두운 곳에서 건조기에 보관하십시오.
- 동결건조된 젤라틴-NB 폼을 사용 직전에 37°C에서 탈이온수에 용해시킨다.
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Representative Results
도 2A 는 젤라틴-NB의 합성에 관여하는 주요 화학 반응의 개략도를 보여주며, 이는 NB 그룹을 젤라틴에 접목함으로써 조직 통합을 촉진한다. 도 2B 는 젤라틴-NB 하이드로겔의 O-니트로벤젠이 UV 조사 직후 NB기로 전환된 후 활성 알데히드기가 아미노기와 가교되어 쉬프 염기를 형성할 수 있음을 보여준다. 도 2C 는 NB 기의 상이한 비율이 젤라틴-NB의 상이한 가교 구조를 유도할 수 있음을 나타낸다.
동시에, 젤라틴-NB의 물리적 특성에 대한 예비 특성화도 수행되었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 젤라틴-NB는 NB의 공급비(FR)가 낮을 때 강한 겔화를 갖는다. 즉, FR이 낮은 젤라틴-NB는 광생성된 알데히드 그룹과 반응할 수 있는 많은 수의 아미노기가 존재하기 때문에 부드러운 하이드로겔을 형성하는 반면, FR이 높은 젤라틴-NB는 유연한 액적을 유지할 수 있습니다. 우리는 또한 그림 3C와 같이 젤라틴-NB의 전체 형태가 주사전자현미경(SEM)에 의해 각막 표면에 안정적으로 부착되는 것을 관찰했습니다. 그러나 아무것도 또는 젤라틴으로 치료한 손상된 각막 표면은 매끄럽게 보입니다. 그림 3D는 형광 표지된 젤라틴-NB가 장 조직에 부착되어 치밀한 코팅을 형성하는 능력을 가지고 있음을 보여줍니다. 그러나 젤라틴 그룹의 형광 강도는 매우 약하여 장벽에 단단히 부착되지 않음을 나타냅니다. 그림 3E는 젤라틴과 젤라틴-NB 모두 초기에 아민화된 플레이트에 부착할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 인산염 완충 식염수(PBS)를 아민 플레이트에 붓고 24시간 동안 4시간마다 교체한 후 젤라틴-NB만이 강한 형광을 유지하여 강하게 부착됨을 나타냅니다. 이러한 결과는 젤라틴-NB가 조직 표면에 부착되어 균일하고 안정적인 조밀한 층을 형성할 수 있음을 나타냅니다. 도 3F에 나타낸 바와 같이, 각막 표면과 젤라틴으로 처리된 표면의 스펙트럼은 거의 동일하다. 그러나 젤라틴-NB 처리군에서는 400eV에서 추가 피크가 나타나며, 이는 UV 활성화 젤라틴-NB로 처리한 후 조직에서 많은 C=N 결합이 형성됨을 나타냅니다12.
그림 1: NB-COOH 합성 반응의 단계. 그림은 합성 반응의 개략도를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 젤라틴-NB의 설계 및 합성. (A) 젤라틴-NB 형성을 위한 화학 반응의 개략도. (B) 젤라틴-NB 하이드로겔의 광유발 화학구조 변형을 보여주는 개략도. O-니트로벤젠은 UV 노출 하에서 NB기로 전환됩니다. 그런 다음 활성 알데히드 그룹은 이후에 아미노기와 가교결합하여 쉬프 염기를 형성할 수 있습니다. (C) 젤라틴-NB가 하이드로겔을 형성하고 다른 공급비로 코팅하는 개략도. 이 수치는12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 젤라틴-NB의 특성화. (A) NB의 다양한 공급 비율에 따른 젤라틴-NB의 다양한 겔화 성능. (1-4) 젤라틴-NB의 0.5, 1, 2, 및 4 NB 공급비를 각각 나타낸다. (b) UV 조명 후의 불활성화된 변형된 젤라틴-NB 용액 및 젤라틴-NB 용액의 육안도. (C) 손상된 각막 표면, 젤라틴 및 젤라틴-NB-4 단백질 코팅된 각막 표면의 SEM 이미지. 스케일 바: 30 μm (상단 패널); 40 μm (하단 패널, 확대). (D) 젤라틴 및 젤라틴-NB 분자 코팅으로 표지된 마우스 결장 표면의 형광 이미지. 