Summary
O protocolo aqui apresentado mostra a síntese de um forte hidrogel adesivo gelatina o-nitrosobenzaldeído (gelatina-NB). A gelatina-RN tem uma capacidade de adesão tecidual rápida e eficiente, que pode formar uma forte barreira física para proteger as superfícies das feridas, por isso espera-se que seja aplicada no campo da biotecnologia de reparação de lesões.
Abstract
Os materiais adesivos tornaram-se biomateriais populares no campo da engenharia biomédica e de tecidos. Em nosso trabalho anterior, apresentamos um novo material - gelatina o-nitrosobenzaldeído (gelatina-NB) - que é utilizado principalmente para regeneração tecidual e foi validado em modelos animais de lesão corneana e doença inflamatória intestinal. Este é um novo hidrogel formado pela modificação da gelatina biológica com o-nitrosobenzaldeído (NB). A gelatina-RN foi sintetizada ativando-se o grupo carboxila do NB-COOH e reagindo com gelatina através do cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). O composto obtido foi purificado para gerar o produto final, que pode ser armazenado de forma estável por pelo menos 18 meses. O RN tem uma forte adesão ao -NH2 no tecido, o que pode formar muitas ligações C = N, aumentando assim a adesão da gelatina-RN à interface tecidual. O processo de preparação compreende etapas para a síntese do grupo NB-COOH, modificação do grupo, síntese de gelatina-NB e purificação do composto. O objetivo é descrever detalhadamente o processo específico de síntese de gelatina-RN e demonstrar a aplicação de gelatina-NB na reparação de danos. Além disso, o protocolo é apresentado para fortalecer e expandir ainda mais a natureza do material produzido pela comunidade científica para cenários mais aplicáveis.
Introduction
O hidrogel é um tipo de polímero tridimensional formado pelo inchaço da água. Em particular, o hidrogel derivado de uma matriz extracelular é amplamente utilizado no campo da biossíntese e da medicina regenerativa devido à sua excelente biocompatibilidade e eficácia terapêutica1. Hidrogéis têm sido relatados para o tratamento de úlceras gástricas, neurite, infarto do miocárdio 2,3,4 e outras doenças. Além disso, tem sido comprovado que a gelatina-RN pode promover o desfecho da inflamação da doença inflamatória intestinal (DII)5. Os hidrogéis tradicionais incluem goma gelana, gelatina, ácido hialurônico, polietilenoglicol (PEG), em camadas, hidrofóbicos/hidrofílicos, alginato/poliacrilamida, rede dupla e hidrogéis polianfotéricos6, todos com boa histocompatibilidade e propriedades mecânicas. No entanto, esses hidrogéis tradicionais são vulneráveis à umidade e ao ar no ambiente. Se eles são expostos ao ar por um longo tempo, eles vão perder água e secar; se estiverem imersos na água por um longo tempo, absorverão água e se expandirão7, reduzindo assim sua flexibilidade e função mecânica. Além disso, manter a adesão tecidual dos hidrogéis convencionais é um grande desafio8.
Com base nisso, projetamos e sintetizamos um hidrogel gelatina-NB em nanoescala, que é um novo hidrogel formado pela modificação da gelatina biológica com NB (Figura 1). O RN tem uma forte capacidade de adesão a -NH2 no tecido, o que pode formar um grande número de ligações C = N, aumentando assim a adesividade da interface hidrogel-tecido. Esta forte adesão pode fazer com que o hidrogel adera firmemente à superfície do tecido, formando assim um revestimento molecular de nível nano. Em estudos anteriores da equipe, foi confirmado que esse tipo de revestimento de hidrogel modificado melhorou a adesão tecidual9; pode aderir de forma estável aos órgãos e tecidos da córnea e intestinal e desempenhar papéis anti-inflamatórios, isolamento de barreira e promoção da regeneração. O objetivo é apresentar o processo específico de síntese de gelatina-RN em detalhes aqui, para que a gelatina-NB possa ser aplicada em mais cenários de reparação de danos. Além disso, incentivamos outros pesquisadores a fortalecer e expandir ainda mais a natureza desse material para atender a mais cenários de aplicação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os ratos C57BL/6 foram comprados da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, Sir Run Run Shaw Hospital. Os coelhos da Nova Zelândia foram comprados da Universidade de Zhejiang. Os animais foram mantidos em condições naturais do ciclo claro-escuro e receberam comida e água potável livremente. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados eticamente pelas diretrizes institucionais das diretrizes padrão do Comitê de Ética da Universidade de Zhejiang (ZJU20200156) e do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Sir Run Run Shaw da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, que se conformaram ao Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (SRRSH202107106).
