Summary
Il protocollo qui presentato mostra la sintesi di un forte idrogel adesivo gelatina o-nitrosobenzaldeide (gelatina-NB). La gelatina-NB ha una capacità di adesione tissutale rapida ed efficiente, che può formare una forte barriera fisica per proteggere le superfici delle ferite, quindi dovrebbe essere applicata al campo della biotecnologia per la riparazione delle lesioni.
Abstract
I materiali adesivi sono diventati biomateriali popolari nel campo dell'ingegneria biomedica e tissutale. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo presentato un nuovo materiale - gelatina o-nitrosobenzaldeide (gelatina-NB) - che viene utilizzato principalmente per la rigenerazione dei tessuti ed è stato convalidato in modelli animali di lesioni corneali e malattie infiammatorie intestinali. Questo è un nuovo idrogel formato modificando la gelatina biologica con o-nitrosobenzaldeide (NB). La gelatina-NB è stata sintetizzata attivando il gruppo carbossilico di NB-COOH e reagendo con la gelatina attraverso 1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato (EDC) e N-idrossisuccinimide (NHS). Il composto ottenuto è stato purificato per generare il prodotto finale, che può essere conservato stabilmente per almeno 18 mesi. NB ha una forte adesione a -NH2 sul tessuto, che può formare molti legami C = N, aumentando così l'adesione della gelatina-NB all'interfaccia tissutale. Il processo di preparazione comprende fasi per la sintesi del gruppo NB-COOH, la modifica del gruppo, la sintesi della gelatina-NB e la purificazione del composto. L'obiettivo è descrivere in dettaglio il processo di sintesi specifico della gelatina-NB e dimostrare l'applicazione della gelatina-NB per riparare i danni. Inoltre, il protocollo è presentato per rafforzare ed espandere ulteriormente la natura del materiale prodotto dalla comunità scientifica per scenari più applicabili.
Introduction
L'idrogel è un tipo di polimero tridimensionale formato dal rigonfiamento dell'acqua. In particolare, l'idrogel derivato da una matrice extracellulare è ampiamente utilizzato nel campo della biosintesi e della medicina rigenerativa per la sua eccellente biocompatibilità ed efficacia terapeutica1. Sono stati segnalati idrogel per il trattamento di ulcere gastriche, neuriti, infarto miocardico 2,3,4 e altre malattie. Inoltre, è stato dimostrato che la gelatina-NB può promuovere l'esito della malattia infiammatoria intestinale infiammatoria (IBD)5. Gli idrogel tradizionali includono gomma di gellano, gelatina, acido ialuronico, glicole polietilenico (PEG), stratificato, idrofobo / idrofilo, alginato / poliacrilammide, doppia rete e idrogel polianfotero6, tutti con buona istocompatibilità e proprietà meccaniche. Tuttavia, questi idrogel tradizionali sono vulnerabili all'umidità e all'aria nell'ambiente. Se sono esposti all'aria per lungo tempo, perderanno acqua e si asciugheranno; Se sono immersi nell'acqua per lungo tempo, assorbiranno acqua e si espanderanno7, riducendo così la loro flessibilità e funzione meccanica. Inoltre, mantenere l'adesione tissutale degli idrogel convenzionali è una grande sfida8.
Sulla base di questo, abbiamo progettato e sintetizzato una gelatina idrogel su scala nanometrica-NB, che è un nuovo idrogel formato modificando la gelatina biologica con NB (Figura 1). NB ha una forte capacità di adesione a -NH2 sul tessuto, che può formare un gran numero di legami C = N, aumentando così l'adesività dell'interfaccia idrogel-tessuto. Questa forte adesione può far aderire saldamente l'idrogel alla superficie del tessuto, formando così un rivestimento molecolare a livello nanometrico. Negli studi precedenti del team, è stato confermato che questo tipo di rivestimento idrogel modificato ha migliorato l'adesione dei tessuti9; Può aderire stabilmente agli organi e ai tessuti corneali e intestinali e svolgere ruoli anti-infiammatori, isolamento della barriera e promozione della rigenerazione. L'obiettivo è quello di introdurre il processo di sintesi specifico della gelatina-NB in dettaglio qui, in modo che la gelatina-NB possa essere applicata in più scenari di riparazione dei danni. Inoltre, incoraggiamo altri ricercatori a rafforzare ed espandere ulteriormente la natura di questo materiale per adattarsi a più scenari applicativi.
