Het hier gepresenteerde protocol toont de synthese van een sterke klevende hydrogelgelatine o-nitrosobenzaldehyde (gelatine-NB). Gelatine-NB heeft een snel en efficiënt weefselhechtingsvermogen, dat een sterke fysieke barrière kan vormen om wondoppervlakken te beschermen, dus het zal naar verwachting worden toegepast op het gebied van biotechnologie voor letselherstel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Synthese van sterke kleefhydrogel, gelatine O-nitrosobenzaldehyde
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zelfklevende materialen zijn populaire biomaterialen geworden op het gebied van biomedische en tissue engineering. In ons vorige werk presenteerden we een nieuw materiaal - gelatine o-nitrosobenzaldehyde (gelatine-NB) - dat voornamelijk wordt gebruikt voor weefselregeneratie en is gevalideerd in diermodellen van hoornvliesletsel en inflammatoire darmaandoeningen. Dit is een nieuwe hydrogel gevormd door biologische gelatine te modificeren met o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatine-NB werd gesynthetiseerd door de carboxylgroep van NB-COOH te activeren en te reageren met gelatine via 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS). De verkregen verbinding werd gezuiverd om het eindproduct te genereren, dat stabiel kan worden bewaard gedurende ten minste 18 maanden. NB heeft een sterke hechting aan -NH2 op het weefsel, dat veel C = N-bindingen kan vormen, waardoor de hechting van gelatine-NB aan het weefselgrensvlak toeneemt. Het bereidingsproces omvat stappen voor de synthese van de NB-COOH-groep, modificatie van de groep, synthese van gelatine-NB en zuivering van de verbinding. Het doel is om het specifieke syntheseproces van gelatine-NB in detail te beschrijven en de toepassing van gelatine-NB voor schadeherstel aan te tonen. Bovendien wordt het protocol gepresenteerd om de aard van het materiaal dat door de wetenschappelijke gemeenschap wordt geproduceerd verder te versterken en uit te breiden voor meer toepasbare scenario's.
Inleiding
Hydrogel is een soort driedimensionaal polymeer gevormd door waterzwelling. In het bijzonder wordt hydrogel afgeleid van een extracellulaire matrix veel gebruikt op het gebied van biosynthese en regeneratieve geneeskunde vanwege de uitstekende biocompatibiliteit en therapeutische effectiviteit1. Hydrogels zijn gemeld voor de behandeling van maagzweren, neuritis, myocardinfarct 2,3,4 en andere ziekten. Verder is bewezen dat gelatine-NB de uitkomst van ontstekingsinflammatoire darmziekte (IBD) kan bevorderen5. Traditionele hydrogels omvatten gellangom, gelatine, hyaluronzuur, polyethyleenglycol (PEG), gelaagd, hydrofoob / hydrofiel, alginaat / polyacrylamide, dubbel netwerk en polyamfotere hydrogels6, die allemaal goede histocompatibiliteit en mechanische eigenschappen hebben. Deze traditionele hydrogels zijn echter kwetsbaar voor vocht en lucht in de omgeving. Als ze lange tijd aan lucht worden blootgesteld, verliezen ze water en drogen ze uit; Als ze lange tijd in het water worden ondergedompeld, zullen ze water absorberen en uitzetten7, waardoor hun flexibiliteit en mechanische functie worden verminderd. Daarnaast is het handhaven van de weefselhechting van conventionele hydrogels een grote uitdaging8.
Op basis hiervan hebben we een hydrogel-gelatine-NB op nanoschaal ontworpen en gesynthetiseerd, een nieuwe hydrogel die wordt gevormd door biologische gelatine te modificeren met NB (figuur 1). NB heeft een sterk hechtingsvermogen tot -NH2 op het weefsel, dat een groot aantal C = N-bindingen kan vormen, waardoor de kleefkracht van de hydrogel-weefselinterface toeneemt. Deze sterke hechting kan ervoor zorgen dat de hydrogel stevig hecht aan het weefseloppervlak, waardoor een moleculaire coating op nanoniveau wordt gevormd. In eerdere studies van het team is bevestigd dat dit soort gemodificeerde hydrogelcoating de weefselhechting heeft verbeterd9; Het kan zich stabiel hechten aan hoornvlies- en darmorganen en weefsels en anti-ontsteking, barrière-isolatie en regeneratiebevorderende rollen spelen. Het doel is om het specifieke syntheseproces van gelatine-NB hier in detail te introduceren, zodat gelatine-NB in meer scenario's van schadeherstel kan worden toegepast. Bovendien moedigen we andere onderzoekers aan om de aard van dit materiaal verder te versterken en uit te breiden om aan meer toepassingsscenario's te voldoen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De C57BL/6 muizen werden gekocht van Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. De Nieuw-Zeelandse konijnen werden gekocht van de Zhejiang University. De dieren werden in natuurlijke licht-donker cyclusomstandigheden gehouden en kregen vrij voedsel en drinkwater. Alle experimentele procedures werden ethisch goedgekeurd door de institutionele richtlijnen van de standaardrichtlijnen van de Zhejiang University Ethics Committee (ZJU20200156) en de Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, die voldeed aan de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (SRRSH202107106).
