Summary
Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Synthese eines stark adhäsiven Hydrogels Gelatine o-Nitrosobenzaldehyd (Gelatine-NB). Gelatine-NB hat eine schnelle und effiziente Gewebeadhäsionsfähigkeit, die eine starke physikalische Barriere zum Schutz von Wundoberflächen bilden kann, so dass erwartet wird, dass es auf dem Gebiet der Biotechnologie zur Reparatur von Verletzungen angewendet wird.
Abstract
Klebstoffe sind zu beliebten Biomaterialien im Bereich der Biomedizin und des Tissue Engineering geworden. In unserer früheren Arbeit haben wir ein neues Material vorgestellt - Gelatine o-Nitrosobenzaldehyd (Gelatine-NB) -, das hauptsächlich für die Geweberegeneration verwendet wird und in Tiermodellen von Hornhautverletzungen und entzündlichen Darmerkrankungen validiert wurde. Hierbei handelt es sich um ein neuartiges Hydrogel, das durch Modifikation von biologischer Gelatine mit o-Nitrosobenzaldehyd (NB) gebildet wird. Gelatine-NB wurde synthetisiert, indem die Carboxylgruppe von NB-COOH aktiviert und mit Gelatine durch 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) reagiert wurde. Die erhaltene Verbindung wurde gereinigt, um das Endprodukt zu erzeugen, das mindestens 18 Monate stabil gelagert werden kann. NB hat eine starke Adhäsion an -NH2 auf dem Gewebe, das viele C = N-Bindungen bilden kann, wodurch die Adhäsion von Gelatine-NB an der Gewebegrenzfläche erhöht wird. Der Herstellungsprozess umfasst Schritte zur Synthese der NB-COOH-Gruppe, zur Modifikation der Gruppe, zur Synthese von Gelatine-NB und zur Reinigung der Verbindung. Ziel ist es, den spezifischen Syntheseprozess von Gelatine-NB im Detail zu beschreiben und die Anwendung von Gelatine-NB zur Schadensreparatur zu demonstrieren. Darüber hinaus wird das Protokoll vorgestellt, um die Art des von der wissenschaftlichen Gemeinschaft erstellten Materials für anwendbarere Szenarien weiter zu stärken und zu erweitern.
Introduction
Hydrogel ist eine Art dreidimensionales Polymer, das durch Wasserquellen gebildet wird. Insbesondere Hydrogel, das aus einer extrazellulären Matrix gewonnen wird, ist aufgrund seiner hervorragenden Biokompatibilität und therapeutischen Wirksamkeit im Bereich der Biosynthese und der regenerativen Medizin weit verbreitet1. Hydrogele wurden zur Behandlung von Magengeschwüren, Neuritis, Myokardinfarkt 2,3,4 und anderen Krankheiten berichtet. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass Gelatine-NB das Ergebnis einer entzündungsinflammatorischen Darmerkrankung (IBD) fördern kann5. Zu den herkömmlichen Hydrogelen gehören Gellangummi, Gelatine, Hyaluronsäure, Polyethylenglykol (PEG), geschichtete, hydrophobe/hydrophile, Alginat/Polyacrylamid-Hydrogele, Doppelnetzwerke und polyamphotere Hydrogele6, die alle eine gute Histokompatibilität und mechanische Eigenschaften aufweisen. Diese traditionellen Hydrogele sind jedoch anfällig für Feuchtigkeit und Luft in der Umwelt. Wenn sie längere Zeit der Luft ausgesetzt sind, verlieren sie Wasser und trocknen. Wenn sie längere Zeit in das Wasser eingetaucht sind, nehmen sie Wasser auf und dehnen sichaus 7, wodurch ihre Flexibilität und mechanische Funktion verringert wird. Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung der Gewebehaftung herkömmlicher Hydrogele eine große Herausforderung8.
