Summary
Protokollen, der præsenteres her, viser syntesen af en stærk klæbende hydrogelgelatine o-nitrosobenzaldehyd (gelatine-NB). Gelatine-NB har hurtig og effektiv vævsadhæsionsevne, som kan danne en stærk fysisk barriere for at beskytte såroverflader, så det forventes at blive anvendt inden for skadereparationsbioteknologi.
Abstract
Selvklæbende materialer er blevet populære biomaterialer inden for biomedicinsk og vævsteknik. I vores tidligere arbejde præsenterede vi et nyt materiale - gelatine o-nitrosobenzaldehyd (gelatine-NB) - som hovedsageligt anvendes til vævsregenerering og er blevet valideret i dyremodeller af hornhindeskade og inflammatorisk tarmsygdom. Dette er en ny hydrogel dannet ved at modificere biologisk gelatine med o-nitrosobenzaldehyd (NB). Gelatine-NB blev syntetiseret ved at aktivere carboxylgruppen af NB-COOH og reagere med gelatine gennem 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) og N-hydroxysuccinimid (NHS). Den opnåede forbindelse blev renset for at generere slutproduktet, som stabilt kan opbevares i mindst 18 måneder. NB har en stærk vedhæftning til -NH2 på vævet, som kan danne mange C = N-bindinger, hvilket øger vedhæftningen af gelatine-NB til vævsgrænsefladen. Fremstillingsprocessen omfatter trin til syntese af NB-COOH-gruppen, modifikation af gruppen, syntese af gelatine-NB og oprensning af forbindelsen. Målet er at beskrive den specifikke synteseproces af gelatine-NB i detaljer og demonstrere anvendelsen af gelatine-NB til reparation af skader. Desuden præsenteres protokollen for yderligere at styrke og udvide arten af det materiale, der produceres af det videnskabelige samfund til mere anvendelige scenarier.
Introduction
Hydrogel er en type tredimensionel polymer dannet af vand hævelse. Især hydrogel afledt af en ekstracellulær matrix anvendes i vid udstrækning inden for biosyntese og regenerativ medicin på grund af dets fremragende biokompatibilitet og terapeutiske effektivitet1. Hydrogeler er blevet rapporteret til behandling af mavesår, neuritis, myokardieinfarkt 2,3,4 og andre sygdomme. Endvidere er det blevet bevist, at gelatine-NB kan fremme resultatet af inflammation ininflammatory tarmsygdom (IBD)5. Traditionelle hydrogeler omfatter gellangummi, gelatine, hyaluronsyre, polyethylenglycol (PEG), lagdelt, hydrofob / hydrofil, alginat / polyacrylamid, dobbelt netværk og polyamfotere hydrogeler6, som alle har god histokompatibilitet og mekaniske egenskaber. Disse traditionelle hydrogeler er imidlertid sårbare over for fugt og luft i miljøet. Hvis de udsættes for luft i lang tid, mister de vand og tørrer; Hvis de er nedsænket i vandet i lang tid, vil de absorbere vand og udvide7, hvilket reducerer deres fleksibilitet og mekaniske funktion. Derudover er opretholdelse af vævsadhæsionen af konventionelle hydrogeler en stor udfordring8.
Baseret på dette designede og syntetiserede vi en nanoskala hydrogelgelatine-NB, som er en ny hydrogel dannet ved at modificere biologisk gelatine med NB (figur 1). NB har en stærk vedhæftningsevne til -NH2 på vævet, som kan danne et stort antal C = N-bindinger, hvilket øger klæbeevnen i hydrogelvævsgrænsefladen. Denne stærke vedhæftning kan få hydrogelen til at klæbe fast til vævsoverfladen og dermed danne en molekylær belægning på nanoniveau. I holdets tidligere undersøgelser er det blevet bekræftet, at denne form for modificeret hydrogelbelægning har forbedret vævsadhæsion9; Det kan stabilt klæbe til hornhinde- og tarmorganer og væv og spille anti-inflammation, barriereisolering og regenereringsfremmende roller. Målet er at introducere den specifikke synteseproces af gelatine-NB i detaljer her, så gelatine-NB kan anvendes i flere scenarier for skadereparation. Desuden opfordrer vi andre forskere til yderligere at styrke og udvide arten af dette materiale, så det passer til flere anvendelsesscenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6-musene blev købt fra Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. De newzealandske kaniner blev købt fra Zhejiang University. Dyrene blev holdt i naturlige lys-mørke cyklusforhold og fik mad og drikkevand frit. Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt etisk af de institutionelle retningslinjer fra Zhejiang University Ethics Committee standardretningslinjer (ZJU20200156) og Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, som var i overensstemmelse med NIH Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (SRRSH202107106).
