Summary
Представленный здесь протокол показывает синтез прочного адгезивного гидрогеля желатина о-нитрозобензальдегида (желатин-NB). Желатин-NB обладает быстрой и эффективной адгезионной способностью к тканям, которая может образовывать прочный физический барьер для защиты раневых поверхностей, поэтому ожидается, что он будет применяться в области биотехнологии восстановления травм.
Abstract
Адгезивные материалы стали популярными биоматериалами в области биомедицины и тканевой инженерии. В нашей предыдущей работе мы представили новый материал - желатин о-нитрозобензальдегид (желатин-NB) - который в основном используется для регенерации тканей и был проверен на животных моделях повреждения роговицы и воспалительных заболеваний кишечника. Это новый гидрогель, образованный путем модификации биологического желатина о-нитрозобензальдегидом (NB). Желатин-NB был синтезирован путем активации карбоксильной группы NB-COOH и реакции с желатином через гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS). Полученное соединение очищали для получения конечного продукта, который может стабильно храниться не менее 18 месяцев. NB имеет сильную адгезию к -NH2 на ткани, которая может образовывать множество связей C = N, тем самым увеличивая адгезию желатина-NB к тканевому интерфейсу. Процесс получения включает этапы синтеза группы NB-COOH, модификацию группы, синтез желатина-NB и очистку соединения. Цель состоит в том, чтобы подробно описать специфический процесс синтеза желатина-NB и продемонстрировать применение желатина-NB для восстановления повреждений. Кроме того, протокол представлен для дальнейшего укрепления и расширения характера материала, подготовленного научным сообществом, для более применимых сценариев.
Introduction
Гидрогель представляет собой тип трехмерного полимера, образованного набуханием воды. В частности, гидрогель, полученный из внеклеточного матрикса, широко используется в области биосинтеза и регенеративной медицины из-за его превосходной биосовместимости и терапевтическойэффективности1. Сообщалось, что гидрогели используются для лечения язвы желудка, невритов, инфаркта миокарда 2,3,4 и других заболеваний. Кроме того, было доказано, что желатин-NB может способствовать исходу воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)5. Традиционные гидрогели включают геллановую камедь, желатин, гиалуроновую кислоту, полиэтиленгликоль (ПЭГ), слоистые, гидрофобные/гидрофильные, альгинатные/полиакриламидные, двухсетчатые и полиамфотерные гидрогели6, все из которых обладают хорошей гистосовместимостью и механическими свойствами. Однако эти традиционные гидрогели уязвимы к влаге и воздуху в окружающей среде. Если они будут подвергаться воздействию воздуха в течение длительного времени, они потеряют воду и высохнут; Если они погружены в воду на длительное время, они будут поглощать воду и расширяться7, тем самым уменьшая их гибкость и механическую функцию. Кроме того, поддержание тканевой адгезии обычных гидрогелей является серьезной проблемой8.
Исходя из этого, мы разработали и синтезировали наноразмерный гидрогель-желатин-NB, который представляет собой новый гидрогель, образованный путем модификации биологического желатина NB (рис. 1). NB обладает сильной адгезионной способностью к -NH2 на ткани, что может образовывать большое количество связей C = N, тем самым увеличивая адгезивность границы раздела гидрогель-ткань. Эта сильная адгезия может заставить гидрогель прочно прилипать к поверхности ткани, образуя таким образом молекулярное покрытие наноуровня. В предыдущих исследованиях команды было подтверждено, что этот вид модифицированного гидрогелевого покрытия улучшает адгезию тканей9; Он может стабильно прилипать к органам и тканям роговицы и кишечника и играть роль в противовоспалительной, барьерной изоляции и стимулировании регенерации. Цель состоит в том, чтобы подробно представить здесь специфический процесс синтеза желатина-NB, чтобы желатин-NB можно было применять в большем количестве сценариев восстановления повреждений. Кроме того, мы призываем других исследователей еще больше укрепить и расширить природу этого материала, чтобы он соответствовал большему количеству сценариев применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши C57BL / 6 были приобретены в больнице сэра Ран Шоу Медицинской школы Чжэцзянского университета. Новозеландские кролики были приобретены в Чжэцзянском университете. Животные содержались в естественных условиях цикла света и темноты, им бесплатно давали пищу и питьевую воду. Все экспериментальные процедуры были этически одобрены институциональными руководящими принципами стандартных руководящих принципов Комитета по этике Чжэцзянского университета (ZJU20200156) и Комитета по уходу за животными и использованию в больнице Сэр Ран Ран Шоу Медицинской школы Чжэцзянского университета, которые соответствовали Руководству NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию (SRRSH202107106).