Auf dieser Grundlage haben wir ein nanoskaliges Hydrogel-Gelatine-NB entworfen und synthetisiert, bei dem es sich um ein neuartiges Hydrogel handelt, das durch Modifikation von biologischer Gelatine mit NB gebildet wird (Abbildung 1). NB hat eine starke Adhäsionsfähigkeit an -NH2 auf dem Gewebe, das eine große Anzahl von C = N-Bindungen bilden kann, wodurch die Adhäsivität der Hydrogel-Gewebe-Grenzfläche erhöht wird. Diese starke Haftung kann dazu führen, dass das Hydrogel fest an der Gewebeoberfläche haftet und so eine molekulare Beschichtung auf Nanoebene bildet. In früheren Studien des Teams wurde bestätigt, dass diese Art der modifizierten Hydrogelbeschichtung die Gewebehaftung verbessert hat9; Es kann stabil an Hornhaut- und Darmorganen und -geweben haften und eine entzündungshemmende, barriereisolierende und regenerationsfördernde Rolle spielen. Ziel ist es, hier den spezifischen Syntheseprozess von Gelatine-NB im Detail vorzustellen, so dass Gelatine-NB in mehr Szenarien der Schadensbehebung eingesetzt werden kann. Darüber hinaus ermutigen wir andere Forscher, die Natur dieses Materials weiter zu stärken und zu erweitern, um mehr Anwendungsszenarien gerecht zu werden.
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Protocol
Die C57BL/6-Mäuse wurden von der Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital gekauft. Die neuseeländischen Kaninchen wurden von der Zhejiang University gekauft. Die Tiere wurden unter natürlichen Hell-Dunkel-Zyklusbedingungen gehalten und erhielten frei Futter und Trinkwasser. Alle experimentellen Verfahren wurden ethisch durch die institutionellen Richtlinien der Standardrichtlinien der Ethikkommission der Zhejiang University (ZJU20200156) und des Sir Run Run Shaw Hospital Animal Care and Use Committee der Zhejiang University School of Medicine genehmigt, die dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (SRRSH202107106) entsprachen.
1. Synthese von NB-COOH
- Bereiten Sie 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyd (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 Äquivalente [Gl.]), Kaliumcarbonat (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 Äq.) und Methyl-4-Brombutyrat (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 Äq.) basierend auf dem in der vorherigen Studie vorgeschlagenen Protokollvor 10. Die Verbindungen werden in 40 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und 16 h bei Raumtemperatur gerührt.
- 200 ml 0 °C heißes Wasser werden in das Gemisch gegeben und das Gemisch gefällt, um ein Rohprodukt zu erhalten.
- Das Rohprodukt wird wiederholt in DMF gelöst und dann fünf Zyklen lang ausgefällt. Das Rohprodukt fällt aus und trocknet es 2 h lang bei 80 °C, um das frühe Produkt zu erhalten.
2. Chemische Modifikation und Verarbeitung
- Führen Sie die ipso-Substitution von Methyl-4-(4-formyl-2-methoxyphenoxymethoxyphenyl)butansäuremethylester wie unten beschrieben durch.
- 9,4 g Methyl-4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy)butanoat (37,3 mM, 1 Äq.) langsam in eine vorgekühlte (-2 °C) Lösung von 70%iger Salpetersäure (140 ml) geben und bei -2 °C 3 h rühren.
HINWEIS: Abhängig von der Temperatur der Nitrierungsreaktion erfolgt die ipso-Substitution des Formylanteils. - Filtrieren Sie die Mischung (~9,0 g) mit 200 ml 0 °C heißem Wasser und reinigen Sie sie dann in DMF, um ein festes Produkt auszufällen.
- Das feste Produkt wird in Trifluoressigsäure (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 mL) bei 90 °C hydrolysiert und getrocknet. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter 80 kPa, um das Endprodukt zu erhalten, ein trockenes hellgelbes Pulver.
- Das Zwischenprodukt (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 Äq.) wird in Tetrahydrofuran (THF)/Ethanol 1:1 v/v (100 ml) gelöst. Anschließend werden 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 Äq.) langsam bei 0 °C zugegeben. Entfernen Sie nach 3 h alle Lösungsmittel unter Vakuum und suspendieren Sie den Rückstand in einer 1:1-Lösung aus Wasser und Dichlormethan (je 50 ml).
- Bereiten Sie Dichlormethan vor, um das Produkt aus der wässrigen Schicht zu extrahieren. Entfernen Sie die organische Schicht und trocknen Sie sie über Magnesiumsulfat.
- Reinigung des Rohprodukts durch Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von DCM/MeOH im Verhältnis 10:1 (1% TEA). Schließlich erhält man 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) relativ reines gelbliches Pulver NB-COOH.