1. Síntese do NB-COOH
- Preparar 4-hidroxi-3-(metoxi-D3) benzaldeído (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalentes [eq.]), carbonato de potássio (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) e 4-bromobutatrato de metila (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) com base no protocolo proposto no estudo anterior10. Dissolver os compostos em 40 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) e agitar à temperatura ambiente por 16 h.
- Adicionar 200 ml de água a 0 °C à mistura e precipitá-la para obter um produto bruto.
- Dissolva repetidamente o produto bruto em DMF e, em seguida, precipite por cinco ciclos. Precipitar o produto bruto e secá-lo a 80 °C durante 2 h para obter o produto inicial.
2. Modificação e processamento de produtos químicos
- Efectuar a substituição ipso do éster metílico do ácido butanoico metil 4-(4-formil-2-metoxifenoxifenil) conforme descrito abaixo.
- Adicionar 9,4 g de butanoato de metil 4-(4-formil-2-metoxifenoxi) (37,3 mM, 1 eq.) lentamente a uma solução pré-resfriada (-2 °C) de ácido nítrico a 70% (140 mL) e agitar a -2 °C por 3 h.
NOTA: Dependendo da temperatura da reação de nitração, a substituição ipso da porção formila ocorrerá. - Filtrar a mistura (~9,0 g) com 200 ml de água a 0 °C e, em seguida, purificá-la em DMF para precipitar um produto sólido.
- Hidrolisar o produto sólido em ácido trifluoroacético (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) a 90 °C e secar. Retirar o solvente com menos de 80 kPa para obter o produto intermédio final, um pó seco amarelo-pálido.
- Dissolver o produto intermédio (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) em tetraidrofurano (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 ml). Em seguida, adicionar 1,43 g de NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) lentamente a 0 °C. Após 3 h, retirar todos os solventes sob vácuo e suspender o resíduo numa solução de água e diclorometano 1:1 (50 ml cada).
- Prepare o diclorometano para extrair o produto da camada aquosa. Remova a camada orgânica e seque sobre sulfato de magnésio.
- Purificar o produto bruto por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando DCM/MeOH numa proporção de 10:1 (1% de TEA). Finalmente, obtenha-se 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) de pó amarelado relativamente puro NB-COOH.
3. Síntese de gelatina-NB
- Preparar 5 g de gelatina para um lote de modificação. Preparar uma solução de gelatina homogénea dissolvendo 5 g de gelatina em 100 ml de água deionizada e conservar a 37 °C.
NOTA: Aqui, os 33 x 10-5 moles originais ε-amino groups/g gelatina11 são definidos. - Definir a razão alimentar (FR) como a razão molar entre os grupos RN e os grupos amino primários da gelatina. Neste estudo, 53 mg de RN com 1 g de gelatina foram definidos como FRNB = 1.
- Dissolver 1.060 mg de NB-COOH em 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para ativar os grupos carboxila de NB-COOH. Como o grupo NB é sensível à luz ultravioleta (UV) quando em solução, mantenha-o sempre longe da luz.
- Adicionar 746 mg de cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida (EDC) à solução de NB-COOH DMSO e agitar durante 5 minutos. Após a dissolução do EDC, adicione 448 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) e mexa por 5 min.
- Utilizar uma ampola de gota para soltar lentamente a mistura a uma velocidade de 0,5 ml/min na solução de gelatina dissolvida com agitação vigorosa para reagir a 45 °C durante 4 h.
