Summary
El protocolo presentado aquí muestra la síntesis de un fuerte adhesivo de gelatina de hidrogel o-nitrosobenzaldehído (gelatina-NB). La gelatina-NB tiene una capacidad de adhesión tisular rápida y eficiente, que puede formar una fuerte barrera física para proteger las superficies de las heridas, por lo que se espera que se aplique al campo de la biotecnología de reparación de lesiones.
Abstract
Los materiales adhesivos se han convertido en biomateriales populares en el campo de la ingeniería biomédica y de tejidos. En nuestro trabajo anterior, presentamos un nuevo material, gelatina o-nitrosobenzaldehído (gelatina-NB), que se utiliza principalmente para la regeneración de tejidos y ha sido validado en modelos animales de lesión corneal y enfermedad inflamatoria intestinal. Se trata de un nuevo hidrogel formado modificando la gelatina biológica con o-nitrosobenzaldehído (NB). La gelatina-NB se sintetizó activando el grupo carboxilo de NB-COOH y reaccionando con gelatina a través de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). El compuesto obtenido se purificó para generar el producto final, que puede almacenarse de manera estable durante al menos 18 meses. NB tiene una fuerte adhesión a -NH2 en el tejido, que puede formar muchos enlaces C = N, aumentando así la adhesión de gelatina-NB a la interfaz tisular. El proceso de preparación comprende pasos para la síntesis del grupo NB-COOH, modificación del grupo, síntesis de gelatina-NB y purificación del compuesto. El objetivo es describir el proceso de síntesis específico de gelatina-NB en detalle y demostrar la aplicación de gelatina-NB para la reparación de daños. Además, el protocolo se presenta para fortalecer y ampliar aún más la naturaleza del material producido por la comunidad científica para escenarios más aplicables.
Introduction
El hidrogel es un tipo de polímero tridimensional formado por la hinchazón del agua. En particular, el hidrogel derivado de una matriz extracelular es ampliamente utilizado en el campo de la biosíntesis y la medicina regenerativa debido a su excelente biocompatibilidad y efectividad terapéutica1. Se han notificado hidrogeles para el tratamiento de úlceras gástricas, neuritis, infarto de miocardio 2,3,4 y otras enfermedades. Además, se ha demostrado que la gelatina-NB puede promover el resultado de la inflamación en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)5. Los hidrogeles tradicionales incluyen goma gellan, gelatina, ácido hialurónico, polietilenglicol (PEG), en capas, hidrofóbicos / hidrófilos, alginato / poliacrilamida, doble red e hidrogeles polianfóteros6, todos los cuales tienen buenas propiedades histométricas y de histocompatibilidad. Sin embargo, estos hidrogeles tradicionales son vulnerables a la humedad y al aire en el medio ambiente. Si están expuestos al aire durante mucho tiempo, perderán agua y se secarán; Si se sumergen en el agua durante mucho tiempo, absorberán agua y se expandirán7, reduciendo así su flexibilidad y función mecánica. Además, mantener la adhesión tisular de los hidrogeles convencionales es un gran desafío8.
En base a esto, diseñamos y sintetizamos un hidrogel a nanoescala gelatina-NB, que es un nuevo hidrogel formado modificando la gelatina biológica con NB (Figura 1). NB tiene una fuerte capacidad de adhesión a -NH2 en el tejido, que puede formar un gran número de enlaces C = N, aumentando así la adhesividad de la interfaz hidrogel-tejido. Esta fuerte adhesión puede hacer que el hidrogel se adhiera firmemente a la superficie del tejido, formando así un recubrimiento molecular de nivel nanométrico. En estudios previos del equipo, se ha confirmado que este tipo de recubrimiento de hidrogel modificado ha mejorado la adhesión tisular9; Puede adherirse de manera estable a los órganos y tejidos corneales e intestinales y desempeñar funciones antiinflamatorias, aislamiento de barrera y promoción de la regeneración. El objetivo es introducir el proceso de síntesis específico de gelatina-NB en detalle aquí, para que la gelatina-NB se pueda aplicar en más escenarios de reparación de daños. Además, alentamos a otros investigadores a fortalecer y ampliar aún más la naturaleza de este material para adaptarse a más escenarios de aplicación.