스케일 바: 200μm. (E) 0시간 및 24시간에서 표지된 젤라틴 및 젤라틴-NB 분자 코팅 처리된 아민화 플레이트의 형광 이미지. 스케일 바: 20μm. (F) 젤라틴-NB-4가 조직에 결합하는 X선 광자 분광법(XPS). 펩티드 -C-NH- 및 아미노아민기 C-NH2의 결합 에너지는 C=N 결합 피크의 출현으로 인해 시프 염기의 UV 유도 형성을 나타낸다. 이 그림은5와12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
접착 재료는 새로운 종류의 재료입니다. 점점 더 많은 연구자들이 다양한 유형의 접착 재료의 합성에 전념하고 있으며 생명 공학, 조직 공학, 재생 의학 및 기타 분야에서 응용 분야를 찾기 위해 노력하고 있으며 최근 몇 년 동안 활발한 발전을 이끌었습니다. 접착 재료의 강한 접착력에 초점을 맞추는 것 외에도 연구자들은 주사 가능성, 자가 치유, 지혈, 항균, 제어 제거 등과 같은 다른 특성에도 더 많은 관심을 기울이고 있습니다13. 이러한 새로운 응용 분야는 유망한 응용 전망과 함께 접착 재료의 적용 범위를 크게 확장합니다.
본 논문에서는 신규한 젤라틴-NB 하이드로젤의 합성방법을 소개하였다. Gelatin-NB는 접착력이 강하며 임상에서 각막 손상 및 장 손상의 복구에 적용될 수 있다고보고되었습니다 5,12. 따라서 젤라틴-NB의 제조 방법을 대중화하는 것은 학문적, 응용적 가치가 매우 높습니다.
젤라틴-NB를 제조하는 핵심 단계는 합성 과정입니다. 우리는 젤라틴의 NB기와 1차 아미노기 사이의 몰비인 사료비(FR)의 개념을 제안합니다. 젤라틴-NB를 합성하기 위한 FR은 일정하지 않으며, 부착성 조직 계면의 성질에 따라 조절될 수 있다. 토끼 각막의 경우 젤라틴-NB 점안액의 FR은 FRNB = 2인 반면 마우스 결장 표면의 아미노기 수는 상대적으로 높습니다12; FR NB = 2는 이에 대한 최적의 FR이 아닌 것으로 판명되며, 최적의 접착 효과를 달성하기 위해 일반적으로 약 4로 증가할 필요가 있다. 다양한 응용 시나리오에서 젤라틴-NB를 합성할 때 최상의 접착 효과를 탐색하기 위해 실험 전 FR 그래디언트를 설정해야 합니다. 또한 NB 그룹은 UV에 매우 민감하기 때문에 NB는 항상 자외선으로부터 멀리 떨어져 있어야 한다고 기사에서 언급했습니다. NB 그룹에 대한 UV 광선의 영향을 최소화하기 위해 합성 과정에서 가능한 한 모든 직사광선을 피하는 것이 좋습니다.
동시에 이 합성 기술에는 몇 가지 한계가 있습니다. 예를 들어, 원유 제품의 낮은 수율은 원자재 소비를 늘려야 할 필요성을 초래합니다. 수율 향상을 위해 반응 온도를 조절하고 반응 시간을 더욱 연장하는 등 다양한 반응 조건을 변경하려고 노력하고 있습니다. 우리는 연구 진행 상황을 제 시간에 업데이트 할 것입니다. 연구원들은 비디오를 참조하여 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드의 준비 전략을 개선하거나 이를 기반으로 그룹을 추가로 수정하여 추가 생물의학적 요구를 충족할 수 있습니다. 우리는 이 논문에 설명된 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드의 합성 방법이 생합성 및 재생 의학의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다. 또한 젤라틴-NB는 향후 급성 혈관 손상으로 인한 출혈, 간 및 비장 파열, 위 천공과 같은 중요한 임상 사례에 더욱 적용될 것으로 기대됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
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