4. Purificação e armazenamento do produto
- Dialisar a solução de gelatina-NB contra o excesso de água desionizada por pelo menos 3 dias, em seguida, coletar, congelar e liofilizar para obter as espumas de gelatina-NB. Mantenha as espumas em um exsicador no escuro para uso posterior.
- Dissolver as espumas de gelatina-NB liofilizadas em água desionizada a 37 °C, imediatamente antes da utilização.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 2A mostra um esquema das principais reações químicas envolvidas na síntese de gelatina-RN, que promove a integração tecidual por enxertia de grupos RN em gelatina. A Figura 2B mostra que o O-nitrobenzeno do hidrogel gelatina-NB se converte em um grupo NB imediatamente após a irradiação UV e, em seguida, o grupo aldeído ativo pode ser reticulado com um grupo amino para formar uma base de Schiff. A Figura 2C indica que diferentes proporções de grupos RN podem levar a diferentes estruturas reticuladas de gelatina-RN.
Ao mesmo tempo, também foi realizada uma caracterização preliminar das propriedades físicas da gelatina-RN. Como mostra a Figura 3, a gelatina-RN apresenta forte gelificação quando a razão alimentar (FR) do RN é baixa. Isso significa que a gelatina-NB com baixo FR forma um hidrogel macio devido à presença de um grande número de grupos amino que podem reagir com grupos aldeídos fotogerados, enquanto a gelatina-NB com alta FR pode manter uma gotícula flexível. Observamos também que a morfologia geral da gelatina-RN adere de forma estável à superfície da córnea por microscopia eletrônica de varredura (MEV), como mostra a Figura 3C. No entanto, uma superfície corneana lesionada tratada com nada ou gelatina parece ser lisa. A Figura 3D mostra que a gelatina-RN marcada fluorescentemente tem a capacidade de aderir ao tecido intestinal e formar um revestimento denso. No entanto, a intensidade de fluorescência do grupo gelatina é muito fraca, indicando que ele não adere firmemente à parede intestinal. A Figura 3E mostra que tanto a gelatina quanto a gelatina-RN são inicialmente capazes de aderir à placa aminada. No entanto, depois de despejar solução salina tamponada com fosfato (PBS) na placa aminada e trocá-la a cada 4 h por 24 h, apenas a gelatina-NB mantém uma forte fluorescência, indicando que adere fortemente. Esses resultados indicam que a gelatina-RN pode aderir à superfície do tecido para formar uma camada densa uniforme e estável. Como mostrado na Figura 3F, os espectros de uma superfície da córnea e de uma superfície tratada com gelatina são quase os mesmos. No entanto, no grupo tratado com gelatina-RN, há um pico extra aparecendo a 400 eV, indicando a formação de muitas ligações C = N no tecido após o tratamento com gelatina ativada por UV-NB12.