1. Syntese af NB-COOH
- Forbered 4-hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyd (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 ækvivalenter [eq.]), kaliumcarbonat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) og methyl-4-brombutyrat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) baseret på protokollen foreslået i den tidligere undersøgelse10. Forbindelserne opløses i 40 ml N, N-dimethylformamid (DMF) og omrøres ved omgivelsestemperatur i 16 timer.
- Der tilsættes 200 ml 0 °C vand til blandingen, og blandingen udfældes for at opnå et råprodukt.
- Råproduktet opløses gentagne gange i DMF og udfældes derefter i fem cyklusser. Råproduktet udfældes og tørres ved 80 °C i 2 timer for at opnå det tidlige produkt.
2. Kemisk modifikation og forarbejdning
- Ipsosubstitution af methyl-4-(4-formyl-2-methoxyphenoxymethoxyphenyl)butansyremethylester udføres som beskrevet nedenfor.
- Der tilsættes langsomt 9,4 g methyl-4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy)butanoat (37,3 mM, 1 eq.) til en forafkølet (-2 °C) opløsning af 70 % salpetersyre (140 ml) og omrøres ved -2 °C i 3 timer.
BEMÆRK: Afhængigt af nitreringsreaktionens temperatur vil ipso-substitutionen af formyldelen forekomme. - Blandingen (~9,0 g) filtreres med 200 ml 0 °C vand, og den renses derefter i DMF for at udfælde et fast produkt.
- Det faste produkt hydrolyseres i trifluoreddikesyre (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) ved 90 °C og tørres. Opløsningsmidlet fjernes under 80 kPa for at opnå det endelige mellemprodukt, et tørt lysegult pulver.
- Mellemproduktet (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) opløses i tetrahydrofuran (THF)/ethanol, 1:1 v/v (100 ml). Derefter tilsættes langsomt 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 eq.) ved 0 °C. Efter 3 timer fjernes alle opløsningsmidler under vakuum, og resten suspenderes i en 1:1 vand- og dichlormethanopløsning (50 ml hver).
- Forbered dichlormethan for at ekstrahere produktet fra det vandige lag. Fjern det organiske lag og tør over magnesiumsulfat.
- Råproduktet renses ved silicagelsøjlekromatografi ved hjælp af DCM/MeOH i forholdet 10:1 (1% TEA). Endelig opnås 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) relativt rent gulligt pulver NB-COOH.
3. Syntese af gelatine-NB
- Forbered 5 g gelatine til en batch af modifikation. Der fremstilles en homogen gelatineopløsning ved opløsning af 5 g gelatine i 100 ml deioniseret vand og opbevares ved 37 °C.
BEMÆRK: Her defineres de oprindelige 33 x 10-5 mol ε-aminogrupper /g gelatine11 . - Definer foderforholdet (FR) som det molære forhold mellem NB-grupper og primære aminogrupper i gelatine. I denne undersøgelse blev 53 mg NB med 1 g gelatine defineret som FRNB = 1.
- 1.060 mg NB-COOH opløses i 5 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at aktivere carboxylgrupperne af NB-COOH. Da NB-gruppen er følsom over for ultraviolet (UV) lys, når den er i opløsning, skal den altid holdes væk fra lys.
- Der tilsættes 746 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimidhydrochlorid (EDC) i NB-COOH DMSO-opløsningen og omrøres i 5 min. Når EDC er opløst, tilsættes 448 mg N-hydroxysuccinimid (NHS) og omrøres i 5 minutter.
- Brug en dråbetragt til langsomt at droppe blandingen med en hastighed på 0,5 ml / min i den opløste gelatineopløsning under kraftig omrøring for at reagere ved 45 ° C i 4 timer.
