Summary
Protokollen presentert her viser syntesen av et sterkt klebende hydrogelgelatin o-nitrosobenzaldehyd (gelatin-NB). Gelatin-NB har rask og effektiv vevsadhesjonsevne, som kan danne en sterk fysisk barriere for å beskytte såroverflater, så det forventes å bli brukt på feltet bioteknologi for skadereparasjon.
Abstract
Limmaterialer har blitt populære biomaterialer innen biomedisinsk og vevsteknikk. I vårt tidligere arbeid presenterte vi et nytt materiale - gelatin o-nitrosobenzaldehyd (gelatin-NB) - som hovedsakelig brukes til vevregenerering og har blitt validert i dyremodeller av hornhinneskade og inflammatorisk tarmsykdom. Dette er en ny hydrogel dannet ved å modifisere biologisk gelatin med o-nitrosobenzaldehyd (NB). Gelatin-NB ble syntetisert ved å aktivere karboksylgruppen av NB-COOH og reagere med gelatin gjennom 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC) og N-hydroksysuccinimid (NHS). Den oppnådde forbindelsen ble renset for å generere sluttproduktet, som kan lagres stabilt i minst 18 måneder. NB har en sterk vedheft til -NH2 på vevet, som kan danne mange C = N-bindinger, og dermed øke adhesjonen av gelatin-NB til vevsgrensesnittet. Fremstillingsprosessen omfatter trinn for syntese av NB-COOH-gruppen, modifisering av gruppen, syntese av gelatin-NB og rensing av forbindelsen. Målet er å beskrive den spesifikke synteseprosessen til gelatin-NB i detalj og å demonstrere anvendelsen av gelatin-NB til skadereparasjon. Videre presenteres protokollen for ytterligere å styrke og utvide naturen til materialet produsert av det vitenskapelige samfunn for mer anvendelige scenarier.
Introduction
Hydrogel er en type tredimensjonal polymer dannet ved vannhevelse. Spesielt er hydrogel avledet fra en ekstracellulær matrise mye brukt innen biosyntese og regenerativ medisin på grunn av sin utmerkede biokompatibilitet og terapeutiske effektivitet1. Hydrogeler er rapportert for behandling av magesår, nevritt, hjerteinfarkt 2,3,4 og andre sykdommer. Videre har det blitt bevist at gelatin-NB kan fremme utfallet av betennelse i inflammatorisk tarmsykdom (IBD)5. Tradisjonelle hydrogeler inkluderer gellangummi, gelatin, hyaluronsyre, polyetylenglykol (PEG), lagdelt, hydrofobt / hydrofilt, alginat / polyakrylamid, dobbeltnettverk og polyamfotere hydrogeler6, som alle har god histokompatibilitet og mekaniske egenskaper. Imidlertid er disse tradisjonelle hydrogelene sårbare for fuktighet og luft i miljøet. Hvis de blir utsatt for luft i lang tid, vil de miste vann og tørke; Hvis de er nedsenket i vannet i lang tid, vil de absorbere vann og utvide7, og dermed redusere fleksibiliteten og mekanisk funksjon. I tillegg er det en stor utfordring å opprettholde vevsadhesjonen til konvensjonelle hydrogeler8.
Basert på dette designet og syntetiserte vi en nanoskala hydrogelgelatin-NB, som er en ny hydrogel dannet ved å modifisere biologisk gelatin med NB (figur 1). NB har en sterk adhesjonsevne til -NH2 på vevet, som kan danne et stort antall C = N-bindinger, og dermed øke klebeevnen til hydrogel-vevgrensesnittet. Denne sterke vedheft kan gjøre hydrogelen fast fester seg til vevsoverflaten, og danner dermed et molekylært belegg på nanonivå. I lagets tidligere studier har det blitt bekreftet at denne typen modifisert hydrogelbelegg har forbedret vevsadhesjon9; Det kan stabilt feste seg til hornhinnen og tarmorganer og vev og spille anti-betennelse, barriereisolering og regenereringsfremmende roller. Målet er å introdusere den spesifikke synteseprosessen til gelatin-NB i detalj her, slik at gelatin-NB kan brukes i flere scenarier for skadereparasjon. Videre oppfordrer vi andre forskere til å ytterligere styrke og utvide innholdet i dette materialet for å passe til flere applikasjonsscenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6-musene ble kjøpt fra Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. New Zealand kaniner ble kjøpt fra Zhejiang University. Dyrene ble holdt i naturlige lys-mørke syklusforhold og gitt mat og drikkevann fritt. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent etisk av de institusjonelle retningslinjene til Zhejiang University Ethics Committee standard retningslinjer (ZJU20200156) og Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee, som samsvarte med NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (SRRSH202107106).