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Protocol
Los ratones C57BL / 6 fueron comprados en el Hospital Sir Run Run Shaw de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Los conejos de Nueva Zelanda fueron comprados a la Universidad de Zhejiang. Los animales fueron mantenidos en condiciones naturales de ciclo de luz-oscuridad y se les dio comida y agua potable libremente. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados éticamente por las directrices institucionales de las directrices estándar del Comité de Ética de la Universidad de Zhejiang (ZJU20200156) y el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Sir Run Run Shaw de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, que se ajustaron a la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (SRRSH202107106).
1. Síntesis de NB-COOH
- Preparar el 4-hidroxi-3-(metoxi-D3) benzaldehído (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalentes [ec.]), carbonato de potasio (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) y metil 4-bromobutirato (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) con base en el protocolo propuesto en el estudio anterior10. Disolver los compuestos en 40 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) y agitar a temperatura ambiente durante 16 h.
- Añadir 200 mL de agua a 0 °C a la mezcla y precipitar la mezcla para obtener un producto crudo.
- Disuelva repetidamente el producto crudo en DMF y luego precipite durante cinco ciclos. Precipitar el producto crudo y secarlo a 80 °C durante 2 h para obtener el producto temprano.
2. Modificación química y procesamiento
- Realizar la sustitución ipso del éster metílico del ácido butanoico 4-(4-formil-2-metoxifenoxi metoxifenil) butanoico como se describe a continuación.
- Añadir 9,4 g de butanoato de metilo 4-(4-formil-2-metoxifenoxi) butanoato (37,3 mM, 1 eq.) lentamente a una solución preenfriada (-2 °C) de ácido nítrico al 70% (140 ml) y agitar a -2 °C durante 3 h.
NOTA: Dependiendo de la temperatura de la reacción de nitración, se producirá la sustitución ipso de la fracción formilo. - Filtrar la mezcla (~9.0 g) con 200 mL de agua a 0 °C, luego purificarla en DMF para precipitar un producto sólido.
- Hidrolizar el producto sólido en ácido trifluoroacético (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) a 90 °C y seco. Eliminar el disolvente por debajo de 80 kPa para obtener el producto intermedio final, un polvo seco de color amarillo pálido.
- Disolver el producto intermedio (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) en tetrahidrofurano (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 ml). A continuación, añadir 1,43 g de NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) lentamente a 0 °C. Después de 3 h, eliminar todos los disolventes al vacío y suspender el residuo en una solución 1:1 de agua y diclorometano (50 ml cada uno).
- Preparar diclorometano para extraer el producto de la capa acuosa. Retire la capa orgánica y seque sobre sulfato de magnesio.
- Purificar el producto crudo mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando DCM/MeOH en una proporción de 10:1 (1% TEA). Finalmente, obtenga 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) de polvo amarillento relativamente puro NB-COOH.
3. Síntesis de gelatina-NB
- Prepare 5 g de gelatina para un lote de modificación. Preparar una solución de gelatina homogénea disolviendo 5 g de gelatina en 100 ml de agua desionizada y almacenar a 37 °C.
NOTA: Aquí se definen los 33 x 10-5 moles originales ε grupos amino / g de gelatina11 . - Defina la relación de alimentación (FR) como la relación molar entre los grupos NB y los grupos amino primarios en la gelatina. En este estudio, 53 mg de NB con 1 g de gelatina se definieron como FRNB = 1.
- Disuelva 1,060 mg de NB-COOH en 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para activar los grupos carboxilo de NB-COOH. Dado que el grupo NB es sensible a la luz ultravioleta (UV) cuando está en solución, manténgalo siempre alejado de la luz.
- Agregue 746 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida (EDC) en la solución NB-COOH DMSO y revuelva durante 5 min. Después de que la EDC se haya disuelto, agregue 448 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) y revuelva durante 5 minutos.