1. Синтез NB-COOH
- Приготовьте 4-гидрокси-3-(метокси-D3)бензальдегид (8,90 г, 58,5 мМ, 1,06 эквивалента [экв.]), карбонат калия (10,2 г, 73,8 мМ, 1,34 экв.) и метил-4-бромбутират (9,89 г, 55,0 мМ, 1,0 экв.) на основе протокола, предложенного в предыдущем исследовании10. Растворяют соединения в 40 мл N, N-диметилформамида (ДМФ) и перемешивают при температуре окружающей среды в течение 16 ч.
- Добавьте в смесь 200 мл воды с температурой 0 °C и осаждайте смесь до получения сырого продукта.
- Многократно растворяют сырой продукт в ДМФ, а затем осаждают в течение пяти циклов. Осаждайте сырой продукт и сушите его при 80 °C в течение 2 часов, чтобы получить ранний продукт.
2. Химическая модификация и переработка
- Выполните ipso-замену метилового эфира 4-(4-формил-2-метоксифеноксиметоксифенил)бутановой кислоты, как описано ниже.
- Медленно добавить 9,4 г метил-4-(4-формил-2-метоксифенокси)бутаноата (37,3 мМ, 1 экв.) в предварительно охлажденный (-2 °C) раствор 70% азотной кислоты (140 мл) и перемешивать при -2 °C в течение 3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от температуры реакции нитрования будет происходить ipsoзамещение формильного фрагмента. - Отфильтруйте смесь (~ 9,0 г) 200 мл воды с температурой 0 °C, затем очистите ее в ДМФА для осаждения твердого продукта.
- Гидролизуют твердый продукт в трифторуксусной кислоте (TFA)/H2O, 1:10 об./об. (100 мл) при 90 °C и высушивают. Удалите растворитель под давлением 80 кПа, чтобы получить конечный промежуточный продукт, сухой бледно-желтый порошок.
- Растворяют промежуточный продукт (7,4 г, 23,8 мМ, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (ТГФ)/этаноле в дозе 1:1 об./об. (100 мл). Затем медленно добавляют 1,43 г NaBH4 (35,7 мМ, 1,5 экв.) при 0 °C. Через 3 ч удалите все растворители под вакуумом и суспендируйте остаток в воде 1:1 и растворе дихлорметана (по 50 мл каждый).
- Подготовьте дихлорметан для извлечения продукта из водного слоя. Удалите органический слой и просушите над сульфатом магния.
- Очистите сырой продукт с помощью колоночной хроматографии силикагеля с использованием DCM/MeOH в соотношении 10:1 (1% TEA). Наконец, получают 5,31 г (18,6 мМ, 78,3%) относительно чистого желтоватого порошка NB-COOH.
3. Синтез желатина-NB
- Приготовьте 5 г желатина для одной партии модификации. Приготовьте однородный раствор желатина, растворив 5 г желатина в 100 мл деионизированной воды, и храните при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь определяется исходное значение 33 x 10-5 моль ε-аминогрупп / г желатина11 . - Определите коэффициент подачи (FR) как молярное отношение между группами NB и первичными аминогруппами в желатине. В этом исследовании 53 мг NB с 1 г желатина были определены как FRNB = 1.
- Растворите 1,060 мг NB-COOH в 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для активации карбоксильных групп NB-COOH. Поскольку группа NB чувствительна к ультрафиолетовому (УФ) излучению в растворе, всегда держите ее подальше от света.
