Summary
Het hier gepresenteerde protocol toont de synthese van een sterke klevende hydrogelgelatine o-nitrosobenzaldehyde (gelatine-NB). Gelatine-NB heeft een snel en efficiënt weefselhechtingsvermogen, dat een sterke fysieke barrière kan vormen om wondoppervlakken te beschermen, dus het zal naar verwachting worden toegepast op het gebied van biotechnologie voor letselherstel.
Abstract
Zelfklevende materialen zijn populaire biomaterialen geworden op het gebied van biomedische en tissue engineering. In ons vorige werk presenteerden we een nieuw materiaal - gelatine o-nitrosobenzaldehyde (gelatine-NB) - dat voornamelijk wordt gebruikt voor weefselregeneratie en is gevalideerd in diermodellen van hoornvliesletsel en inflammatoire darmaandoeningen. Dit is een nieuwe hydrogel gevormd door biologische gelatine te modificeren met o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatine-NB werd gesynthetiseerd door de carboxylgroep van NB-COOH te activeren en te reageren met gelatine via 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS). De verkregen verbinding werd gezuiverd om het eindproduct te genereren, dat stabiel kan worden bewaard gedurende ten minste 18 maanden. NB heeft een sterke hechting aan -NH2 op het weefsel, dat veel C = N-bindingen kan vormen, waardoor de hechting van gelatine-NB aan het weefselgrensvlak toeneemt. Het bereidingsproces omvat stappen voor de synthese van de NB-COOH-groep, modificatie van de groep, synthese van gelatine-NB en zuivering van de verbinding. Het doel is om het specifieke syntheseproces van gelatine-NB in detail te beschrijven en de toepassing van gelatine-NB voor schadeherstel aan te tonen. Bovendien wordt het protocol gepresenteerd om de aard van het materiaal dat door de wetenschappelijke gemeenschap wordt geproduceerd verder te versterken en uit te breiden voor meer toepasbare scenario's.
Introduction
Hydrogel is een soort driedimensionaal polymeer gevormd door waterzwelling. In het bijzonder wordt hydrogel afgeleid van een extracellulaire matrix veel gebruikt op het gebied van biosynthese en regeneratieve geneeskunde vanwege de uitstekende biocompatibiliteit en therapeutische effectiviteit1. Hydrogels zijn gemeld voor de behandeling van maagzweren, neuritis, myocardinfarct 2,3,4 en andere ziekten. Verder is bewezen dat gelatine-NB de uitkomst van ontstekingsinflammatoire darmziekte (IBD) kan bevorderen5. Traditionele hydrogels omvatten gellangom, gelatine, hyaluronzuur, polyethyleenglycol (PEG), gelaagd, hydrofoob / hydrofiel, alginaat / polyacrylamide, dubbel netwerk en polyamfotere hydrogels6, die allemaal goede histocompatibiliteit en mechanische eigenschappen hebben. Deze traditionele hydrogels zijn echter kwetsbaar voor vocht en lucht in de omgeving. Als ze lange tijd aan lucht worden blootgesteld, verliezen ze water en drogen ze uit; Als ze lange tijd in het water worden ondergedompeld, zullen ze water absorberen en uitzetten7, waardoor hun flexibiliteit en mechanische functie worden verminderd. Daarnaast is het handhaven van de weefselhechting van conventionele hydrogels een grote uitdaging8.
Op basis hiervan hebben we een hydrogel-gelatine-NB op nanoschaal ontworpen en gesynthetiseerd, een nieuwe hydrogel die wordt gevormd door biologische gelatine te modificeren met NB (figuur 1). NB heeft een sterk hechtingsvermogen tot -NH2 op het weefsel, dat een groot aantal C = N-bindingen kan vormen, waardoor de kleefkracht van de hydrogel-weefselinterface toeneemt. Deze sterke hechting kan ervoor zorgen dat de hydrogel stevig hecht aan het weefseloppervlak, waardoor een moleculaire coating op nanoniveau wordt gevormd. In eerdere studies van het team is bevestigd dat dit soort gemodificeerde hydrogelcoating de weefselhechting heeft verbeterd9; Het kan zich stabiel hechten aan hoornvlies- en darmorganen en weefsels en anti-ontsteking, barrière-isolatie en regeneratiebevorderende rollen spelen. Het doel is om het specifieke syntheseproces van gelatine-NB hier in detail te introduceren, zodat gelatine-NB in meer scenario's van schadeherstel kan worden toegepast. Bovendien moedigen we andere onderzoekers aan om de aard van dit materiaal verder te versterken en uit te breiden om aan meer toepassingsscenario's te voldoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De C57BL/6 muizen werden gekocht van Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. De Nieuw-Zeelandse konijnen werden gekocht van de Zhejiang University. De dieren werden in natuurlijke licht-donker cyclusomstandigheden gehouden en kregen vrij voedsel en drinkwater. Alle experimentele procedures werden ethisch goedgekeurd door de institutionele richtlijnen van de standaardrichtlijnen van de Zhejiang University Ethics Committee (ZJU20200156) en de Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, die voldeed aan de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (SRRSH202107106).