Figura 1: Etapas da reação de síntese NB-COOH. A figura fornece uma representação esquemática da reação de síntese Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Desenho e síntese de gelatina-NB. (A) Esquema da reação química para formação de gelatina-NB. (B) Diagrama esquemático ilustrando a transformação da estrutura química foto-desencadeada do hidrogel gelatina-NB. O O-nitrobenzeno é convertido em grupos NB sob exposição UV. Em seguida, o grupo aldeído ativo poderia posteriormente cruzar com grupos amino para formar bases de Schiff. (C) Esquema do hidrogel formador de gelatina-NB e revestimento sob diferentes proporções de alimentação. Este número foi modificado de12. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização da gelatina-NB. (A) O desempenho variado de gelificação da gelatina-NB com várias razões de alimentação de NB. (1-4) representam as razões de alimentação de 0,5, 1, 2 e 4 NB de gelatina-NB, respectivamente. (B) Vista grosseira da solução de gelatina-NB modificada inactivada e da solução de gelatina-NB após iluminação UV. (C) Imagens de MEV da superfície corneana lesada, gelatina e superfície corneana tratada com revestimento de proteína gelatina-NB-4. Barras de escala: 30 μm (painéis superiores); 40 μm (painéis inferiores, ampliados). (D) Imagens de fluorescência da superfície colônica de camundongos marcadas por gelatina e revestimento molecular gelatina-NB. Barras de escala: 200 μm. (E) Imagens de fluorescência das placas aminadas, tratadas com revestimento molecular de gelatina e gelatina NB marcadas, às 0 h e 24 h. Barras de escala: 20 μm. (F) Espectroscopia de fótons de raios-X (XPS) de ligação gelatina-NB-4 ao tecido. As energias de ligação do peptídeo -C-NH- e do grupo aminoamina C-NH2 que se deslocam devido ao aparecimento de um pico de ligação C = N revela a formação induzida por UV de bases de Schiff. Este valor foi modificado de5 e12. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os materiais adesivos são uma nova classe de materiais. Mais e mais pesquisadores estão comprometidos com a síntese de vários tipos de materiais adesivos e estão tentando encontrar suas aplicações em biotecnologia, engenharia de tecidos, medicina regenerativa e outros campos, o que levou a um desenvolvimento vigoroso nos últimos anos. Além de se concentrar na forte adesão de materiais adesivos, os pesquisadores também estão prestando mais atenção a outras propriedades, como injetabilidade, autocicatrização, hemostática, antibacteriana, remoção controlada e assim por diante13. Essas novas aplicações expandem muito o escopo de aplicação de materiais adesivos com perspectivas promissoras de aplicação.
Neste trabalho, foi introduzido o método de síntese de um novo hidrogel gelatina-NB. A gelatina-RN tem forte adesão, e é relatado que pode ser aplicada no reparo de lesão corneana e intestinal na prática clínica 5,12. Portanto, é de grande valor acadêmico e de aplicação popularizar o método de preparo da gelatina-NB.
O passo fundamental para o preparo da gelatina-RN é o processo de síntese. Propomos o conceito de razão alimentar (FR), que é a razão molar entre o grupo RN e o grupo amino primário da gelatina. O FR para sintetizar gelatina-RN não é uma constante e pode ser ajustado de acordo com a natureza da interface tecidual aderente. Para as córneas de coelho, o FR dos colírios gelatina-NB é FRNB = 2, enquanto o número de grupos amino na superfície dos cólons dos ratos é relativamente alto12; FRNB = 2 prova não ser o FR ideal para isso, e geralmente precisa ser aumentado para cerca de 4 para alcançar o efeito de adesão ideal. Ao sintetizar gelatina-RN em diferentes cenários de aplicação, é necessário definir um gradiente FR pré-experimento para explorar o melhor efeito de adesão. Além disso, mencionamos no artigo que os RN precisam ser mantidos longe da luz UV em todos os momentos, pois os grupos RN são muito sensíveis aos UV; sugerimos evitar todas as fontes de luz diretas, tanto quanto possível, durante o processo de síntese, para minimizar o impacto da luz UV nos grupos RN.
Ao mesmo tempo, essa tecnologia de síntese tem algumas limitações. Por exemplo, o baixo rendimento dos produtos brutos leva à necessidade de um maior consumo de matérias-primas. Estamos tentando mudar várias condições de reação para melhorar o rendimento, como ajustar a temperatura de reação e estender ainda mais o tempo de reação. Atualizaremos o progresso da pesquisa a tempo. Os pesquisadores podem consultar o vídeo para melhorar a estratégia de preparação de gelatina o-nitrosobenzaldeído ou modificar ainda mais o grupo nesta base para atender a outras necessidades biomédicas. Acreditamos que o método de síntese de gelatina o-nitrosobenzaldeído descrito neste artigo irá acelerar o desenvolvimento da medicina biossintética e regenerativa. Além disso, espera-se que a gelatina-RN seja aplicada em casos clínicos críticos, como sangramento causado por lesão vascular aguda, ruptura do fígado e do baço e perfuração gástrica no futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