1. Syntese av NB-COOH
- Forbered 4-hydroksy-3-(metoksy-D3) benzaldehyd (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 ekvivalenter [eq.]), kaliumkarbonat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) og metyl 4-brombutyrat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) basert på protokollen foreslått i forrige studie10. Løs opp forbindelsene i 40 ml N, N-dimetylformamid (DMF) og rør ved omgivelsestemperatur i 16 timer.
- Tilsett 200 ml 0 °C vann til blandingen og felles ut blandingen for å oppnå et råprodukt.
- Løs opp råproduktet gjentatte ganger i DMF og utfell deretter i fem sykluser. Fell ut råproduktet og tørk det ved 80 °C i 2 timer for å oppnå det tidlige produktet.
2. Kjemisk modifikasjon og behandling
- Utfør ipso-substitusjonen av metyl 4- (4-formyl-2-metoksyfenoksyfenoksyfenyl) butansyremetylester som beskrevet nedenfor.
- Tilsett 9,4 g metyl 4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy) butanoat (37,3 mM, 1 eq.) sakte til en forkjølt (-2 °C) oppløsning av 70% salpetersyre (140 ml) og rør ved -2 °C i 3 timer.
MERK: Avhengig av temperaturen på nitreringsreaksjonen, vil ipso-substitusjonen av formyldelen forekomme. - Filtrer blandingen (~9,0 g) med 200 ml 0 °C vann, og rens den deretter i DMF for å utfelle et fast produkt.
- Hydrolyser det faste produktet i trifluoreddiksyre (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) ved 90 °C og tørt. Fjern oppløsningsvæsken under 80 kPa for å oppnå det endelige mellomproduktet, et tørt, lysegult pulver.
- Løs opp mellomproduktet (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) i tetrahydrofuran (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 ml). Tilsett deretter 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 ekv.) sakte ved 0 °C. Etter 3 timer, fjern alle løsningsmidler under vakuum og suspender resten i en 1: 1 vann- og diklormetanoppløsning (50 ml hver).
- Forbered diklormetan for å trekke ut produktet fra det vandige laget. Fjern det organiske laget og tørk over magnesiumsulfat.
- Rens råproduktet med silikagelkolonnekromatografi ved bruk av DCM / MeOH i forholdet 10: 1 (1% TEA). Oppnå til slutt 5,31 g (18,6 mM, 78,3 %) av relativt rent gulaktig pulver NB-COOH.
3. Syntese av gelatin-NB
- Forbered 5 g gelatin for en batch av modifikasjon. Tilbered en homogen gelatinløsning ved å løse opp 5 g gelatin i 100 ml avionisert vann og oppbevar ved 37 °C.
MERK: Her er de opprinnelige 33 x 10-5 molene ε-aminogrupper /g gelatin11 definert. - Definer matforholdet (FR) som molforholdet mellom NB-grupper og primære aminogrupper i gelatin. I denne studien ble 53 mg NB med 1 g gelatin definert som FRNB = 1.
- Løs opp 1060 mg NB-COOH i 5 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å aktivere karboksylgruppene i NB-COOH. Siden NB-gruppen er følsom for ultrafiolett (UV) lys når det er i oppløsning, må du alltid holde det borte fra lys.
- Tilsett 746 mg 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodimidhydroklorid (EDC) i NB-COOH DMSO-oppløsningen og rør i 5 minutter. Etter at EDC er oppløst, tilsett 448 mg N-hydroksysuccinimid (NHS) og rør i 5 minutter.