- Добавьте 746 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодимида гидрохлорида (EDC) в раствор NB-COOH DMSO и перемешивайте в течение 5 мин. После растворения EDC добавьте 448 мг N-гидроксисукцинимида (NHS) и перемешивайте в течение 5 минут.
- С помощью капельной воронки медленно опускайте смесь со скоростью 0,5 мл/мин в растворенный раствор желатина при интенсивном перемешивании до реакции при 45 °C в течение 4 часов.
4. Очистка и хранение продукта
- Диализируйте раствор желатина-NB от избытка деионизированной воды в течение не менее 3 дней, затем соберите, заморозьте и лиофилизируйте его, чтобы получить пену желатина-NB. Храните пену в эксикаторе в темноте для дальнейшего использования.
- Лиофилизированные пенопласты желатина-NB растворяют в деионизированной воде при температуре 37 °C непосредственно перед использованием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2А показана схема основных химических реакций, участвующих в синтезе желатина-NB, который способствует тканевой интеграции путем прививки групп NB к желатину. На рисунке 2B показано, что O-нитробензол желатина-NB-гидрогеля превращается в группу NB сразу после УФ-облучения, а затем активная альдегидная группа может быть сшита с аминогруппой с образованием основания Шиффа. На рисунке 2C показано, что различные соотношения групп NB могут приводить к различным сшитым структурам желатина-NB.
В то же время была проведена предварительная характеристика физических свойств желатина-НБ. Как показано на рисунке 3, желатин-NB обладает сильным гелеобразованием при низком соотношении сырья (FR) NB. Это означает, что желатин-NB с низким FR образует мягкий гидрогель из-за наличия большого количества аминогрупп, которые могут реагировать с фотогенерируемыми альдегидными группами, в то время как желатин-NB с высоким FR может поддерживать гибкую капельку. Мы также отметили, что общая морфология желатина-NB стабильно прилипает к поверхности роговицы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), как показано на рисунке 3C. Однако поврежденная поверхность роговицы, обработанная ничем или желатином, кажется гладкой. На рисунке 3D показано, что флуоресцентно меченный желатин-NB обладает способностью прилипать к ткани кишечника и образовывать плотное покрытие. Однако интенсивность флуоресценции желатиновой группы очень слабая, что указывает на то, что она не может прочно прилипать к стенке кишечника. На рисунке 3E показано, что как желатин, так и желатин-NB изначально способны прилипать к аминированной пластине. Однако после заливки фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) в аминированную пластину и замены его каждые 4 ч в течение 24 ч только желатин-NB поддерживает сильную флуоресценцию, что указывает на его сильное прилипание. Эти результаты показывают, что желатин-NB может прилипать к поверхности ткани, образуя однородный и стабильный плотный слой. Как показано на рисунке 3F, спектры поверхности роговицы и поверхности, обработанной желатином, почти одинаковы. Однако в группе, получавшей желатин-NB, при 400 эВ появляется дополнительный пик, что указывает на образование многих связей C = N в ткани после обработки УФ-активированным желатином-NB12.
