Summary
ここで提示されたプロトコルは、強力な接着性ヒドロゲルゼラチンo-ニトロソベンズアルデヒド(ゼラチン-NB)の合成を示しています。ゼラチンNBは、迅速かつ効率的な組織接着能力を有し、創傷表面を保護するための強力な物理的障壁を形成することができるため、傷害修復バイオテクノロジーの分野への応用が期待されています。
Abstract
接着材料は、生物医学および組織工学の分野で人気のある生体材料になっています。前回の研究では、主に組織再生に使用され、角膜損傷や炎症性腸疾患の動物モデルで検証されている新素材であるゼラチンo-ニトロソベンズアルデヒド(ゼラチン-NB)を発表しました。生物学的ゼラチンをo-ニトロソベンズアルデヒド(NB)で修飾した新規ハイドロゲルです。ゼラチン-NBは、NB-COOHのカルボキシル基を活性化し、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を介してゼラチンと反応させることによって合成されました。得られた化合物を精製して最終生成物を生成し、これを少なくとも18ヶ月間安定に保存することができる。NBは、組織上の−NH2 に強い接着性を有し、これは多くのC = N結合を形成することができ、したがって組織界面へのゼラチン−NBの接着を増加させる。調製プロセスは、NB-COOH基の合成、基の修飾、ゼラチン-NBの合成、および化合物の精製のためのステップを含む。目標は、ゼラチン-NBの特定の合成プロセスを詳細に説明し、損傷修復へのゼラチン-NBの適用を実証することです。さらに、プロトコルは、より適用可能なシナリオのために科学界によって生成された材料の性質をさらに強化および拡大するために提示されています。
Introduction
ハイドロゲルは、水膨潤によって形成される三次元ポリマーの一種です。特に、細胞外マトリックス由来のハイドロゲルは、その優れた生体適合性および治療効果から生合成および再生医療の分野で広く用いられている1。ヒドロゲルは、胃潰瘍、神経炎、心筋梗塞2,3,4、およびその他の疾患の治療のために報告されています。さらに、ゼラチン-NBが炎症性炎症性腸疾患(IBD)5の結果を促進することができることが証明されています。従来のヒドロゲルには、ジェランガム、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、層状、疎水性/親水性、アルギン酸塩/ポリアクリルアミド、二重網目、およびポリ両性ヒドロゲル6が含まれ、これらはすべて良好な組織適合性および機械的特性を有する。ただし、これらの従来のヒドロゲルは、環境中の湿気や空気に対して脆弱です。長時間空気にさらされると、水分が失われて乾燥します。それらが長時間水に浸されると、それらは水を吸収して7膨張し、したがってそれらの柔軟性および機械的機能を低下させる。加えて、従来のヒドロゲルの組織接着性を維持することは大きな課題である8。
これに基づいて、生物学的ゼラチンをNBで修飾して形成された新規ヒドロゲルであるナノスケールのヒドロゲルゼラチン-NBを設計および合成しました(図1)。NBは、組織上の−NH2 に対する強い接着能力を有し、これは多数のC = N結合を形成することができ、したがってヒドロゲル - 組織界面の接着性を増加させる。この強力な接着により、ヒドロゲルが組織表面にしっかりと付着し、ナノレベルの分子コーティングを形成できます。チームの以前の研究では、この種の改質ヒドロゲルコーティングが組織の接着性を改善したことが確認されています9;角膜や腸の臓器や組織に安定して付着し、抗炎症、バリア隔離、再生促進の役割を果たすことができます。目標は、ゼラチン-NBの特定の合成プロセスをここで詳細に紹介し、ゼラチン-NBを損傷修復のより多くのシナリオに適用できるようにすることです。さらに、他の研究者が、より多くのアプリケーションシナリオに合わせて、この材料の性質をさらに強化および拡張することをお勧めします。
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Protocol
C57BL/6マウスは、浙江大学医学部サーランランショー病院から購入した。ニュージーランドのウサギは浙江大学から購入しました。動物は自然の明暗サイクル条件で維持され、食物と飲料水を自由に与えられました。すべての実験手順は、浙江大学倫理委員会標準ガイドライン(ZJU20200156)および実験動物の世話と使用のためのNIHガイド(SRRSH202107106)に準拠した浙江大学医学部サーランランショー病院動物管理および使用委員会の制度的ガイドラインによって倫理的に承認されました。
1. NB-COOHの合成
- 以前の研究10で提案されたプロトコルに基づいて、4-ヒドロキシ-3-(メトキシ-D3)ベンズアルデヒド(8.90 g、58.5 mM、1.06当量)、炭酸カリウム(10.2 g、73.8 mM、1.34当量)、および4-ブロモ酪酸メチル(9.89 g、55.0 mM、1.0当量)を調製します10。化合物を40 mLのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、周囲温度で16時間撹拌します。
- 混合物に0°Cの水200mLを加え、混合物を沈殿させ、粗生成物を得た。