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Protocol
I topi C57BL / 6 sono stati acquistati dalla Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. I conigli neozelandesi sono stati acquistati dall'Università di Zhejiang. Gli animali sono stati mantenuti in condizioni naturali di ciclo luce-buio e hanno ricevuto cibo e acqua potabile liberamente. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate eticamente dalle linee guida istituzionali delle linee guida standard del Comitato etico dell'Università di Zhejiang (ZJU20200156) e della Scuola di medicina dell'Università di Zhejiang Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (SRRSH202107106).
1. Sintesi di NB-COOH
- Preparare 4-idrossi-3-(metossi-D3) benzaldeide (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalenti [eq.]), carbonato di potassio (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) e 4-bromobutirrato di metile (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) sulla base del protocollo proposto nello studio precedente10. Sciogliere i composti in 40 ml di N, N-dimetilformammide (DMF) e mescolare a temperatura ambiente per 16 ore.
- Aggiungere 200 ml di acqua a 0 °C alla miscela e far precipitare la miscela fino ad ottenere un prodotto grezzo.
- Sciogliere ripetutamente il prodotto grezzo in DMF e quindi precipitare per cinque cicli. Far precipitare il prodotto grezzo ed essiccarlo a 80 °C per 2 ore per ottenere il prodotto precoce.
2. Modifica chimica e lavorazione
- Effettuare la sostituzione ipso dell'estere metilico dell'acido 4-(4-formil-2-metossifenossi metossifenil) butanoico come descritto di seguito.
- Aggiungere 9,4 g di metil 4-(4-formil-2-metossifenossi) butanoato (37,3 mM, 1 eq.) lentamente ad una soluzione preraffreddata (-2 °C) di acido nitrico al 70% (140 mL) e agitare a -2 °C per 3 ore.
NOTA: A seconda della temperatura della reazione di nitrazione, si verificherà la sostituzione ipso della frazione formilica. - Filtrare la miscela (~9,0 g) con 200 ml di acqua a 0 °C, quindi purificarla in DMF per precipitare un prodotto solido.
- Idrolizzare il prodotto solido in acido trifluoroacetico (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 mL) a 90 °C e asciugare. Rimuovere il solvente sotto 80 kPa per ottenere il prodotto intermedio finale, una polvere secca giallo pallido.
- Sciogliere il prodotto intermedio (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) in tetraidrofurano (THF)/etanolo, 1:1 v/v (100 mL). Quindi aggiungere 1,43 g di NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) lentamente a 0 °C. Dopo 3 ore, rimuovere tutti i solventi sotto vuoto e sospendere il residuo in una soluzione di acqua 1:1 e diclorometano (50 ml ciascuno).
- Preparare il diclorometano per estrarre il prodotto dallo strato acquoso. Rimuovere lo strato organico e asciugare sul solfato di magnesio.
- Purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando DCM/MeOH in rapporto 10:1 (1% TEA). Infine, ottenere 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) di polvere giallastra relativamente pura NB-COOH.
3. Sintesi della gelatina-NB
- Preparare 5 g di gelatina per un lotto di modifica. Preparare una soluzione omogenea di gelatina sciogliendo 5 g di gelatina in 100 ml di acqua deionizzata e conservare a 37 °C.
NOTA: Qui sono definiti i gruppi originali 33 x 10-5 moli ε-ammino /g gelatina11 . - Definire il rapporto di alimentazione (FR) come il rapporto molare tra i gruppi NB e i gruppi amminici primari nella gelatina. In questo studio, 53 mg di NB con 1 g di gelatina sono stati definiti come FRNB = 1.
- Sciogliere 1.060 mg di NB-COOH in 5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per attivare i gruppi carbossilici di NB-COOH. Poiché il gruppo NB è sensibile alla luce ultravioletta (UV) quando è in soluzione, tenerlo sempre lontano dalla luce.
- Aggiungere 746 mg di 1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodimide cloridrato (EDC) nella soluzione di NB-COOH DMSO e agitare per 5 minuti. Dopo che l'EDC si è sciolto, aggiungere 448 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) e mescolare per 5 minuti.
- Utilizzare un imbuto gocciolante per far cadere lentamente la miscela ad una velocità di 0,5 ml/min nella soluzione di gelatina disciolta agitando vigorosamente per reagire a 45 °C per 4 ore.
