Summary
Protokollet som presenteras här visar syntesen av en stark adhesiv hydrogelgelatin o-nitrosobensaldehyd (gelatin-NB). Gelatin-NB har snabb och effektiv vävnadsvidhäftningsförmåga, som kan bilda en stark fysisk barriär för att skydda sårytor, så det förväntas tillämpas på området bioteknik för skadereparation.
Abstract
Limmaterial har blivit populära biomaterial inom biomedicinsk och vävnadsteknik. I vårt tidigare arbete presenterade vi ett nytt material - gelatin o-nitrosobenzaldehyd (gelatin-NB) - som huvudsakligen används för vävnadsregenerering och har validerats i djurmodeller av hornhinneskada och inflammatorisk tarmsjukdom. Detta är en ny hydrogel bildad genom modifiering av biologiskt gelatin med o-nitrosobensaldehyd (NB). Gelatin-NB syntetiserades genom att aktivera karboxylgruppen av NB-COOH och reagera med gelatin genom 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC) och N-hydroxisuccinimid (NHS). Den erhållna föreningen renades för att generera slutprodukten, som stabilt kan lagras i minst 18 månader. NB har en stark vidhäftning till -NH2 på vävnaden, vilket kan bilda många C = N-bindningar, vilket ökar vidhäftningen av gelatin-NB till vävnadsgränssnittet. Beredningsprocessen omfattar steg för syntes av NB-COOH-gruppen, modifiering av gruppen, syntes av gelatin-NB och rening av föreningen. Målet är att beskriva den specifika syntesprocessen för gelatin-NB i detalj och att demonstrera tillämpningen av gelatin-NB för att reparera skador. Dessutom presenteras protokollet för att ytterligare stärka och utöka karaktären hos det material som produceras av det vetenskapliga samfundet för mer tillämpliga scenarier.
Introduction
Hydrogel är en typ av tredimensionell polymer bildad av vattensvullnad. I synnerhet används hydrogel härrörande från en extracellulär matris i stor utsträckning inom biosyntes och regenerativ medicin på grund av dess utmärkta biokompatibilitet och terapeutiska effektivitet1. Hydrogeler har rapporterats för behandling av magsår, neurit, hjärtinfarkt 2,3,4 och andra sjukdomar. Vidare har det visat sig att gelatin-NB kan främja resultatet av inflammation i inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)5. Traditionella hydrogeler inkluderar gellangummi, gelatin, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), skiktad, hydrofob / hydrofil, alginat / polyakrylamid, dubbelnätverk och polyamfotera hydrogeler6, som alla har god histokompatibilitet och mekaniska egenskaper. Dessa traditionella hydrogeler är dock sårbara för fukt och luft i miljön. Om de utsätts för luft under lång tid kommer de att förlora vatten och torka; Om de är nedsänkta i vattnet under lång tid kommer de att absorbera vatten och expandera7, vilket minskar deras flexibilitet och mekaniska funktion. Dessutom är upprätthållandet av vävnadsvidhäftningen hos konventionella hydrogeler en stor utmaning8.
Baserat på detta designade och syntetiserade vi en nanoskala hydrogelgelatin-NB, som är en ny hydrogel bildad genom att modifiera biologiskt gelatin med NB (figur 1). NB har en stark vidhäftningsförmåga till -NH2 på vävnaden, vilket kan bilda ett stort antal C = N-bindningar, vilket ökar vidhäftningen av hydrogel-vävnadsgränssnittet. Denna starka vidhäftning kan göra att hydrogelen fäster fast vid vävnadsytan och därigenom bildar en molekylär beläggning på nanonivå. I lagets tidigare studier har det bekräftats att denna typ av modifierad hydrogelbeläggning har förbättrat vävnadsadhesion9; Det kan stabilt fästa vid hornhinnans och tarmorganens och vävnadernas organ och vävnader och spela antiinflammation, barriärisolering och regenereringsfrämjande roller. Målet är att introducera den specifika syntesprocessen för gelatin-NB i detalj här, så att gelatin-NB kan appliceras i fler scenarier för reparation av skador. Dessutom uppmuntrar vi andra forskare att ytterligare stärka och utöka materialets natur för att passa fler applikationsscenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL / 6-mössen köptes från Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. Nya Zeelands kaniner köptes från Zhejiang University. Djuren hölls i naturliga ljus-mörka cykelförhållanden och fick mat och dricksvatten fritt. Alla experimentella förfaranden godkändes etiskt av de institutionella riktlinjerna för Zhejiang University Ethics Committee standardriktlinjer (ZJU20200156) och Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, som överensstämde med NIH-guiden för vård och användning av laboratoriedjur (SRRSH202107106).