- 粗生成物をDMFに繰り返し溶解し、5サイクル沈殿させる。粗生成物を沈殿させ、80°Cで2時間乾燥させて初期生成物を得る。
2.化学修飾と処理
- 後述するようにメチル4-(4-ホルミル-2-メトキシフェノキシメトキシフェニル)ブタン酸メチルエステルのイプソ置換を行う。
- 70%硝酸(140 mL)の予冷(-2°C)溶液に9.4 gの4-(4-ホルミル-2-メトキシフェノキシ)ブタン酸メチル(37.3 mM、1当量)をゆっくりと加え、-2°Cで3時間攪拌します。
注:ニトロ化反応の温度に応じて、ホルミル部分のイプソ置換が発生します。 - 混合物(~9.0 g)を0°Cの水200 mLでろ過し、DMFで精製して固体生成物を沈殿させます。
- 固体生成物をトリフルオロ酢酸(TFA)/H2O、1:10 v/v(100 mL)で90°Cで加水分解し、乾燥させます。80kPa下で溶媒を除去し、最終中間生成物である乾燥淡黄色粉末を得た。
- 中間生成物(7.4 g、23.8 mM、1.0当量)をテトラヒドロフラン(THF)/エタノール、1:1 v / v(100 mL)に溶解します。次に、1.43 gのNaBH4 (35.7 mM、1.5当量)を0°Cでゆっくりと加えます。 3時間後、真空下ですべての溶媒を除去し、残留物を1:1の水とジクロロメタン溶液(各50 mL)に懸濁します。
- 水層から生成物を抽出するためにジクロロメタンを調製する。有機層を取り除き、硫酸マグネシウムで乾かします。
- DCM/MeOHを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーで粗生成物を10:1の比率(1% TEA)で精製します。最後に、5.31 g (18.6 mM, 78.3%)の比較的純粋な黄色がかった粉末NB-COOHを得た。
3. ゼラチンNBの合成
- 1バッチの修飾のために5gのゼラチンを準備する。ゼラチン5gをイオン交換水100mLに溶解して均質ゼラチン溶液を調製し、37°Cで保存する。
注:ここでは、元の33 x 10-5モルε- アミノ基/ gゼラチン11 が定義されています。 - 供給比(FR)をゼラチン中のNB基と第一級アミノ基とのモル比として定義する。この研究では、53 mgのNBと1 gのゼラチンをFRNB = 1と定義しました。
- 1,060 mgのNB-COOHを5 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、NB-COOHのカルボキシル基を活性化します。NB基は溶液中の紫外線(UV)に敏感であるため、常に光から遠ざけてください。
- 746 mgの1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジミド塩酸塩(EDC)をNB-COOH DMSO溶液に加え、5分間攪拌します。EDCが溶解したら、448 mgのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を加え、5分間攪拌します。
- 滴下漏斗を使用して、激しく攪拌しながら溶解したゼラチン溶液に0.5 mL / minの速度で混合物をゆっくりと滴下し、45°Cで4時間反応させます。
4.製品の精製と保管
- ゼラチン-NB溶液を過剰の脱イオン水に対して少なくとも3日間透析し、次にそれを収集、凍結、および凍結乾燥してゼラチン-NBフォームを得る。さらに使用するために、フォームを暗所のデシケーターに保管してください。
- 凍結乾燥したゼラチン-NBフォームは、使用直前に37°Cのイオン交換水に溶解する。
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Representative Results
図2A は、ゼラチンにNB基を移植することによって組織統合を促進するゼラチン-NBの合成に関与する主な化学反応の概略図を示す。 図2B は、ゼラチン-NBヒドロゲルのO-ニトロベンゼンがUV照射直後にNB基に変換され、次に活性アルデヒド基がアミノ基と架橋してシッフ塩基を形成することができることを示しています。 図2C は、NB基の異なる比率がゼラチン−NBの異なる架橋構造をもたらし得ることを示す。
同時に、ゼラチン-NBの物理的性質の予備的特徴付けも行われた。図3に示すように、ゼラチン-NBは、NBの仕込み比(FR)が低いとゲル化が強い。これは、低FRのゼラチン-NBは、光生成したアルデヒド基と反応できる多数のアミノ基が存在するため、柔らかいヒドロゲルを形成するのに対し、FRが高いゼラチン-NBは柔軟な液滴を維持できることを意味します。また、図3Cに示すように、ゼラチン-NBの全体的な形態が走査型電子顕微鏡(SEM)によって角膜表面に安定して付着していることを観察しました。しかし、何もまたはゼラチンで処理された損傷した角膜表面は滑らかに見える。図3Dは、蛍光標識ゼラチン-NBが腸組織に接着し、緻密なコーティングを形成する能力を有することを示す。しかし、ゼラチン群の蛍光強度は非常に弱く、腸壁に強固に接着できないことを示している。図3Eは、ゼラチンおよびゼラチン−NBの両方が最初にアミノ化プレートに接着することができることを示す。しかし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をアミノ化プレートに注ぎ、4時間ごとに24時間交換した後、ゼラチン-NBのみが強い蛍光を維持し、強く接着することを示しています。これらの結果は、ゼラチン-NBが組織表面に付着して均一で安定した緻密層を形成できることを示しています。図3Fに示すように、角膜表面とゼラチンで処理した表面のスペクトルはほぼ同じである。しかし、ゼラチン-NB処理群では、400eVに余分なピークが現れ、UV活性化ゼラチン-NB12で処理した後の組織に多くのC=N結合が形成されたことを示しています。