4. Purificazione e conservazione del prodotto
- Dializzare la soluzione di gelatina-NB contro l'acqua deionizzata in eccesso per almeno 3 giorni, quindi raccoglierla, congelarla e liofilizzarla per ottenere le schiume gelatina-NB. Tenere le schiume in un essiccatore al buio per un ulteriore utilizzo.
- Sciogliere le schiume di gelatina NB liofilizzate in acqua deionizzata a 37 °C, immediatamente prima dell'uso.
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Representative Results
La figura 2A mostra uno schema delle principali reazioni chimiche coinvolte nella sintesi della gelatina-NB, che promuove l'integrazione tissutale innestando gruppi NB sulla gelatina. La figura 2B mostra che l'O-nitrobenzene dell'idrogel gelatina-NB si converte in un gruppo NB immediatamente dopo l'irradiazione UV, e quindi il gruppo aldeide attivo può essere reticolato con un gruppo amminico per formare una base di Schiff. La figura 2C indica che diversi rapporti di gruppi NB possono portare a diverse strutture reticolate di gelatina-NB.
Allo stesso tempo, è stata condotta anche una caratterizzazione preliminare delle proprietà fisiche della gelatina-NB. Come mostrato nella Figura 3, la gelatina-NB ha una forte gelificazione quando il rapporto di alimentazione (FR) di NB è basso. Ciò significa che la gelatina-NB con basso FR forma un idrogel morbido a causa della presenza di un gran numero di gruppi amminici che possono reagire con gruppi aldeidici fotogenerati, mentre la gelatina-NB con FR elevato può mantenere una goccia flessibile. Abbiamo anche osservato che la morfologia complessiva della gelatina-NB aderisce stabilmente alla superficie corneale mediante microscopia elettronica a scansione (SEM), come mostrato in Figura 3C. Tuttavia, una superficie corneale danneggiata trattata con nulla o gelatina sembra essere liscia. La figura 3D mostra che la gelatina-NB marcata con fluorescenza ha la capacità di aderire al tessuto intestinale e formare un rivestimento denso. Tuttavia, l'intensità della fluorescenza del gruppo gelatina è molto debole, indicando che non riesce ad aderire saldamente alla parete intestinale. La figura 3E mostra che sia la gelatina che la gelatina-NB sono inizialmente in grado di aderire alla piastra aminata. Tuttavia, dopo aver versato la soluzione salina tamponata fosfato (PBS) nella piastra aminata e cambiandola ogni 4 ore per 24 ore, solo la gelatina-NB mantiene una forte fluorescenza, indicando che aderisce fortemente. Questi risultati indicano che la gelatina-NB può aderire alla superficie del tessuto per formare uno strato denso uniforme e stabile. Come mostrato nella Figura 3F, gli spettri di una superficie corneale e di una superficie trattata con gelatina sono quasi gli stessi. Tuttavia, nel gruppo trattato con gelatina-NB, c'è un picco extra che appare a 400 eV, indicando la formazione di molti legami C = N nel tessuto dopo il trattamento con gelatina-NB attivata dai raggi UV12.