- Bruk en dråpetrakt til å slippe blandingen langsomt ned i en hastighet på 0,5 ml/min ned i den oppløste gelatinoppløsningen under kraftig omrøring for å reagere ved 45 °C i 4 timer.
4. Rensing og lagring av produktet
- Dialyser gelatin-NB-løsningen mot overflødig avionisert vann i minst 3 dager, og samle deretter, frys og lyofiliser den for å oppnå gelatin-NB-skummene. Hold skummene i en tørketrommel i mørket for videre bruk.
- Løs opp frysetørket gelatin-NB-skum i avionisert vann ved 37 °C, rett før bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser et skjema over de viktigste kjemiske reaksjonene involvert i syntesen av gelatin-NB, som fremmer vevsintegrasjon ved å pode NB-grupper på gelatin. Figur 2B viser at O-nitrobenzen i gelatin-NB-hydrogelen konverterer til en NB-gruppe umiddelbart etter UV-bestråling, og deretter kan den aktive aldehydgruppen kryssbindes med en aminogruppe for å danne en Schiff-base. Figur 2C indikerer at forskjellige forhold mellom NB-grupper kan føre til forskjellige tverrbundne strukturer av gelatin-NB.
Samtidig ble det også gjennomført en foreløpig karakterisering av de fysiske egenskapene til gelatin-NB. Som vist i figur 3 har gelatin-NB en sterk gelering når mateforholdet (FR) til NB er lavt. Dette betyr at gelatin-NB med lav FR danner en myk hydrogel på grunn av tilstedeværelsen av et stort antall aminogrupper som kan reagere med fotogenererte aldehydgrupper, mens gelatin-NB med høy FR kan opprettholde en fleksibel dråpe. Vi observerte også at den generelle morfologien til gelatin-NB fester seg stabilt til hornhinneoverflaten ved skanning elektronmikroskopi (SEM), som vist i figur 3C. Imidlertid ser en skadet hornhinneoverflate behandlet med ingenting eller gelatin ut til å være glatt. Figur 3D viser at den fluorescerende merkede gelatin-NB har evnen til å feste seg til tarmvevet og danne et tett belegg. Imidlertid er fluorescensintensiteten til gelatingruppen svært svak, noe som indikerer at den ikke fester seg fast til tarmveggen. Figur 3E viser at både gelatin og gelatin-NB i utgangspunktet er i stand til å feste seg til den aminerte platen. Etter å ha hellet fosfatbufret saltvann (PBS) i den aminerte platen og skiftet den hver 4. time i 24 timer, opprettholder imidlertid bare gelatin-NB en sterk fluorescens, noe som indikerer at den fester seg sterkt. Disse resultatene indikerer at gelatin-NB kan feste seg til vevsoverflaten for å danne et jevnt og stabilt tett lag. Som vist i figur 3F er spektrene til en hornhinneoverflate og en overflate behandlet med gelatin nesten de samme. I gruppen behandlet med gelatin-NB er det imidlertid en ekstra topp ved 400 eV, noe som indikerer dannelsen av mange C = N-bindinger i vevet etter behandling med UV-aktivert gelatin-NB12.