1. Syntes av NB-COOH
- Förbered 4-hydroxi-3-(metoxi-D3) bensaldehyd (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 ekvivalenter [ekv.]), kaliumkarbonat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 ekv.) och metyl-4-brombutyrat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 ekv.) baserat på det protokoll som föreslogs i föregående studie10. Lös föreningarna i 40 ml N, N-dimetylformamid (DMF) och rör om vid rumstemperatur i 16 timmar.
- Tillsätt 200 ml 0 °C vatten till blandningen och fäll ut blandningen så att en råprodukt erhålls.
- Lös upp råprodukten upprepade gånger i DMF och fäll sedan ut i fem cykler. Fäll ut råprodukten och torka den vid 80 °C i 2 timmar för att erhålla den tidiga produkten.
2. Kemisk modifiering och bearbetning
- Utför ipso-substitutionen av metyl 4-(4-formyl-2-metoxifenoximetoxifenyl) butansyrametylester enligt beskrivningen nedan.
- Tillsätt 9,4 g metyl-4-(4-formyl-2-metoxifenoxi)butanoat (37,3 mM, 1 ekv.) långsamt till en förkyld (-2 °C) lösning av 70 % salpetersyra (140 ml) och rör om vid -2 °C i 3 timmar.
OBS: Beroende på nitreringsreaktionens temperatur kommer ipso-substitutionen av formyldelen att ske. - Filtrera blandningen (~ 9,0 g) med 200 ml 0 ° C vatten och rena den sedan i DMF för att fälla ut en fast produkt.
- Hydrolysera den fasta produkten i trifluorättiksyra (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) vid 90 °C och torrt. Avlägsna lösningsmedlet under 80 kPa för att erhålla den slutliga mellanprodukten, ett torrt ljusgult pulver.
- Lös mellanprodukten (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 ekv.) i tetrahydrofuran (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 ml). Tillsätt sedan långsamt 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 ekv.) vid 0 °C. Efter 3 timmar, avlägsna alla lösningsmedel under vakuum och suspendera återstoden i en 1:1 vatten- och diklormetanlösning (50 ml vardera).
- Förbered diklormetan för att extrahera produkten från det vattenhaltiga skiktet. Ta bort det organiska skiktet och torka över magnesiumsulfat.
- Rena råprodukten genom kolonnkromatografi av kiselgel med DCM/MeOH i förhållandet 10:1 (1 % TEA). Slutligen erhålla 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) relativt rent gulaktigt pulver NB-COOH.
3. Syntes av gelatin-NB
- Förbered 5 g gelatin för en sats modifiering. Bered en homogen gelatinlösning genom att lösa 5 g gelatin i 100 ml avjoniserat vatten och förvara vid 37 °C.
OBS: Här definieras de ursprungliga 33 x 10-5 mol ε-aminogrupperna / g gelatin11 . - Definiera matningsförhållandet (FR) som molförhållandet mellan NB-grupper och primära aminogrupper i gelatin. I denna studie definierades 53 mg NB med 1 g gelatin som FRNB = 1.
- Lös 1 060 mg NB-COOH i 5 ml dimetylsulfoxid (DMSO) för att aktivera karboxylgrupperna i NB-COOH. Eftersom NB-gruppen är känslig för ultraviolett (UV) ljus i lösning, håll den alltid borta från ljus.
- Tillsätt 746 mg 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodimidhydroklorid (EDC) i NB-COOH DMSO-lösningen och rör om i 5 minuter. När EDC har lösts upp, tillsätt 448 mg N-hydroxisuccinimid (NHS) och rör om i 5 min.