Figura 1: Fasi della reazione di sintesi NB-COOH. La figura fornisce una rappresentazione schematica della reazione di sintesi Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Progettazione e sintesi della gelatina-NB. (A) Schema della reazione chimica per la formazione della gelatina-NB. (B) Diagramma schematico che illustra la trasformazione della struttura chimica fotoinnescata dell'idrogel gelatinoso-NB. L'O-nitrobenzene viene convertito in gruppi NB in esposizione ai raggi UV. Quindi il gruppo aldeidico attivo potrebbe successivamente reticolarsi con gruppi amminici per formare basi di Schiff. (C) Schema dell'idrogel che forma gelatina-NB e del rivestimento in diversi rapporti di alimentazione. Questa cifra è stata modificata da12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione della gelatina-NB. (A) Le diverse prestazioni gelificanti della gelatina-NB con vari rapporti di alimentazione di NB. (1-4) rappresentano rispettivamente 0,5, 1, 2 e 4 NB rapporti di alimentazione della gelatina-NB. (B) Vista grossolana della soluzione modificata di gelatina-NB inattivata e della soluzione di gelatina-NB dopo illuminazione UV. (C) Immagini SEM della superficie corneale lesa, gelatina e superficie corneale trattata con rivestimento proteico gelatina-NB-4. Barre scala: 30 μm (pannelli superiori); 40 μm (pannelli inferiori, ingranditi). (D) Immagini di fluorescenza della superficie del colon dei topi marcata da gelatina e rivestimento molecolare di gelatina-NB. Barre di scala: 200 μm. (E) Immagini di fluorescenza della gelatina marcata e delle piastre aminate trattate con rivestimento molecolare di gelatina NB a 0 h e 24 h. Barre della scala: 20 μm. (F) Spettroscopia di fotoni a raggi X (XPS) del legame della gelatina-NB-4 al tessuto. Le energie di legame del peptide -C-NH- e del gruppo amminico C-NH2 che si spostano a causa della comparsa di un picco di legame C = N rivelano la formazione indotta dai raggi UV delle basi di Schiff. Questa cifra è stata modificata da5 e12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I materiali adesivi sono una nuova classe di materiali. Sempre più ricercatori sono impegnati nella sintesi di vari tipi di materiali adesivi e stanno cercando di trovare le loro applicazioni in biotecnologia, ingegneria tissutale, medicina rigenerativa e altri campi, che ha portato a un vigoroso sviluppo negli ultimi anni. Oltre a concentrarsi sulla forte adesione dei materiali adesivi, i ricercatori stanno anche prestando maggiore attenzione ad altre proprietà, come l'iniettabilità, l'auto-guarigione, l'emostatico, l'antibatterico, la rimozione controllata e così via13. Queste nuove applicazioni ampliano notevolmente l'ambito di applicazione dei materiali adesivi con prospettive applicative promettenti.
In questo articolo, è stato introdotto il metodo di sintesi di una nuova gelatina idrogel-NB. La gelatina-NB ha una forte adesione e si dice che possa essere applicata alla riparazione di lesioni corneali e lesioni intestinali nella pratica clinica 5,12. Pertanto, è di grande valore accademico e applicativo divulgare il metodo di preparazione della gelatina-NB.
Il passo chiave per preparare la gelatina-NB è il processo di sintesi. Proponiamo il concetto di rapporto di alimentazione (FR), che è il rapporto molare tra il gruppo NB e il gruppo amminico primario nella gelatina. Il FR per sintetizzare la gelatina-NB non è una costante e può essere regolato in base alla natura dell'interfaccia tissutale aderente. Per le cornee di coniglio, il FR del collirio gelatina-NB è FRNB = 2, mentre il numero di gruppi amminici sulla superficie dei due punti di topo è relativamente alto12; FRNB = 2 dimostra di non essere il FR ottimale per questo, e di solito deve essere aumentato a circa 4 per ottenere l'effetto di adesione ottimale. Quando si sintetizza la gelatina-NB in diversi scenari applicativi, è necessario impostare un gradiente FR pre-esperimento per esplorare il miglior effetto di adesione. Inoltre, abbiamo menzionato nell'articolo che NB deve essere tenuto lontano dalla luce UV in ogni momento, perché i gruppi NB sono molto sensibili ai raggi UV; suggeriamo di evitare il più possibile tutte le sorgenti di luce diretta durante il processo di sintesi, per ridurre al minimo l'impatto della luce UV sui gruppi NB.
Allo stesso tempo, questa tecnologia di sintesi ha alcune limitazioni. Ad esempio, la bassa resa dei prodotti grezzi porta alla necessità di un maggiore consumo di materie prime. Stiamo cercando di modificare varie condizioni di reazione per migliorare la resa, come la regolazione della temperatura di reazione e l'ulteriore estensione del tempo di reazione. Aggiorneremo i progressi della ricerca in tempo. I ricercatori possono fare riferimento al video per migliorare la strategia di preparazione della gelatina o-nitrosobenzaldeide o modificare ulteriormente il gruppo su questa base per soddisfare ulteriori esigenze biomediche. Riteniamo che il metodo di sintesi della gelatina o-nitrosobenzaldeide descritto in questo articolo accelererà lo sviluppo della medicina biosintetica e rigenerativa. Inoltre, la gelatina-NB dovrebbe essere ulteriormente applicata in casi clinici critici, come sanguinamento causato da danno vascolare acuto, rottura del fegato e della milza e perforazione gastrica in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
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