Рисунок 1: Этапы реакции синтеза NB-COOH. На рисунке представлено схематическое изображение реакции синтеза Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Проектирование и синтез желатина-NB. (A) Схема химической реакции с образованием желатина-NB. (B) Принципиальная схема, иллюстрирующая фототриггерное превращение химической структуры гидрогеля желатин-NB. O-нитробензол превращается в группы NB под воздействием ультрафиолета. Затем активная альдегидная группа может впоследствии сшиваться с аминогруппами, образуя основания Шиффа. (C) Схема желатина-NB, образующего гидрогель и покрытие при различных соотношениях сырья. Эта цифра была изменена с12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика желатина-NB. (A) Различные желирующие характеристики желатина-NB при различных соотношениях сырья NB. (1-4) представляют собой 0,5, 1, 2 и 4 NB соотношения желатина-NB соответственно. (B) Общий вид инактивированного модифицированного раствора желатина-NB и раствора желатина-NB после ультрафиолетового освещения. (C) СЭМ-изображения поврежденной поверхности роговицы, желатина и поверхности роговицы, покрытой белком желатина-NB-4. Масштабные линейки: 30 мкм (верхние панели); 40 мкм (нижние панели, увеличенные). (D) Флуоресцентные изображения поверхности толстой кишки мышей, помеченные молекулярным покрытием из желатина и желатина-NB. Масштабные линейки: 200 мкм. (E) Флуоресцентные изображения меченых желатиновых и желатиновых пластин, обработанных молекулярным покрытием, обработанных молекулярным покрытием, через 0 ч и 24 ч. Масштабные линейки: 20 мкм. (F) Рентгеновская фотонная спектроскопия (XPS) связывания желатина-NB-4 с тканью. Сдвиг энергий связи пептида -C-NH- и аминоаминной группыC-NH2 из-за появления пика связи C = N выявляет УФ-индуцированное образование оснований Шиффа. Эта цифра была изменена с5 и12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Адгезивные материалы – это новый класс материалов. Все больше и больше исследователей стремятся к синтезу различных типов адгезивных материалов и пытаются найти их применение в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине и других областях, что привело к активному развитию в последние годы. Помимо сосредоточения внимания на сильной адгезии адгезивных материалов, исследователи также уделяют больше внимания другим свойствам, таким как инъекционность, самовосстановление, кровоостанавливающее, антибактериальное, контролируемое удаление и так далее13. Эти новые области применения значительно расширяют сферу применения адгезивных материалов с многообещающими перспективами применения.
В данной работе представлен метод синтеза нового гидрогеля желатина-НБ. Желатин-NB обладает сильной адгезией, и сообщается, что он может применяться для восстановления повреждений роговицы и кишечника в клинической практике 5,12. Поэтому популяризация метода получения желатина-NB имеет большое академическое и прикладное значение.
Ключевым этапом приготовления желатина-NB является процесс синтеза. Мы предлагаем концепцию коэффициента подачи (FR), который представляет собой молярное отношение между группой NB и первичной аминогруппой в желатине. FR для синтеза желатина-NB не является константой и может быть отрегулирован в соответствии с природой интерфейса адгезивной ткани. Для роговицы кроликов FR желатиновых глазных капель NB составляет FRNB = 2, в то время как количество аминогрупп на поверхности толстой кишки мыши относительно велико12; FRNB = 2 не является оптимальным FR для этого, и обычно его необходимо увеличить примерно до 4 для достижения оптимального эффекта адгезии. При синтезе желатина-NB в различных сценариях применения необходимо установить градиент FR перед экспериментом, чтобы исследовать наилучший эффект адгезии. Кроме того, мы упоминали в статье, что NB необходимо всегда держать подальше от ультрафиолетового света, потому что группы NB очень чувствительны к ультрафиолетовому излучению; мы предлагаем максимально избегать всех прямых источников света в процессе синтеза, чтобы свести к минимуму влияние ультрафиолетового света на группы NB.
В то же время эта технология синтеза имеет некоторые ограничения. Например, низкий выход сырой продукции приводит к необходимости большего потребления сырья. Мы пытаемся изменить различные условия реакции для повышения выхода, например, отрегулировать температуру реакции и еще больше увеличить время реакции. Мы будем своевременно обновлять ход исследований. Исследователи могут обратиться к видео, чтобы улучшить стратегию приготовления желатина о-нитрозобензальдегида или дополнительно модифицировать группу на этой основе для удовлетворения дальнейших биомедицинских потребностей. Мы полагаем, что метод синтеза желатина о-нитрозобензальдегида, описанный в этой статье, ускорит развитие биосинтетической и регенеративной медицины. Кроме того, ожидается, что желатин-NB будет применяться в критических клинических случаях, таких как кровотечение, вызванное острым повреждением сосудов, разрыв печени и селезенки, а также перфорация желудка в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