1. Synthese van NB-COOH
- Bereid 4-hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalenten [eq.]), kaliumcarbonaat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) en methyl-4-broombutyraat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) op basis van het protocol dat in het vorige onderzoekwerd voorgesteld 10. Los de verbindingen op in 40 ml N, N-dimethylformamide (DMF) en roer gedurende 16 uur bij omgevingstemperatuur.
- Voeg 200 ml water van 0 °C toe aan het mengsel en laat het mengsel neerslaan tot een ruw product.
- Los het ruwe product herhaaldelijk op in DMF en laat vervolgens gedurende vijf cycli neerslaan. Precipiteer het ruwe product en droog het gedurende 2 uur bij 80 °C om het vroege product te verkrijgen.
2. Chemische modificatie en verwerking
- Voer de ipso-substitutie uit van methyl 4-(4-formyl-2-methoxyfenoxymethoxyfenyl) butaanzuurmethylester zoals hieronder beschreven.
- Voeg 9,4 g methyl-4-(4-formyl-2-methoxyfenoxy)butanoaat (37,3 mM, 1 eq.) langzaam toe aan een voorgekoelde (-2 °C) oplossing van 70% salpeterzuur (140 ml) en roer gedurende 3 uur bij -2 °C.
OPMERKING: Afhankelijk van de temperatuur van de nitratiereactie zal de ipso-substitutie van de formylgroep optreden. - Filtreer het mengsel (~ 9,0 g) met 200 ml water van 0 °C en zuiver het vervolgens in DMF om een vast product neer te slaan.
- Hydrolyseer het vaste product in trifluorazijnzuur (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) bij 90 °C en droog. Verwijder het oplosmiddel onder 80 kPa om het uiteindelijke tussenproduct, een droog lichtgeel poeder, te verkrijgen.
- Los het tussenproduct (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) op in tetrahydrofuraan (THF)/ethanol, 1:1 v/v (100 ml). Voeg vervolgens 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) langzaam toe bij 0 °C. Verwijder na 3 uur alle oplosmiddelen onder vacuüm en suspensie het residu in een 1:1 water- en dichloormethaanoplossing (elk 50 ml).
- Bereid dichloormethaan voor om het product uit de waterige laag te extraheren. Verwijder de organische laag en droog over magnesiumsulfaat.
- Zuiver het ruwe product door silicagelkolomchromatografie met DCM/MeOH in een verhouding van 10:1 (1% TEA). Verkrijg ten slotte 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) relatief zuiver geelachtig poeder NB-COOH.
3. Synthese van gelatine-NB
- Bereid 5 g gelatine voor één batch modificatie. Bereid een homogene gelatineoplossing door 5 g gelatine op te lossen in 100 ml gedeïoniseerd water en bewaar bij 37 °C.
OPMERKING: Hier wordt de oorspronkelijke 33 x 10-5 mol ε-aminogroepen / g gelatine11 gedefinieerd. - Definieer de feed ratio (FR) als de molaire verhouding tussen NB-groepen en primaire aminogroepen in gelatine. In deze studie werd 53 mg NB met 1 g gelatine gedefinieerd als FRNB = 1.
- Los 1.060 mg NB-COOH op in 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om de carboxylgroepen van NB-COOH te activeren. Aangezien de NB-groep gevoelig is voor ultraviolet (UV) licht wanneer het in oplossing is, moet u het altijd uit de buurt van licht houden.
- Voeg 746 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimidehydrochloride (EDC) toe aan de NB-COOH DMSO-oplossing en roer gedurende 5 minuten. Nadat EDC is opgelost, voeg 448 mg N-hydroxysuccinimide (NHS) toe en roer gedurende 5 minuten.
- Gebruik een druppeltrechter om het mengsel langzaam met een snelheid van 0,5 ml/min in de opgeloste gelatine-oplossing te laten vallen met krachtig roeren om gedurende 4 uur bij 45 °C te reageren.
