Summary
Le protocole présenté ici montre la synthèse d’un hydrogel adhésif fort gélatine o-nitrosobenzaldéhyde (gélatine-NB). La gélatine-NB a une capacité d’adhérence tissulaire rapide et efficace, qui peut former une barrière physique solide pour protéger les surfaces des plaies, de sorte qu’elle devrait être appliquée au domaine de la biotechnologie de réparation des blessures.
Abstract
Les matériaux adhésifs sont devenus des biomatériaux populaires dans le domaine de l’ingénierie biomédicale et tissulaire. Dans nos travaux précédents, nous avons présenté un nouveau matériau - la gélatine o-nitrosobenzaldéhyde (gélatine-NB) - qui est principalement utilisé pour la régénération tissulaire et a été validé dans des modèles animaux de lésions cornéennes et de maladies inflammatoires de l’intestin. Il s’agit d’un nouvel hydrogel formé par modification de la gélatine biologique avec de l’o-nitrosobenzaldéhyde (NB). La gélatine-NB a été synthétisée en activant le groupe carboxyle du NB-COOH et en réagissant avec la gélatine par l’intermédiaire du chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) et du N-hydroxysuccinimide (NHS). Le composé obtenu a été purifié pour générer le produit final, qui peut être stocké de manière stable pendant au moins 18 mois. NB a une forte adhérence à -NH2 sur le tissu, ce qui peut former de nombreuses liaisons C = N, augmentant ainsi l’adhésion de la gélatine-NB à l’interface tissulaire. Le processus de préparation comprend des étapes pour la synthèse du groupe NB-COOH, la modification du groupe, la synthèse de la gélatine-NB et la purification du composé. L’objectif est de décrire en détail le processus de synthèse spécifique de la gélatine-NB et de démontrer l’application de la gélatine-NB à la réparation des dommages. En outre, le protocole est présenté pour renforcer et élargir davantage la nature du matériel produit par la communauté scientifique pour des scénarios plus applicables.
Introduction
L’hydrogel est un type de polymère tridimensionnel formé par gonflement de l’eau. En particulier, l’hydrogel dérivé d’une matrice extracellulaire est largement utilisé dans le domaine de la biosynthèse et de la médecine régénérative en raison de son excellente biocompatibilité et de son efficacité thérapeutique1. Des hydrogels ont été rapportés pour le traitement des ulcères gastriques, des névrites, de l’infarctus du myocarde 2,3,4 et d’autres maladies. De plus, il a été prouvé que la gélatine-NB peut favoriser l’issue de l’inflammation de la maladie inflammatoire de l’intestin (MII)5. Les hydrogels traditionnels comprennent la gomme gellane, la gélatine, l’acide hyaluronique, le polyéthylèneglycol (PEG), les hydrophobes/hydrophiles, les hydrophobes/hydrophiles, l’alginate/polyacrylamide, le double réseau et les hydrogelspolyamphotères 6, qui ont tous de bonnes propriétés histocompatibles et mécaniques. Cependant, ces hydrogels traditionnels sont vulnérables à l’humidité et à l’air présents dans l’environnement. S’ils sont exposés à l’air pendant une longue période, ils perdront de l’eau et sècheront; S’ils sont immergés dans l’eau pendant une longue période, ils absorberont l’eau et se dilateront7, réduisant ainsi leur flexibilité et leur fonction mécanique. De plus, le maintien de l’adhérence tissulaire des hydrogels conventionnels est un défi majeur8.
