Summary
这里介绍的方案显示了强粘性水凝胶明胶O-亚硝基苯甲醛（明胶-NB）的合成。明胶-NB具有快速高效的组织粘附能力，可以形成强大的物理屏障来保护伤口表面，因此有望应用于损伤修复生物技术领域。
Abstract
粘接材料已成为生物医学和组织工程领域流行的生物材料。在我们之前的工作中，我们提出了一种新材料 - 明胶邻亚硝基苯甲醛（明胶-NB） - 主要用于组织再生，并已在角膜损伤和炎症性肠病的动物模型中得到验证。这是一种通过用邻亚硝基苯甲醛（NB）修饰生物明胶而形成的新型水凝胶。明胶-NB通过激活NB-COOH的羧基，并通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与明胶反应合成。将得到的化合物纯化以生成最终产品，其可稳定储存至少18个月。NB对组织上的-NH2 有很强的粘附性，可以形成许多C=N键，从而增加了明胶-NB对组织界面的粘附。制备过程包括合成NB-COOH基团、修饰基团、合成明胶-NB和纯化化合物的步骤。目的是详细描述明胶-NB的具体合成过程，并演示明胶-NB在损伤修复中的应用。此外，提出该议定书是为了进一步加强和扩大科学界为更适用的情况制作的材料的性质。
Introduction
水凝胶是一种由水溶胀形成的三维聚合物。特别是，来源于细胞外基质的水凝胶因其优异的生物相容性和治疗效果而广泛应用于生物合成和再生医学领域1。水凝胶已被报道用于治疗胃溃疡、神经炎、心肌梗塞2、3、4 和其他疾病。此外，已经证明明胶-NB可以促进炎症性炎症性肠病（IBD）的结果5。传统的水凝胶包括结冷胶、明胶、透明质酸、聚乙二醇（PEG）、层状疏水/亲水、海藻酸盐/聚丙烯酰胺、双网络和多两性水凝胶6，均具有良好的组织相容性和机械性能。然而，这些传统的水凝胶容易受到环境中的水分和空气的影响。如果长时间暴露在空气中，会失水变干;如果它们长时间浸泡在水中，它们会吸收水分并膨胀7，从而降低它们的柔韧性和机械功能。此外，保持传统水凝胶的组织粘附力是一项重大挑战8。
基于此，我们设计并合成了一种纳米级水凝胶明胶-NB，这是一种用NB修饰生物明胶形成的新型水凝胶（图1）。NB对-NH2 在组织上的粘附能力很强，可以形成大量的C=N键，从而增加了水凝胶-组织界面的粘附性。这种强的附着力可以使水凝胶牢固地粘附在组织表面，从而形成纳米级的分子涂层。在团队先前的研究中，已经证实这种改性水凝胶涂层提高了组织粘附性9;能稳定地粘附在角膜和肠道器官组织上，起到抗炎、屏障隔离、再生促进作用。目的是在这里详细介绍明胶-NB的具体合成过程，让明胶-NB应用于损伤修复的更多场景。此外，我们鼓励其他研究人员进一步加强和扩展这种材料的性质，以适应更多的应用场景。
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Protocol
C57BL/6小鼠购自浙江大学医学院邵逸夫医院。新西兰兔是从浙江大学购买的。动物在自然的明暗循环条件下饲养，并自由提供食物和饮用水。所有实验程序均通过浙江大学伦理委员会标准指南（ZJU20200156）和浙江大学医学院邵逸夫爵士医院动物护理和使用委员会的机构指南，符合NIH实验动物护理和使用指南（SRRSH202107106）。
1. NB-COOH的合成
- 根据先前研究中提出的方案制备 4-羟基-3-（甲氧基-D3）苯甲醛（8.90 g、58.5 mM、1.06 当量）、碳酸钾（10.2 g、73.8 mM、1.34 当量）和 4-溴丁酸甲酯（9.89 g、55.0 mM、1.0 当量）。将化合物溶解在 40 mL 的 N，N-二甲基甲酰胺 （DMF） 中，并在环境温度下搅拌 16 小时。
- 向混合物中加入200mL的0°C水，使混合物沉淀，得粗品。
- 将粗品反复溶解在DMF中，然后沉淀五个循环。沉淀粗品，在80°C干燥2小时，得早期产物。
2. 化学改性与加工
- 如下所述，对4-（4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基甲氧基苯基）丁酸甲酯进行ipso取代。