1. Synthese van NB-COOH
- Bereid 4-hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalenten [eq.]), kaliumcarbonaat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) en methyl-4-broombutyraat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) op basis van het protocol dat in het vorige onderzoekwerd voorgesteld 10. Los de verbindingen op in 40 ml N, N-dimethylformamide (DMF) en roer gedurende 16 uur bij omgevingstemperatuur.
- Voeg 200 ml water van 0 °C toe aan het mengsel en laat het mengsel neerslaan tot een ruw product.
- Los het ruwe product herhaaldelijk op in DMF en laat vervolgens gedurende vijf cycli neerslaan. Precipiteer het ruwe product en droog het gedurende 2 uur bij 80 °C om het vroege product te verkrijgen.
2. Chemische modificatie en verwerking
- Voer de ipso-substitutie uit van methyl 4-(4-formyl-2-methoxyfenoxymethoxyfenyl) butaanzuurmethylester zoals hieronder beschreven.
- Voeg 9,4 g methyl-4-(4-formyl-2-methoxyfenoxy)butanoaat (37,3 mM, 1 eq.) langzaam toe aan een voorgekoelde (-2 °C) oplossing van 70% salpeterzuur (140 ml) en roer gedurende 3 uur bij -2 °C.
OPMERKING: Afhankelijk van de temperatuur van de nitratiereactie zal de ipso-substitutie van de formylgroep optreden. - Filtreer het mengsel (~ 9,0 g) met 200 ml water van 0 °C en zuiver het vervolgens in DMF om een vast product neer te slaan.
- Hydrolyseer het vaste product in trifluorazijnzuur (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) bij 90 °C en droog. Verwijder het oplosmiddel onder 80 kPa om het uiteindelijke tussenproduct, een droog lichtgeel poeder, te verkrijgen.
- Los het tussenproduct (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) op in tetrahydrofuraan (THF)/ethanol, 1:1 v/v (100 ml). Voeg vervolgens 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) langzaam toe bij 0 °C. Verwijder na 3 uur alle oplosmiddelen onder vacuüm en suspensie het residu in een 1:1 water- en dichloormethaanoplossing (elk 50 ml).
- Bereid dichloormethaan voor om het product uit de waterige laag te extraheren. Verwijder de organische laag en droog over magnesiumsulfaat.
- Zuiver het ruwe product door silicagelkolomchromatografie met DCM/MeOH in een verhouding van 10:1 (1% TEA). Verkrijg ten slotte 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) relatief zuiver geelachtig poeder NB-COOH.
3. Synthese van gelatine-NB
- Bereid 5 g gelatine voor één batch modificatie. Bereid een homogene gelatineoplossing door 5 g gelatine op te lossen in 100 ml gedeïoniseerd water en bewaar bij 37 °C.
OPMERKING: Hier wordt de oorspronkelijke 33 x 10-5 mol ε-aminogroepen / g gelatine11 gedefinieerd. - Definieer de feed ratio (FR) als de molaire verhouding tussen NB-groepen en primaire aminogroepen in gelatine. In deze studie werd 53 mg NB met 1 g gelatine gedefinieerd als FRNB = 1.
- Los 1.060 mg NB-COOH op in 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om de carboxylgroepen van NB-COOH te activeren. Aangezien de NB-groep gevoelig is voor ultraviolet (UV) licht wanneer het in oplossing is, moet u het altijd uit de buurt van licht houden.
- Voeg 746 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimidehydrochloride (EDC) toe aan de NB-COOH DMSO-oplossing en roer gedurende 5 minuten. Nadat EDC is opgelost, voeg 448 mg N-hydroxysuccinimide (NHS) toe en roer gedurende 5 minuten.
- Gebruik een druppeltrechter om het mengsel langzaam met een snelheid van 0,5 ml/min in de opgeloste gelatine-oplossing te laten vallen met krachtig roeren om gedurende 4 uur bij 45 °C te reageren.
4. Zuivering en opslag van het product
- Dialyseer de gelatine-NB-oplossing tegen overtollig gedeïoniseerd water gedurende ten minste 3 dagen, verzamel, vries en lyofiliseer het vervolgens om de gelatine-NB-schuimen te verkrijgen. Bewaar de schuimen in een exsiccator in het donker voor verder gebruik.
- Los de gevriesdroogde gelatine-NB-schuimen onmiddellijk voor gebruik op in gedeïoniseerd water bij 37 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2A toont een schema van de belangrijkste chemische reacties die betrokken zijn bij de synthese van gelatine-NB, die weefselintegratie bevordert door NB-groepen op gelatine te enten. Figuur 2B laat zien dat het O-nitrobenzeen van de gelatine-NB hydrogel direct na UV-bestraling wordt omgezet in een NB-groep, waarna de actieve aldehydegroep kan worden verknoopt met een aminogroep om een Schiff-base te vormen. Figuur 2C geeft aan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zelfklevende materialen zijn een nieuwe klasse van materiaal. Meer en meer onderzoekers zetten zich in voor de synthese van verschillende soorten kleefmaterialen en proberen hun toepassingen te vinden in biotechnologie, tissue engineering, regeneratieve geneeskunde en andere gebieden, wat de afgelopen jaren tot een krachtige ontwikkeling heeft geleid. Naast de focus op de sterke hechting van kleefmaterialen, besteden onderzoekers ook meer aandacht aan andere eigenschappen, zoals injecteerbaarheid, zelfgenezing, hemostati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
Referenties
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604(2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587(2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315(2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060(2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