Sur cette base, nous avons conçu et synthétisé un hydrogel à l’échelle nanométrique gélatine-NB, qui est un nouvel hydrogel formé en modifiant la gélatine biologique avec NB (Figure 1). NB a une forte capacité d’adhérence à -NH2 sur le tissu, ce qui peut former un grand nombre de liaisons C = N, augmentant ainsi l’adhérence de l’interface hydrogel-tissu. Cette forte adhérence peut faire adhérer fermement l’hydrogel à la surface du tissu, formant ainsi un revêtement moléculaire de niveau nanométrique. Dans les études précédentes de l’équipe, il a été confirmé que ce type de revêtement hydrogel modifié a amélioré l’adhérence tissulaire9; Il peut adhérer de manière stable aux organes et tissus cornéens et intestinaux et jouer un rôle anti-inflammatoire, d’isolation de barrière et de promotion de la régénération. L’objectif est d’introduire ici en détail le processus de synthèse spécifique de la gélatine-NB, afin que la gélatine-NB puisse être appliquée dans plus de scénarios de réparation des dommages. De plus, nous encourageons d’autres chercheurs à renforcer et à élargir la nature de ce matériau pour l’adapter à davantage de scénarios d’application.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les souris C57BL / 6 ont été achetées à l’école de médecine Sir Run Run Shaw de l’Université du Zhejiang. Les lapins néo-zélandais ont été achetés à l’Université du Zhejiang. Les animaux ont été maintenus dans des conditions naturelles de cycle lumière-obscurité et ont reçu de la nourriture et de l’eau potable librement. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées de manière éthique par les directives institutionnelles des directives standard du comité d’éthique de l’Université du Zhejiang (ZJU20200156) et du comité de soin et d’utilisation des animaux de l’école de médecine de l’Université du Zhejiang Sir Run Run Shaw, qui se conformait au guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (SRRSH202107106).
1. Synthèse du NB-COOH
- Préparer le 4-hydroxy-3-(méthoxy-D3) benzaldéhyde (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 équivalents [eq.]), le carbonate de potassium (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) et le 4-bromobutyrate de méthyle (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) en fonction du protocole proposé dans l’étude précédente10. Dissoudre les composés dans 40 mL de N,N-diméthylformamide (DMF) et agiter à température ambiante pendant 16 h.
- Ajouter 200 mL d’eau à 0 °C au mélange et précipiter le mélange pour obtenir un produit brut.
- Dissoudre à plusieurs reprises le produit brut dans du DMF, puis précipiter pendant cinq cycles. Précipiter le produit brut et le sécher à 80 °C pendant 2 h pour obtenir le produit primeur.
2. Modification et traitement chimiques
- Effectuer la substitution ipso de l’ester méthylique de l’acide 4-(4-formyl-2-méthoxyphénoxyméthoxyphényl)butanoïque comme décrit ci-dessous.
- Ajouter lentement 9,4 g de butanoate de 4-(4-formyl-2-méthoxyphénoxy) de méthyle (37,3 mM, 1 éq.) à une solution prérefroidie (-2 °C) d’acide nitrique à 70 % (140 mL) et agiter à -2 °C pendant 3 h.
REMARQUE: En fonction de la température de la réaction de nitration, la substitution ipso de la fraction formyle se produira. - Filtrer le mélange (~9,0 g) avec 200 mL d’eau à 0 °C, puis le purifier dans du FMM pour précipiter un produit solide.
- Hydrolyser le produit solide dans de l’acide trifluoroacétique (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 mL) à 90 °C et sécher. Retirer le solvant sous 80 kPa pour obtenir le produit intermédiaire final, une poudre sèche jaune pâle.
- Dissoudre le produit intermédiaire (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 éq.) dans le tétrahydrofurane (THF)/éthanol, 1:1 v/v (100 mL). Ajouter ensuite 1,43 g deNaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) lentement à 0 °C. Après 3 h, retirer tous les solvants sous vide et suspendre le résidu dans une solution d’eau et de dichlorométhane 1:1 (50 mL chacune).
- Préparer le dichlorométhane pour extraire le produit de la couche aqueuse. Retirer la couche organique et sécher sur le sulfate de magnésium.
- Purifier le produit brut par chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant DCM/MeOH à un rapport de 10:1 (1% TEA). Enfin, obtenir 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) de poudre jaunâtre relativement pure NB-COOH.
3. Synthèse de gélatine-NB
- Préparer 5 g de gélatine pour un lot de modification. Préparer une solution homogène de gélatine en dissolvant 5 g de gélatine dans 100 mL d’eau désionisée et conserver à 37 °C.
REMARQUE: Ici, les 33 x 10-5 moles d’origine ε-groupes aminés / g gélatine11 sont définies. - Définir le rapport alimentaire (FR) comme le rapport molaire entre les groupes NB et les groupes aminés primaires dans la gélatine. Dans cette étude, 53 mg de NB avec 1 g de gélatine ont été définis comme FRNB = 1.
- Dissoudre 1 060 mg de NB-COOH dans 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour activer les groupes carboxyle du NB-COOH. Étant donné que le groupe NB est sensible à la lumière ultraviolette (UV) lorsqu’il est en solution, gardez-le toujours à l’écart de la lumière.