- 缓慢加入9.4g4-（4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基）丁酸甲酯（37.3mM，1当量）到70%硝酸（140mL）的预冷（-2°C）溶液中，并在-2°C下搅拌3小时。
注意：根据硝化反应的温度，将发生甲酰基部分的当然取代。 - 用200mL的0°C水过滤混合物（~9.0g），然后在DMF中纯化以沉淀固体产物。
- 在90°C下将固体产物在三氟乙酸（TFA）/H2O，1：10 v/v （100 mL）中水解并干燥。除去80kPa以下的溶剂，得到最终中间产物，干燥的淡黄色粉末。
- 将中间产物（7.4 g、23.8 mM、1.0 eq.） 溶解在四氢呋喃 （THF）/乙醇中，1：1 v/v （100 mL）。然后在0°C下缓慢加入1.43gNaBH4 （35.7mM，1.5当量）。 3小时后，在真空下除去所有溶剂，并将残留物悬浮在1：1水和二氯甲烷溶液（每个50mL）中。
- 制备二氯甲烷以从水层中提取产品。除去有机层并用硫酸镁干燥。
- 使用DCM / MeOH以10：1的比例（1%TEA）通过硅胶柱色谱法纯化粗产物。最后，获得5.31克（18.6mM，78.3%）相对纯的淡黄色粉末NB-COOH。
3. 明胶-NB的合成
- 准备5克明胶进行一批改性。通过将5g明胶溶解在100mL去离子水中并储存在37°C来制备均匀的明胶溶液。
注意：这里定义了原始的33 x 10-5摩尔ε- 氨基/g明胶11 。 - 将进料比（FR）定义为明胶中NB基团和伯氨基之间的摩尔比。在这项研究中，53毫克NB和1克明胶被定义为FRNB = 1。
- 将 1，060 mg NB-COOH 溶解在 5 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，以激活 NB-COOH 的羧基。由于NB基团在溶液中对紫外线（UV）敏感，因此请始终使其远离光线。
- 将746mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐（EDC）加入NB-COOH DMSO溶液中，搅拌5分钟。EDC溶解后，加入448mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）并搅拌5分钟。
- 使用滴液漏斗以0.5mL / min的速率缓慢地将混合物滴入溶解的明胶溶液中，剧烈搅拌以在45°C下反应4小时。
4. 产品的纯化和储存
- 将明胶-NB溶液与过量的去离子水透析至少3天，然后收集，冷冻和冻干以获得明胶-NB泡沫。将泡沫放在干燥器中，在黑暗中以备将来使用。
- 使用前立即将冻干明胶 - NB泡沫溶解在37°C的去离子水中。
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Representative Results
图2A 显示了明胶-NB合成中涉及的主要化学反应的示意图，明胶-NB通过将NB基团嫁接到明胶上来促进组织整合。 图2B 显示，明胶-NB水凝胶的O-硝基苯在紫外线照射后立即转化为NB基团，然后活性醛基团可以与氨基交联形成席夫碱。 图2C 表明，不同比例的NB基团会导致明胶-NB的不同交联结构。
同时，还对明胶-NB的物理性质进行了初步表征。如图3所示，当NB的进料比（FR）较低时，明胶-NB具有很强的凝胶化作用。这意味着低FR的明胶-NB由于存在大量可以与光生醛基团反应的氨基而形成软水凝胶，而高FR的明胶-NB可以保持柔韧的液滴。我们还观察到，通过扫描电子显微镜（SEM）观察到明胶-NB的整体形态稳定地粘附在角膜表面，如图3C所示。然而，没有用任何明胶或明胶处理的受伤角膜表面似乎是光滑的。图3D显示，荧光标记的明胶-NB具有粘附在肠道组织并形成致密涂层的能力。然而，明胶基团的荧光强度非常弱，表明它不能牢固地粘附在肠壁上。图3E显示明胶和明胶-NB最初都能够粘附在胺化板上。然而，将磷酸盐缓冲盐水（PBS）倒入胺化板中并每4小时更换一次24小时后，只有明胶-NB保持强荧光，表明其粘附性强。这些结果表明，明胶-NB可以粘附在组织表面，形成均匀稳定的致密层。如图3F所示，角膜表面和用明胶处理的表面的光谱几乎相同。然而，在明胶-NB处理组中，在400eV处出现一个额外的峰，表明用紫外线活化的明胶-NB12处理后在组织中形成许多C = N键。