4. Oprensning og opbevaring af produktet
- Dialyser gelatine-NB-opløsningen mod overskydende deioniseret vand i mindst 3 dage, opsaml derefter, frys og lyofiliser den for at opnå gelatine-NB-skum. Opbevar skummet i en ekssikkator i mørke til videre brug.
- Det frysetørrede gelatine-NB-skum opløses i deioniseret vand ved 37 °C umiddelbart før brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser et skema over de vigtigste kemiske reaktioner, der er involveret i syntesen af gelatine-NB, som fremmer vævsintegration ved podning af NB-grupper på gelatine. Figur 2B viser, at O-nitrobenzen fra gelatine-NB-hydrogelen omdannes til en NB-gruppe umiddelbart efter UV-bestråling, og derefter kan den aktive aldehydgruppe tværbindes med en aminogruppe til dannelse af en Schiff-base. Figur 2C viser, at forskellige forhold mellem NB-grupper kan føre til forskellige tværbundne strukturer af gelatine-NB.
Samtidig blev der også udført en foreløbig karakterisering af gelatine-NB's fysiske egenskaber. Som vist i figur 3 har gelatine-NB en stærk gelering, når foderforholdet (FR) for NB er lavt. Dette betyder, at gelatine-NB med lav FR danner en blød hydrogel på grund af tilstedeværelsen af et stort antal aminogrupper, der kan reagere med fotogenererede aldehydgrupper, mens gelatine-NB med høj FR kan opretholde en fleksibel dråbe. Vi observerede også, at den samlede morfologi af gelatine-NB stabilt klæber til hornhindeoverfladen ved scanning elektronmikroskopi (SEM), som vist i figur 3C. Imidlertid ser en skadet hornhindeoverflade behandlet med ingenting eller gelatine ud til at være glat. Figur 3D viser, at den fluorescerende mærkede gelatine-NB har evnen til at klæbe til tarmvævet og danne en tæt belægning. Gelatinegruppens fluorescensintensitet er imidlertid meget svag, hvilket indikerer, at den ikke klæber fast til tarmvæggen. Figur 3E viser, at både gelatine og gelatine-NB oprindeligt er i stand til at klæbe til den aminerede plade. Efter hældning af fosfatbufret saltvand (PBS) i den aminerede plade og udskiftning af den hver 4. time i 24 timer opretholder kun gelatine-NB imidlertid en stærk fluorescens, hvilket indikerer, at den klæber stærkt. Disse resultater indikerer, at gelatine-NB kan klæbe til vævsoverfladen for at danne et ensartet og stabilt tæt lag. Som vist i figur 3F er spektrene af en hornhindeoverflade og en overflade behandlet med gelatine næsten ens. I den gelatine-NB-behandlede gruppe er der imidlertid en ekstra top, der vises ved 400 eV, hvilket indikerer dannelsen af mange C = N-bindinger i vævet efter behandling med UV-aktiveret gelatine-NB12.