- Ajouter 746 mg de chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodimide (EDC) dans la solution de NB-COOH DMSO et agiter pendant 5 min. Après dissolution de l’EDC, ajouter 448 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et agiter pendant 5 minutes.
- Utiliser un entonnoir à goutte pour déposer lentement le mélange à un débit de 0,5 mL/min dans la solution de gélatine dissoute en agitant vigoureusement pour réagir à 45 °C pendant 4 h.
4. Purification et stockage du produit
- Dialyser la solution gélatine-NB contre l’excès d’eau désionisée pendant au moins 3 jours, puis recueillir, congeler et lyophiliser pour obtenir les mousses gélatine-NB. Gardez les mousses dans un dessiccateur dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
- Dissoudre les mousses de gélatine lyophilisée-NB dans de l’eau désionisée à 37 °C, immédiatement avant utilisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 2A montre un schéma des principales réactions chimiques impliquées dans la synthèse de la gélatine-NB, ce qui favorise l’intégration tissulaire en greffant des groupes NB sur de la gélatine. La figure 2B montre que l’O-nitrobenzène de l’hydrogel gélatine-NB se transforme en un groupe NB immédiatement après l’irradiation UV, puis le groupe aldéhyde actif peut être réticulé avec un groupe amino pour former une base de Schiff. La figure 2C indique que différents ratios de groupes NB peuvent conduire à différentes structures réticulées de gélatine-NB.
Parallèlement, une caractérisation préliminaire des propriétés physiques de la gélatine-NB a également été réalisée. Comme le montre la figure 3, la gélatine-NB a une forte gélification lorsque le rapport d’alimentation (FR) de NB est faible. Cela signifie que la gélatine-NB à faible FR forme un hydrogel mou en raison de la présence d’un grand nombre de groupes aminés qui peuvent réagir avec les groupes aldéhydes photogénérés, tandis que la gélatine-NB à FR élevé peut maintenir une gouttelette flexible. Nous avons également observé que la morphologie globale de la gélatine-NB adhère de manière stable à la surface cornéenne par microscopie électronique à balayage (MEB), comme le montre la figure 3C. Cependant, une surface cornéenne blessée traitée avec rien ou de la gélatine semble être lisse. La figure 3D montre que la gélatine-NB marquée par fluorescence a la capacité d’adhérer au tissu intestinal et de former un revêtement dense. Cependant, l’intensité de fluorescence du groupe gélatine est très faible, ce qui indique qu’il n’adhère pas fermement à la paroi intestinale. La figure 3E montre que la gélatine et la gélatine-NB sont initialement capables d’adhérer à la plaque aminée. Cependant, après avoir versé une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la plaque aminée et l’avoir changée toutes les 4 heures pendant 24 h, seule la gélatine-NB maintient une forte fluorescence, indiquant qu’elle adhère fortement. Ces résultats indiquent que la gélatine-NB peut adhérer à la surface du tissu pour former une couche dense uniforme et stable. Comme le montre la figure 3F, les spectres d’une surface cornéenne et d’une surface traitée à la gélatine sont presque les mêmes. Cependant, dans le groupe traité gélatine-NB, il y a un pic supplémentaire apparaissant à 400 eV, indiquant la formation de nombreuses liaisons C = N dans le tissu après traitement avec de la gélatine activée par UV-NB12.