- Använd en dropptratt för att långsamt släppa blandningen med en hastighet av 0,5 ml / min i den upplösta gelatinlösningen under kraftig omrörning för att reagera vid 45 ° C i 4 timmar.
4. Rening och lagring av produkten
- Dialysera gelatin-NB-lösningen mot överskott av avjoniserat vatten i minst 3 dagar, samla sedan, frys och frystorka den för att erhålla gelatin-NB-skum. Förvara skummet i exsickator i mörker för vidare användning.
- Lös upp det frystorkade gelatin-NB-skummet i avjoniserat vatten vid 37 °C omedelbart före användningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A visar en schematisk bild av de viktigaste kemiska reaktionerna som är involverade i syntesen av gelatin-NB, vilket främjar vävnadsintegration genom ympning av NB-grupper på gelatin. Figur 2B visar att O-nitrobensen i gelatin-NB-hydrogelen omvandlas till en NB-grupp omedelbart efter UV-bestrålning, och sedan kan den aktiva aldehydgruppen tvärbindas med en aminogrupp för att bilda en Schiff-bas. Figur 2C indikerar att olika förhållanden mellan NB-grupper kan leda till olika tvärbundna strukturer av gelatin-NB.
Samtidigt genomfördes också en preliminär karakterisering av de fysikaliska egenskaperna hos gelatin-NB. Som visas i figur 3 har gelatin-NB en stark gelering när matningsförhållandet (FR) för NB är lågt. Detta innebär att gelatin-NB med låg FR bildar en mjuk hydrogel på grund av närvaron av ett stort antal aminogrupper som kan reagera med fotogenererade aldehydgrupper, medan gelatin-NB med hög FR kan bibehålla en flexibel droppe. Vi observerade också att den övergripande morfologin hos gelatin-NB stabilt fäster vid hornhinnans yta genom svepelektronmikroskopi (SEM), som visas i figur 3C. En skadad hornhinneyta behandlad med ingenting eller gelatin verkar dock vara slät. Figur 3D visar att det fluorescerande märkta gelatin-NB har förmågan att fästa vid tarmvävnaden och bilda en tät beläggning. Fluorescensintensiteten hos gelatingruppen är emellertid mycket svag, vilket indikerar att den inte fäster fast vid tarmväggen. Figur 3E visar att både gelatin och gelatin-NB initialt kan fästa vid den aminerade plattan. Efter att ha hällt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i den aminerade plattan och bytt den var 4: e timme i 24 timmar, upprätthåller endast gelatin-NB en stark fluorescens, vilket indikerar att den fäster starkt. Dessa resultat indikerar att gelatin-NB kan fästa vid vävnadsytan för att bilda ett enhetligt och stabilt tätt skikt. Som visas i figur 3F är spektra för en hornhinneyta och en yta behandlad med gelatin nästan desamma. I den gelatin-NB-behandlade gruppen uppträder emellertid en extra topp vid 400 eV, vilket indikerar bildandet av många C = N-bindningar i vävnaden efter behandling med UV-aktiverat gelatin-NB12.