- Utilice un embudo de goteo para dejar caer lentamente la mezcla a una velocidad de 0,5 ml / min en la solución de gelatina disuelta con agitación vigorosa para reaccionar a 45 ° C durante 4 h.
4. Purificación y almacenamiento del producto
- Dialice la solución de gelatina-NB contra el exceso de agua desionizada durante al menos 3 días, luego recoja, congele y liofilifícela para obtener las espumas de gelatina-NB. Mantenga las espumas en un desecador en la oscuridad para su uso posterior.
- Disuelva las espumas de gelatina-NB liofilizadas en agua desionizada a 37 °C, inmediatamente antes de su uso.
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Representative Results
La Figura 2A muestra un esquema de las principales reacciones químicas involucradas en la síntesis de gelatina-NB, que promueve la integración tisular mediante el injerto de grupos NB en gelatina. La Figura 2B muestra que el O-nitrobenceno del hidrogel de gelatina-NB se convierte en un grupo NB inmediatamente después de la irradiación UV, y luego el grupo aldehído activo puede ser reticulado con un grupo amino para formar una base de Schiff. La Figura 2C indica que diferentes proporciones de grupos NB pueden conducir a diferentes estructuras reticuladas de gelatina-NB.
Al mismo tiempo, también se realizó una caracterización preliminar de las propiedades físicas de la gelatina-NB. Como se muestra en la Figura 3, la gelatina-NB tiene una fuerte gelificación cuando la relación de alimentación (FR) de NB es baja. Esto significa que la gelatina-NB con bajo FR forma un hidrogel blando debido a la presencia de un gran número de grupos amino que pueden reaccionar con grupos aldehído fotogenerados, mientras que la gelatina-NB con FR alto puede mantener una gota flexible. También observamos que la morfología general de la gelatina-NB se adhiere de manera estable a la superficie corneal mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), como se muestra en la Figura 3C. Sin embargo, una superficie corneal lesionada tratada con nada o gelatina parece ser lisa. La Figura 3D muestra que la gelatina-NB marcada con fluorescencia tiene la capacidad de adherirse al tejido intestinal y formar una capa densa. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia del grupo gelatina es muy débil, lo que indica que no se adhiere firmemente a la pared intestinal. La Figura 3E muestra que tanto la gelatina como la gelatina-NB son inicialmente capaces de adherirse a la placa aminada. Sin embargo, después de verter solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa aminada y cambiarla cada 4 h durante 24 h, solo la gelatina-NB mantiene una fuerte fluorescencia, lo que indica que se adhiere fuertemente. Estos resultados indican que la gelatina-NB puede adherirse a la superficie del tejido para formar una capa densa uniforme y estable. Como se muestra en la Figura 3F, los espectros de una superficie corneal y una superficie tratada con gelatina son casi los mismos. Sin embargo, en el grupo tratado con gelatina-NB, hay un pico adicional que aparece a 400 eV, lo que indica la formación de muchos enlaces C = N en el tejido después del tratamiento con gelatina-NB12 activada por UV.