Figure 1 : Étapes de la réaction de synthèse NB-COOH. La figure fournit une représentation schématique de la réaction de synthèse Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Conception et synthèse de la gélatine-NB. (A) Schéma de la réaction chimique pour la formation de gélatine-NB. (B) Schéma de principe illustrant la transformation de la structure chimique photodéclenchée de l’hydrogel gélatine-NB. L’O-nitrobenzène est converti en groupes NB sous exposition aux UV. Ensuite, le groupe aldéhyde actif pourrait ensuite se réticuler avec des groupes aminés pour former des bases de Schiff. (C) Schéma de l’hydrogel formant de la gélatine-NB et de l’enrobage sous différents rapports d’alimentation. Ce chiffre a été modifié par rapport à12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation de la gélatine-NB. (A) Les performances de gélification variables de la gélatine-NB avec différents rapports d’alimentation de NB. (1-4) représentent respectivement 0,5, 1, 2 et 4 ratios d’alimentation en gélatine-NB. (B) Vue générale de la solution de gélatine-NB modifiée inactivée et de la solution de gélatine-NB après éclairage UV. (C) Images MEB de la surface cornéenne blessée, de la gélatine et de la surface cornéenne traitée par le revêtement de protéines gélatine-NB-4. Barres d’échelle: 30 μm (panneaux supérieurs); 40 μm (panneaux inférieurs, agrandis). (D) Images de fluorescence de la surface colique des souris marquées par un revêtement moléculaire de gélatine et de gélatine-NB. Barres d’échelle : 200 μm. (E) Images de fluorescence des plaques aminées traitées à la gélatine et à la gélatine-NB à 0 h et 24 h. Barres d’échelle: 20 μm. (F) Spectroscopie de photons X (XPS) de la liaison gélatine-NB-4 au tissu. Les énergies de liaison du peptide -C-NH- et du groupe amino amine C-NH2 se déplaçant en raison de l’apparition d’un pic de liaison C = N révèle la formation induite par les UV des bases de Schiff. Ce chiffre a été modifié de5 à12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les matériaux adhésifs sont une nouvelle classe de matériaux. De plus en plus de chercheurs sont engagés dans la synthèse de divers types de matériaux adhésifs et tentent de trouver leurs applications en biotechnologie, en génie tissulaire, en médecine régénérative et dans d’autres domaines, ce qui a conduit à un développement vigoureux ces dernières années. En plus de se concentrer sur la forte adhérence des matériaux adhésifs, les chercheurs accordent également plus d’attention à d’autres propriétés, telles que l’injectabilité, l’auto-guérison, l’hémostatique, l’antibactérien, l’élimination contrôlée, etc.13. Ces nouvelles applications élargissent considérablement le champ d’application des matériaux adhésifs avec des perspectives d’application prometteuses.
Dans cet article, la méthode de synthèse d’un nouvel hydrogel gélatine-NB a été présentée. La gélatine-NB a une forte adhérence, et il est rapporté qu’elle peut être appliquée à la réparation des lésions cornéennes et intestinales dans la pratique clinique 5,12. Par conséquent, il est d’une grande valeur académique et d’application de populariser la méthode de préparation de la gélatine-NB.
L’étape clé pour la préparation de la gélatine-NB est le processus de synthèse. Nous proposons le concept de ratio d’alimentation (FR), qui est le rapport molaire entre le groupe NB et le groupe amino primaire dans la gélatine. Le FR pour synthétiser la gélatine-NB n’est pas une constante et peut être ajusté en fonction de la nature de l’interface tissulaire adhérente. Pour les cornées de lapin, le FR des gouttes ophtalmiques gélatine-NB est FRNB = 2, tandis que le nombre de groupes aminés à la surface des côlons de souris est relativement élevé12; FRNB = 2 s’avère ne pas être le FR optimal pour cela, et doit généralement être augmenté à environ 4 pour obtenir l’effet d’adhérence optimal. Lors de la synthèse de gélatine-NB dans différents scénarios d’application, il est nécessaire de définir un gradient FR pré-expérimental pour explorer le meilleur effet d’adhésion. De plus, nous avons mentionné dans l’article que le NB doit être tenu à l’écart de la lumière UV en tout temps, car les groupes NB sont très sensibles aux UV; nous suggérons d’éviter autant que possible toutes les sources de lumière directe pendant le processus de synthèse, afin de minimiser l’impact de la lumière UV sur les groupes NB.
En même temps, cette technologie de synthèse présente certaines limites. Par exemple, le faible rendement des produits bruts entraîne la nécessité d’une plus grande consommation de matières premières. Nous essayons de modifier diverses conditions de réaction pour améliorer le rendement, telles que l’ajustement de la température de réaction et l’extension du temps de réaction. Nous mettrons à jour les progrès de la recherche à temps. Les chercheurs peuvent se référer à la vidéo pour améliorer la stratégie de préparation de la gélatine o-nitrosobenzaldéhyde ou modifier davantage le groupe sur cette base pour répondre à d’autres besoins biomédicaux. Nous croyons que la méthode de synthèse de la gélatine o-nitrosobenzaldéhyde décrite dans cet article accélérera le développement de la biosynthèse et de la médecine régénérative. De plus, la gélatine-NB devrait être appliquée davantage dans des cas cliniques critiques, tels que les saignements causés par une lésion vasculaire aiguë, la rupture du foie et de la rate et la perforation gastrique à l’avenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