4. Zuivering en opslag van het product
- Dialyseer de gelatine-NB-oplossing tegen overtollig gedeïoniseerd water gedurende ten minste 3 dagen, verzamel, vries en lyofiliseer het vervolgens om de gelatine-NB-schuimen te verkrijgen. Bewaar de schuimen in een exsiccator in het donker voor verder gebruik.
- Los de gevriesdroogde gelatine-NB-schuimen onmiddellijk voor gebruik op in gedeïoniseerd water bij 37 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2A toont een schema van de belangrijkste chemische reacties die betrokken zijn bij de synthese van gelatine-NB, die weefselintegratie bevordert door NB-groepen op gelatine te enten. Figuur 2B laat zien dat het O-nitrobenzeen van de gelatine-NB hydrogel direct na UV-bestraling wordt omgezet in een NB-groep, waarna de actieve aldehydegroep kan worden verknoopt met een aminogroep om een Schiff-base te vormen. Figuur 2C geeft aan dat verschillende verhoudingen van NB-groepen kunnen leiden tot verschillende verknoopte structuren van gelatine-NB.
Tegelijkertijd werd ook een voorlopige karakterisering van de fysische eigenschappen van gelatine-NB uitgevoerd. Zoals te zien is in figuur 3, heeft gelatine-NB een sterke gelation wanneer de feed ratio (FR) van NB laag is. Dit betekent dat gelatine-NB met lage FR een zachte hydrogel vormt door de aanwezigheid van een groot aantal aminogroepen die kunnen reageren met fotogegenereerde aldehydegroepen, terwijl gelatine-NB met hoge FR een flexibele druppel kan behouden. We zagen ook dat de algemene morfologie van gelatine-NB zich stabiel hecht aan het hoornvliesoppervlak door scanning elektronenmicroscopie (SEM), zoals weergegeven in figuur 3C. Een gewond hoornvliesoppervlak dat met niets of gelatine is behandeld, lijkt echter glad te zijn. Figuur 3D laat zien dat de fluorescerend gelabelde gelatine-NB het vermogen heeft om zich aan het darmweefsel te hechten en een dichte coating te vormen. De fluorescentie-intensiteit van de gelatinegroep is echter erg zwak, wat aangeeft dat deze zich niet stevig aan de darmwand hecht. Figuur 3E laat zien dat zowel gelatine als gelatine-NB zich in eerste instantie aan de geamineerde plaat kunnen hechten. Echter, na het gieten van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de geamineerde plaat en het vervangen om de 4 uur gedurende 24 uur, behoudt alleen gelatine-NB een sterke fluorescentie, wat aangeeft dat het sterk hecht. Deze resultaten geven aan dat gelatine-NB zich aan het weefseloppervlak kan hechten om een uniforme en stabiele dichte laag te vormen. Zoals te zien is in figuur 3F, zijn de spectra van een hoornvliesoppervlak en een met gelatine behandeld oppervlak bijna hetzelfde. In de met gelatine-NB behandelde groep verschijnt er echter een extra piek bij 400 eV, wat wijst op de vorming van veel C = N-bindingen in het weefsel na behandeling met UV-geactiveerde gelatine-NB12.