Figur 1: Trin i NB-COOH-syntesereaktionen. Figuren giver en skematisk repræsentation af syntesereaktionen Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Design og syntese af gelatine-NB. (A) Skematisk oversigt over den kemiske reaktion ved dannelse af gelatine-NB. (B) Skematisk diagram, der illustrerer den fotoudløste kemiske strukturtransformation af gelatine-NB-hydrogelen. O-nitrobenzen omdannes til NB-grupper under UV-eksponering. Derefter kunne den aktive aldehydgruppe efterfølgende tværbinde med aminogrupper for at danne Schiff-baser. (C) Skematisk over gelatine-NB, der danner hydrogel og belægning under forskellige foderforhold. Dette tal er ændret fra12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af gelatine-NB. (A) Gelatine-NB's varierende geleringsevne med forskellige foderforhold på NB. (1-4) repræsenterer henholdsvis 0,5, 1, 2 og 4 NB-tilførselsforhold for gelatine-NB. B) Bruttobillede af den inaktiverede modificerede gelatine-NB-opløsning og gelatine-NB-opløsningen efter UV-belysning. (C) SEM-billeder af den skadede hornhindeoverflade, gelatine og gelatine-NB-4-proteinbelægningsbehandlet hornhindeoverflade. Skalastænger: 30 μm (toppaneler); 40 μm (bundpaneler, forstørret). (D) Fluorescensbilleder af musenes kolonoverflade mærket med gelatine og gelatine-NB molekylær belægning. Skalastænger: 200 μm. (E) Fluorescensbilleder af de mærkede gelatine og gelatine-NB molekylære belægningsbehandlede aminerede plader ved 0 timer og 24 timer. Skalastænger: 20 μm. (F) Røntgenfotonspektroskopi (XPS) af gelatine-NB-4-binding til væv. Bindingsenergierne i peptidet -C-NH- og aminoamingruppe C-NH2, der skifter på grund af udseendet af en C = N-bindingstop, afslører den UV-inducerede dannelse af Schiff-baser. Dette tal er ændret fra5 og12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvklæbende materialer er en ny klasse af materiale. Flere og flere forskere er forpligtet til syntese af forskellige typer klæbematerialer og forsøger at finde deres anvendelser inden for bioteknologi, vævsteknik, regenerativ medicin og andre områder, hvilket har ført til kraftig udvikling i de senere år. Ud over at fokusere på den stærke vedhæftning af klæbende materialer er forskere også mere opmærksomme på andre egenskaber, såsom injicerbarhed, selvhelbredende, hæmostatisk, antibakteriel, kontrolleret fjernelse og så videre13. Disse nye applikationer udvider i høj grad anvendelsesområdet for klæbende materialer med lovende anvendelsesmuligheder.
I dette papir blev syntesemetoden for en ny hydrogelgelatine-NB introduceret. Gelatine-NB har stærk vedhæftning, og det rapporteres, at det kan anvendes til reparation af hornhindeskade og tarmskade i klinisk praksis 5,12. Derfor er det af stor akademisk og anvendelsesmæssig værdi at popularisere fremstillingsmetoden for gelatine-NB.
Det vigtigste trin til fremstilling af gelatine-NB er synteseprocessen. Vi foreslår begrebet foderforhold (FR), som er det molære forhold mellem NB-gruppen og den primære aminogruppe i gelatine. FR til syntetisering af gelatine-NB er ikke en konstant og kan justeres i henhold til arten af den klæbende vævsgrænseflade. For kaninhornhinder er FR af gelatine-NB øjendråber FRNB = 2, mens antallet af aminogrupper på overfladen af musekolon er relativt højt12; FRNB = 2 viser sig ikke at være den optimale FR til dette og skal normalt øges til ca. 4 for at opnå den optimale vedhæftningseffekt. Ved syntetisering af gelatine-NB i forskellige applikationsscenarier er det nødvendigt at indstille en FR-gradient før eksperimentet for at udforske den bedste vedhæftningseffekt. Derudover nævnte vi i artiklen, at NB altid skal holdes væk fra UV-lys, fordi NB-grupper er meget følsomme over for UV; Vi foreslår, at du undgår alle direkte lyskilder så meget som muligt under synteseprocessen for at minimere UV-lysets indvirkning på NB-grupper.
Samtidig har denne synteseteknologi nogle begrænsninger. For eksempel fører det lave udbytte af råprodukter til behovet for et større forbrug af råvarer. Vi forsøger at ændre forskellige reaktionsbetingelser for at forbedre udbyttet, såsom justering af reaktionstemperaturen og yderligere forlængelse af reaktionstiden. Vi vil opdatere forskningsfremskridtene i tide. Forskere kan henvise til videoen for at forbedre forberedelsesstrategien for gelatine o-nitrosobenzaldehyd eller yderligere ændre gruppen på dette grundlag for at imødekomme yderligere biomedicinske behov. Vi mener, at syntesemetoden for gelatine o-nitrosobenzaldehyd beskrevet i dette papir vil fremskynde udviklingen af biosyntetisk og regenerativ medicin. Derudover forventes gelatine-NB at blive anvendt yderligere i kritiske kliniske tilfælde, såsom blødning forårsaget af akut vaskulær skade, brud på lever og milt og gastrisk perforering i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