Figur 1: Trinn i NB-COOH-syntesereaksjonen. Figuren gir en skjematisk fremstilling av syntesereaksjon Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Design og syntese av gelatin-NB. (A) Skjematisk fremstilling av den kjemiske reaksjonen for gelatin-NB-dannelse. (B) Skjematisk diagram som illustrerer den fotoutløste kjemiske strukturtransformasjonen av gelatin-NB-hydrogelen. O-nitrobenzen omdannes til NB-grupper under UV-eksponering. Deretter kunne den aktive aldehydgruppen deretter kryssbinde med aminogrupper for å danne Schiff-baser. (C) Skjematisk fremstilling av gelatin-NB som danner hydrogel og belegg under forskjellige mateforhold. Dette tallet er endret fra12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av gelatin-NB. (A) Den varierende geleringsytelsen til gelatin-NB med forskjellige matforhold på NB. (1-4) representerer henholdsvis 0,5, 1, 2 og 4 NB matforhold mellom gelatin-NB. (B) Brutto visning av den inaktiverte modifiserte gelatin-NB-løsningen, og gelatin-NB-løsningen etter UV-belysning. (C) SEM-bilder av den skadede hornhinneoverflaten, gelatin og gelatin-NB-4 proteinbeleggbehandlet hornhinneoverflate. Skalastenger: 30 μm (topppaneler); 40 μm (bunnpaneler, forstørret). (D) Fluorescensbilder av musens kolonoverflate merket med gelatin og gelatin-NB molekylært belegg. Skalastenger: 200 μm. (E) Fluorescensbilder av de merkede gelatin- og gelatin-NB-molekylære beleggbehandlede aminerte platene ved 0 timer og 24 timer. Skalastenger: 20 μm. (F) Røntgenfotonspektroskopi (XPS) av gelatin-NB-4-binding til vev. Bindingsenergiene til peptidet -C-NH- og aminoamingruppe C-NH 2-forskyvning på grunn av utseendet til en C = N-bindingstopp avslører UV-indusert dannelse av Schiff-baser. Denne figuren er endret fra5 og12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limmaterialer er en ny klasse av materiale. Flere og flere forskere er forpliktet til syntese av ulike typer limmaterialer, og prøver å finne sine applikasjoner innen bioteknologi, vevsteknikk, regenerativ medisin og andre felt, noe som har ført til kraftig utvikling de siste årene. I tillegg til å fokusere på sterk vedheft av limmaterialer, er forskere også mer oppmerksom på andre egenskaper, som injiserbarhet, selvhelbredende, hemostatisk, antibakteriell, kontrollert fjerning og så videre13. Disse nye applikasjonene utvider i stor grad applikasjonsomfanget av klebende materialer med lovende applikasjonsprospekter.
I dette papiret ble syntesemetoden til en ny hydrogelgelatin-NB introdusert. Gelatin-NB har sterk vedheft, og det er rapportert at det kan brukes til reparasjon av hornhinneskade og tarmskade i klinisk praksis 5,12. Derfor er det av stor faglig og applikasjonsverdi å popularisere fremstillingsmetoden til gelatin-NB.
Det viktigste trinnet for å tilberede gelatin-NB er synteseprosessen. Vi foreslår begrepet fôrforhold (FR), som er molforholdet mellom NB-gruppen og den primære aminogruppen i gelatin. FR for syntetisering av gelatin-NB er ikke en konstant og kan justeres i henhold til arten av det adherente vevgrensesnittet. For kaninhornhinner er FR av gelatin-NB øyedråper FRNB = 2, mens antall aminogrupper på overflaten av musekolon er relativt høyt12; FRNB = 2 viser seg å ikke være den optimale FR for dette, og må vanligvis økes til ca. 4 for å oppnå optimal adhesjonseffekt. Når du syntetiserer gelatin-NB i forskjellige applikasjonsscenarier, er det nødvendig å stille inn en FR-gradient før eksperimentet for å utforske den beste adhesjonseffekten. I tillegg nevnte vi i artikkelen at NB må holdes borte fra UV-lys til enhver tid, fordi NB-grupper er svært følsomme for UV; Vi foreslår at du unngår alle direkte lyskilder så mye som mulig under synteseprosessen, for å minimere virkningen av UV-lys på NB-grupper.
Samtidig har denne synteseteknologien noen begrensninger. For eksempel fører det lave utbyttet av råprodukter til behovet for et større forbruk av råvarer. Vi prøver å endre forskjellige reaksjonsbetingelser for å forbedre utbyttet, for eksempel å justere reaksjonstemperaturen og forlenge reaksjonstiden ytterligere. Vi vil oppdatere forskningsprogresjonen i tide. Forskere kan referere til videoen for å forbedre prepareringsstrategien for gelatin o-nitrosobenzaldehyd eller ytterligere modifisere gruppen på dette grunnlaget for å møte ytterligere biomedisinske behov. Vi tror at syntesemetoden av gelatin o-nitrosobenzaldehyd beskrevet i denne artikkelen vil akselerere utviklingen av biosyntetisk og regenerativ medisin. I tillegg forventes gelatin-NB å bli ytterligere brukt i kritiske kliniske tilfeller, som blødning forårsaket av akutt vaskulær skade, ruptur av lever og milt og gastrisk perforasjon i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