Figur 1: Steg i NB-COOH-syntesreaktionen. Figuren ger en schematisk representation av syntesreaktionen Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Design och syntes av gelatin-NB. a) Schematisk bild av den kemiska reaktionen vid gelatin-NB-bildning. B) Schematiskt diagram som illustrerar den fotoutlösta kemiska strukturomvandlingen av gelatin-NB-hydrogelen. O-nitrobensen omvandlas till NB-grupper under UV-exponering. Då kunde den aktiva aldehydgruppen därefter tvärbinda med aminogrupper för att bilda Schiff-baser. c) En skiss över gelatin-NB-bildande hydrogel och beläggning under olika matningsförhållanden. Denna siffra har ändrats från12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av gelatin-NB. a) Den varierande geleringsförmågan hos gelatin-NB med olika matningsförhållanden för NB. (1-4) representerar 0,5, 1, 2 respektive 4 NB-matningsförhållanden för gelatin-NB. B) Bruttobild av den inaktiverade modifierade gelatin-NB-lösningen och gelatin-NB-lösningen efter UV-belysning. (C) SEM-bilder av den skadade hornhinnans yta, gelatin och gelatin-NB-4-proteinbeläggningsbehandlad hornhinneyta. Skalstänger: 30 μm (topppaneler); 40 μm (bottenpaneler, förstorade). d) Fluorescensbilder av mössens kolonyta märkt med gelatin och gelatin-NB-molekylbeläggning. Skalstänger: 200 μm. E) Fluorescensbilder av märkta gelatin- och gelatin-NB-molekylbeläggningsbehandlade aminerade plattor vid 0 timmar och 24 timmar. Skalstänger: 20 μm. (F) Röntgenfotonspektroskopi (XPS) av gelatin-NB-4-bindning till vävnad. Bindningsenergierna hos peptid-C-NH- och aminoamingruppen C-NH2 som skiftar på grund av utseendet av en C = N-bindningstopp avslöjar den UV-inducerade bildningen av Schiff-baser. Denna siffra har ändrats från5 och12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limmaterial är en ny klass av material. Fler och fler forskare är engagerade i syntesen av olika typer av limmaterial och försöker hitta sina tillämpningar inom bioteknik, vävnadsteknik, regenerativ medicin och andra områden, vilket har lett till kraftig utveckling de senaste åren. Förutom att fokusera på den starka vidhäftningen av limmaterial, ägnar forskare också mer uppmärksamhet åt andra egenskaper, såsom injicerbarhet, självläkning, hemostatisk, antibakteriell, kontrollerad borttagning och så vidare13. Dessa nya applikationer utökar avsevärt tillämpningsområdet för limmaterial med lovande applikationsmöjligheter.
I detta dokument introducerades syntesmetoden för en ny hydrogelgelatin-NB. Gelatin-NB har stark vidhäftning, och det rapporteras att det kan appliceras på reparation av hornhinneskada och tarmskada i klinisk praxis 5,12. Därför är det av stort akademiskt och applikationsvärde att popularisera beredningsmetoden för gelatin-NB.
Det viktigaste steget för att förbereda gelatin-NB är syntesprocessen. Vi föreslår begreppet matningsförhållande (FR), vilket är molförhållandet mellan NB-gruppen och den primära aminogruppen i gelatin. FR för syntetisering av gelatin-NB är inte konstant och kan justeras enligt arten av det vidhäftande vävnadsgränssnittet. För kaninhornhinnor är FR för gelatin-NB-ögondroppar FRNB = 2, medan antalet aminogrupper på ytan av muskolon är relativt högt12; FRNB = 2 visar sig inte vara den optimala FR för detta, och behöver vanligtvis ökas till ca 4 för att uppnå optimal vidhäftningseffekt. Vid syntetisering av gelatin-NB i olika applikationsscenarier är det nödvändigt att ställa in en FR-gradient före experimentet för att utforska den bästa vidhäftningseffekten. Dessutom nämnde vi i artikeln att NB måste hållas borta från UV-ljus hela tiden, eftersom NB-grupper är mycket känsliga för UV; Vi föreslår att man undviker alla direkta ljuskällor så mycket som möjligt under syntesprocessen för att minimera UV-ljusets påverkan på NB-grupper.
Samtidigt har denna syntesteknik vissa begränsningar. Till exempel leder det låga utbytet av råprodukter till behovet av en större konsumtion av råvaror. Vi försöker ändra olika reaktionsförhållanden för att förbättra utbytet, såsom att justera reaktionstemperaturen och ytterligare förlänga reaktionstiden. Vi kommer att uppdatera forskningsframstegen i tid. Forskare kan hänvisa till videon för att förbättra beredningsstrategin för gelatin-o-nitrosobensaldehyd eller ytterligare modifiera gruppen på grundval av detta för att möta ytterligare biomedicinska behov. Vi tror att syntesmetoden för gelatin o-nitrosobensaldehyd som beskrivs i detta dokument kommer att påskynda utvecklingen av biosyntetisk och regenerativ medicin. Dessutom förväntas gelatin-NB tillämpas ytterligare i kritiska kliniska fall, såsom blödning orsakad av akut vaskulär skada, bristning av lever och mjälte och gastrisk perforering i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