Figura 1: Pasos de la reacción de síntesis NB-COOH. La figura proporciona una representación esquemática de la reacción de síntesis Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño y síntesis de gelatina-NB. (A) Esquema de la reacción química para la formación de gelatina-NB. (B) Diagrama esquemático que ilustra la transformación de la estructura química fotoactivada del hidrogel de gelatina-NB. El O-nitrobenceno se convierte en grupos NB bajo exposición UV. Luego, el grupo aldehído activo podría posteriormente entrecruzarse con grupos amino para formar bases de Schiff. (C) Esquema de gelatina-NB formando hidrogel y recubrimiento bajo diferentes proporciones de alimentación. Esta cifra se ha modificado de12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de la gelatina-NB . (A) El rendimiento de gelificación variable de la gelatina-NB con varias relaciones de alimentación de NB. (1-4) representan relaciones de alimentación de 0.5, 1, 2 y 4 NB de gelatina-NB, respectivamente. (B) Vista macroscópica de la solución modificada de gelatina-NB inactivada y de la solución de gelatina-NB después de la iluminación UV. (C) Imágenes SEM de la superficie corneal lesionada, gelatina y superficie corneal tratada con recubrimiento de proteína gelatina-NB-4. Barras de escala: 30 μm (paneles superiores); 40 μm (paneles inferiores, ampliados). (D) Imágenes de fluorescencia de la superficie colónica de ratones marcadas por gelatina y recubrimiento molecular gelatina-NB. Barras de escala: 200 μm. (E) Imágenes de fluorescencia de la gelatina marcada y las placas aminadas tratadas con recubrimiento molecular de gelatina-NB a 0 h y 24 h. Barras de escala: 20 μm. (F) Espectroscopia de fotones de rayos X (XPS) de la gelatina-NB-4 que se une al tejido. Las energías de enlace del péptido -C-NH- y el grupo de aminoácidos C-NH2 que cambian debido a la aparición de un pico de enlace C = N revelan la formación inducida por UV de bases de Schiff. Esta cifra se ha modificado de5 a12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los materiales adhesivos son una nueva clase de material. Cada vez más investigadores están comprometidos con la síntesis de varios tipos de materiales adhesivos, y están tratando de encontrar sus aplicaciones en biotecnología, ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y otros campos, lo que ha llevado a un desarrollo vigoroso en los últimos años. Además de centrarse en la fuerte adhesión de los materiales adhesivos, los investigadores también están prestando más atención a otras propiedades, como la inyectabilidad, la autocuración, la hemostática, la antibacteriana, la eliminación controlada, etc.13. Estas nuevas aplicaciones amplían enormemente el alcance de aplicación de los materiales adhesivos con perspectivas de aplicación prometedoras.
En este artículo, se introdujo el método de síntesis de una nueva gelatina de hidrogel-NB. La gelatina-NB tiene fuerte adhesión, y se relata que puede ser aplicada a la reparación de la lesión corneal y la lesión intestinal en la práctica clínica 5,12. Por lo tanto, es de gran valor académico y de aplicación popularizar el método de preparación de gelatina-NB.
El paso clave para preparar gelatina-NB es el proceso de síntesis. Proponemos el concepto de relación de alimentación (FR), que es la relación molar entre el grupo NB y el grupo amino primario en la gelatina. El FR para sintetizar gelatina-NB no es una constante y se puede ajustar de acuerdo con la naturaleza de la interfaz tisular adherente. Para las córneas de conejo, el FR de las gotas oftálmicas de gelatina-NB es FRNB = 2, mientras que el número de grupos amino en la superficie de los dos puntos del ratón es relativamente alto12; FRNB = 2 demuestra no ser el FR óptimo para esto, y generalmente debe aumentarse a aproximadamente 4 para lograr el efecto de adhesión óptimo. Al sintetizar gelatina-NB en diferentes escenarios de aplicación, es necesario establecer un gradiente de FR previo al experimento para explorar el mejor efecto de adhesión. Además, mencionamos en el artículo que NB debe mantenerse alejado de la luz UV en todo momento, porque los grupos NB son muy sensibles a los UV; sugerimos evitar todas las fuentes de luz directa tanto como sea posible durante el proceso de síntesis, para minimizar el impacto de la luz UV en los grupos NB.
Al mismo tiempo, esta tecnología de síntesis tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, el bajo rendimiento de los productos crudos lleva a la necesidad de un mayor consumo de materias primas. Estamos tratando de cambiar varias condiciones de reacción para mejorar el rendimiento, como ajustar la temperatura de reacción y extender aún más el tiempo de reacción. Actualizaremos el progreso de la investigación a tiempo. Los investigadores pueden consultar el video para mejorar la estrategia de preparación de gelatina o-nitrosobenzaldehído o modificar aún más el grupo sobre esta base para satisfacer necesidades biomédicas adicionales. Creemos que el método de síntesis de gelatina o-nitrosobenzaldehído descrito en este trabajo acelerará el desarrollo de la medicina biosintética y regenerativa. Además, se espera que la gelatina-NB se aplique aún más en casos clínicos críticos, como sangrado causado por lesión vascular aguda, ruptura de hígado y bazo, y perforación gástrica en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
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