图1：NB-COOH合成反应的步骤。 该图提供了合成反应的示意图 请单击此处查看此图的大图。
图2：明胶-NB的设计和合成 。 （A）明胶-NB形成的化学反应示意图。（B）明胶-NB水凝胶光触发化学结构转变示意图。邻硝基苯在紫外线照射下转化为NB基团。然后活性醛基随后可以与氨基交联形成希夫碱。（C）不同进料比下明胶-NB成层水凝胶和包衣示意图。这个数字是从12修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图3：明胶-NB的表征。 （A）明胶-NB在不同NB进料比下的不同胶凝性能。（1-4）分别代表明胶-NB的0.5、1、2和4 NB进料比例。（B）灭活的改性明胶-NB溶液和紫外光照后的明胶-NB溶液的大致视图。（C）受伤角膜表面，明胶和明胶-NB-4蛋白涂层处理的角膜表面的SEM图像。比例尺：30 μm（顶板）;40 μm（底板，放大）。（D）用明胶和明胶-NB分子包衣标记的小鼠结肠表面的荧光图像。比例尺：200 μm。 （E）标记明胶和明胶-NB分子涂层处理的胺化板在0小时和24小时的荧光图像。比例尺：20 μm。 （F）明胶-NB-4与组织结合的X射线光子光谱（XPS）。肽-C-NH-和氨基胺基团C-NH2 的键能由于C = N键峰的出现而移动，揭示了紫外诱导的希夫碱的形成。这个数字是从5 和12修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
粘接材料是一类新型材料。越来越多的研究人员致力于各类胶粘剂材料的合成，并试图在生物技术、组织工程、再生医学等领域寻找其应用，这导致了近年来的蓬勃发展。除了关注粘合材料的强附着力外，研究人员还更加关注其他性能，如注射性、自愈性、止血性、抗菌性、控制去除等13。这些新应用极大地扩大了胶粘剂材料的应用范围，具有广阔的应用前景。
本文介绍了一种新型水凝胶明胶-NB的合成方法。明胶-NB具有很强的粘附力，据报道在临床实践中可应用于角膜损伤和肠道损伤的修复5，12。因此，推广明胶-NB的制备方法具有重要的学术和应用价值。
制备明胶-NB的关键步骤是合成过程。我们提出了进料比（FR）的概念，即明胶中NB基团和伯氨基之间的摩尔比。用于合成明胶-NB的FR不是恒定的，可以根据贴壁组织界面的性质进行调整。对于兔角膜，明胶-NB滴眼液的FR为FRNB =2，而小鼠结肠表面的氨基数相对较高，为12;FRNB = 2被证明不是最佳的FR，通常需要增加到4左右才能达到最佳的粘合效果。在不同应用场景中合成明胶-NB时，需要设置实验前FR梯度，以探索最佳的粘附效果。另外，我们在文章中提到NB需要时刻远离紫外线，因为NB基团对紫外线非常敏感;我们建议在合成过程中尽可能避免所有直射光源，以尽量减少紫外线对NB基团的影响。
同时，这种合成技术也存在一定的局限性。例如，原油产量低导致需要更大的原材料消耗。我们正在尝试改变各种反应条件以提高收率，例如调整反应温度和进一步延长反应时间。我们将及时更新研究进展。研究人员可以参考视频改进明胶邻亚硝基苯甲醛的制备策略，或在此基础上进一步修改基团以满足进一步的生物医学需求。我们相信，本文所述的明胶邻亚硝基苯甲醛的合成方法将加速生物合成和再生医学的发展。此外，明胶-NB有望在未来进一步应用于急性血管损伤引起的出血、肝脾破裂、胃穿孔等危重临床病例。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
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