図1:NB-COOH合成反応のステップ。 図は合成反応の概略図を提供します この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゼラチン-NBの設計と合成 。 (A)ゼラチン-NB形成のための化学反応の概略図。(b)ゼラチン-NBヒドロゲルの光トリガー化学構造変化を示す模式図。O-ニトロベンゼンはUV曝露下でNB基に変換されます。その後、活性アルデヒド基はアミノ基と架橋してシッフ塩基を形成する可能性があります。(C)ゼラチン-NB形成ヒドロゲルの概略図と、異なる供給比でのコーティング。この数値は12 から変更されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ゼラチン-NBの特性評価 。 (A)NBの様々な供給比によるゼラチン-NBのゲル化性能の変化。(1-4)ゼラチン-NBの0.5、1、2、および4NB供給比をそれぞれ表す。(b)UV照射後の不活化ゼラチン-NB溶液、及びゼラチン-NB溶液の全体像図。(c)損傷した角膜表面、ゼラチン、およびゼラチン-NB-4タンパク質コーティング処理された角膜表面のSEM画像。スケールバー:30μm(トップパネル);40 μm(底面パネル、拡大)。(d)ゼラチンおよびゼラチン-NB分子コーティングにより標識されたマウス結腸表面の蛍光画像。スケールバー:200μm。 (E)標識ゼラチンおよびゼラチン-NB分子コーティング処理アミノ化プレートの0時間および24時間での蛍光画像。スケールバー:20μm。 (F)ゼラチン-NB-4が組織に結合したX線光子分光法(XPS)。C=N結合ピークの出現によりシフトするペプチド−C−NH−およびアミノアミン基C−NH2 の結合エネルギーは、シッフ塩基のUV誘導形成を明らかにする。この図は、5 と12から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
接着材料は新しいクラスの材料です。様々な接着材料の合成に取り組む研究者が増え、バイオテクノロジー、組織工学、再生医療などの分野での応用が試みられ、近年は活発な発展を遂げています。研究者は、接着材料の強力な接着性に焦点を当てることに加えて、注射性、自己修復、止血、抗菌、制御された除去などの他の特性にも注意を払っています13。これらの新しいアプリケーションは、有望なアプリケーションの見通しを持つ接着剤の適用範囲を大幅に拡大します。
本論文では、新規ヒドロゲルゼラチン-NBの合成方法を紹介した。ゼラチン-NBは接着力が強く、臨床現場で角膜損傷や腸管損傷の修復に応用できることが報告されています5,12。したがって、ゼラチン-NBの調製方法を普及させることは、大きな学術的および応用的価値があります。
ゼラチン-NBを調製するための重要なステップは合成プロセスです。ゼラチン中のNB基と第一級アミノ基のモル比である供給比(FR)の概念を提案します。ゼラチン-NBを合成するためのFRは一定ではなく、付着組織界面の性質に応じて調整することができる。ウサギ角膜の場合、ゼラチン-NB点眼薬のFRはFRNB = 2であるが、マウス結腸の表面上のアミノ基の数は比較的高い12である。FRNB = 2は、これに最適なFRではないことが証明されており、最適な接着効果を達成するためには通常、約4に増やす必要があります。さまざまなアプリケーションシナリオでゼラチンNBを合成する場合、最良の接着効果を調べるために、実験前のFR勾配を設定する必要があります。さらに、NBグループはUVに非常に敏感であるため、NBは常にUV光から遠ざける必要があると記事で述べました。合成プロセス中は、NB基へのUV光の影響を最小限に抑えるために、すべての直接光源をできるだけ避けることをお勧めします。
同時に、この合成技術にはいくつかの制限があります。例えば、原油の低収率は、原材料のより多くの消費の必要性をもたらす。反応温度の調整やさらに反応時間の延長など、収率向上のため様々な反応条件の変更を試みています。研究の進捗状況は随時更新します。研究者は、ビデオを参照して、ゼラチンo-ニトロソベンズアルデヒドの調製戦略を改善したり、これに基づいてグループをさらに変更して、さらなる生物医学的ニーズを満たすことができます。本論文で紹介したゼラチンo-ニトロソベンズアルデヒドの合成法は、生合成・再生医療の発展を加速させるものと考えています。また、ゼラチンNBは、急性血管障害による出血、肝臓や脾臓の破裂、胃穿孔などの重要な臨床例への応用が期待されています。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
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