Figuur 1: Stappen van de NB-COOH synthesereactie. De figuur geeft een schematische weergave van de synthesereactie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ontwerp en synthese van gelatine-NB. (A) Schema van de chemische reactie voor gelatine-NB-vorming. (B) Schematisch diagram ter illustratie van de door foto's veroorzaakte chemische structuurtransformatie van de gelatine-NB hydrogel. O-nitrobenzeen wordt omgezet in NB-groepen onder UV-blootstelling. Vervolgens zou de actieve aldehydegroep vervolgens kunnen crosslinken met aminogroepen om Schiff-basen te vormen. (C) Schema van gelatine-NB vormende hydrogel en coating onder verschillende toevoerverhoudingen. Dit cijfer is gewijzigd van12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van gelatine-NB. (A) De variërende geleerprestaties van gelatine-NB met verschillende invoerverhoudingen van NB. (1-4) vertegenwoordigen respectievelijk 0,5, 1, 2 en 4 NB invoerverhoudingen van gelatine-NB. (B) Brutoweergave van de geïnactiveerde gemodificeerde gelatine-NB-oplossing en de gelatine-NB-oplossing na UV-verlichting. (C) SEM-beelden van het gewonde hoornvliesoppervlak, gelatine en met gelatine-NB-4-eiwitcoating behandelde hoornvliesoppervlak. Schaalstaven: 30 μm (bovenpanelen); 40 μm (bodempanelen, vergroot). (D) Fluorescentiebeelden van het colonoppervlak van de muis gelabeld door gelatine en gelatine-NB moleculaire coating. Schaalstaven: 200 μm. (E) Fluorescentiebeelden van de gelabelde gelatine en gelatine-NB moleculaire coating-behandelde geamineerde platen na 0 uur en 24 uur. Schaalstaven: 20 μm. (F) Röntgenfotonenspectroscopie (XPS) van gelatine-NB-4-binding aan weefsel. De bindingsenergieën van het peptide -C-NH- en amino-aminegroep C-NH2 verschuiven als gevolg van het verschijnen van een C = N-bindingspiek onthult de UV-geïnduceerde vorming van Schiff-basen. Dit cijfer is aangepast van5 en12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zelfklevende materialen zijn een nieuwe klasse van materiaal. Meer en meer onderzoekers zetten zich in voor de synthese van verschillende soorten kleefmaterialen en proberen hun toepassingen te vinden in biotechnologie, tissue engineering, regeneratieve geneeskunde en andere gebieden, wat de afgelopen jaren tot een krachtige ontwikkeling heeft geleid. Naast de focus op de sterke hechting van kleefmaterialen, besteden onderzoekers ook meer aandacht aan andere eigenschappen, zoals injecteerbaarheid, zelfgenezing, hemostatische, antibacteriële, gecontroleerde verwijdering, enzovoort13. Deze nieuwe toepassingen breiden het toepassingsgebied van lijmmaterialen met veelbelovende toepassingsperspectieven aanzienlijk uit.
In dit artikel werd de synthesemethode van een nieuwe hydrogel-gelatine-NB geïntroduceerd. Gelatine-NB heeft een sterke hechting en er wordt gemeld dat het kan worden toegepast op het herstel van hoornvliesletsel en darmletsel in de klinische praktijk 5,12. Daarom is het van grote academische en toepassingswaarde om de bereidingswijze van gelatine-NB te populariseren.
De belangrijkste stap voor het bereiden van gelatine-NB is het syntheseproces. We stellen het concept van feed ratio (FR) voor, wat de molaire verhouding is tussen de NB-groep en de primaire aminogroep in gelatine. De FR voor het synthetiseren van gelatine-NB is geen constante en kan worden aangepast aan de aard van de aanhangende weefselinterface. Voor konijnenhoornvliezen is de FR van gelatine-NB oogdruppels FRNB = 2, terwijl het aantal aminogroepen op het oppervlak van muizenkolonies relatief hoog is12; FRNB = 2 blijkt hiervoor niet de optimale FR te zijn, en moet meestal worden verhoogd tot ongeveer 4 om het optimale hechtingseffect te bereiken. Bij het synthetiseren van gelatine-NB in verschillende toepassingsscenario's, is het noodzakelijk om een fr-gradiënt in te stellen om het beste hechtingseffect te onderzoeken. Daarnaast hebben we in het artikel vermeld dat NB te allen tijde uit de buurt van UV-licht moet worden gehouden, omdat NB-groepen erg gevoelig zijn voor UV; we raden aan om alle directe lichtbronnen zoveel mogelijk te vermijden tijdens het syntheseproces, om de impact van UV-licht op NB-groepen te minimaliseren.
Tegelijkertijd heeft deze synthesetechnologie enkele beperkingen. De lage opbrengst van ruwe producten leidt bijvoorbeeld tot de behoefte aan een groter verbruik van grondstoffen. We proberen verschillende reactiecondities te veranderen om de opbrengst te verbeteren, zoals het aanpassen van de reactietemperatuur en het verder verlengen van de reactietijd. We zullen de voortgang van het onderzoek tijdig bijwerken. Onderzoekers kunnen naar de video verwijzen om de bereidingsstrategie van gelatine o-nitrosobenzaldehyde te verbeteren of de groep op basis hiervan verder aan te passen om aan verdere biomedische behoeften te voldoen. Wij geloven dat de synthesemethode van gelatine o-nitrosobenzaldehyde die in dit artikel wordt beschreven, de ontwikkeling van biosynthetische en regeneratieve geneeskunde zal versnellen. Bovendien wordt verwacht dat gelatine-NB in de toekomst verder zal worden toegepast in kritieke klinische gevallen, zoals bloedingen veroorzaakt door acuut vasculair letsel, scheuring van lever en milt en maagperforatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