3. Synthese von Gelatine-NB
- Bereiten Sie 5 g Gelatine für eine Modifikationscharge vor. Es wird eine homogene Gelatinelösung hergestellt, indem 5 g Gelatine in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst und bei 37 °C gelagert werden.
HINWEIS: Hier werden die ursprünglichen 33 x 10-5 Mol ε-Aminogruppen /g Gelatine11 definiert. - Definieren Sie das Zufuhrverhältnis (FR) als das molare Verhältnis zwischen NB-Gruppen und primären Aminogruppen in Gelatine. In dieser Studie wurden 53 mg NB mit 1 g Gelatine als FRNB = 1 definiert.
- 1.060 mg NB-COOH werden in 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um die Carboxylgruppen von NB-COOH zu aktivieren. Da die NB-Gruppe in Lösung empfindlich auf ultraviolettes (UV) Licht reagiert, halten Sie sie immer von Licht fern.
- 746 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimidhydrochlorid (EDC) in die NB-COOH DMSO-Lösung geben und 5 min rühren. Nachdem sich EDC aufgelöst hat, 448 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) zugeben und 5 Minuten rühren.
- Verwenden Sie einen Tropftrichter, um die Mischung langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min unter kräftigem Rühren in die gelöste Gelatinelösung zu tropfen, um bei 45 °C für 4 h zu reagieren.
4. Reinigung und Lagerung des Produkts
- Dialysieren Sie die Gelatine-NB-Lösung mindestens 3 Tage lang gegen überschüssiges deionisiertes Wasser, sammeln Sie sie dann, frieren Sie sie ein und lyophilisieren Sie sie, um die Gelatine-NB-Schäume zu erhalten. Bewahren Sie die Schäume zur weiteren Verwendung in einem Exsikkator im Dunkeln auf.
- Lösen Sie die gefriergetrockneten Gelatine-NB-Schäume unmittelbar vor Gebrauch in deionisiertem Wasser bei 37 °C auf.
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Representative Results
Abbildung 2A zeigt ein Schema der wichtigsten chemischen Reaktionen, die an der Synthese von Gelatine-NB beteiligt sind, die die Gewebeintegration durch Pfropfen von NB-Gruppen auf Gelatine fördert. Abbildung 2B zeigt, dass sich das O-Nitrobenzol des Gelatine-NB-Hydrogels unmittelbar nach der UV-Bestrahlung in eine NB-Gruppe umwandelt und dann die aktive Aldehydgruppe mit einer Aminogruppe vernetzt werden kann, um eine Schiff-Base zu bilden. Abbildung 2C zeigt, dass unterschiedliche Verhältnisse von NB-Gruppen zu unterschiedlichen vernetzten Strukturen von Gelatine-NB führen können.
Gleichzeitig wurde auch eine vorläufige Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften von Gelatine-NB durchgeführt. Wie in Abbildung 3 gezeigt, hat Gelatine-NB eine starke Gelierung, wenn das Zufuhrverhältnis (FR) von NB niedrig ist. Dies bedeutet, dass Gelatine-NB mit niedrigem FR aufgrund des Vorhandenseins einer großen Anzahl von Aminogruppen, die mit photogenerierten Aldehydgruppen reagieren können, ein weiches Hydrogel bildet, während Gelatine-NB mit hohem FR ein flexibles Tröpfchen aufrechterhalten kann. Wir beobachteten auch, dass die Gesamtmorphologie von Gelatine-NB durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) stabil an der Hornhautoberfläche haftet, wie in Abbildung 3C gezeigt. Eine verletzte Hornhautoberfläche, die mit nichts oder Gelatine behandelt wurde, scheint jedoch glatt zu sein. Abbildung 3D zeigt, dass die fluoreszenzmarkierte Gelatine-NB die Fähigkeit hat, am Darmgewebe zu haften und eine dichte Beschichtung zu bilden. Die Fluoreszenzintensität der Gelatinegruppe ist jedoch sehr schwach, was darauf hindeutet, dass sie nicht fest an der Darmwand haftet. Abbildung 3E zeigt, dass sowohl Gelatine als auch Gelatine-NB zunächst in der Lage sind, an der aminierten Platte zu haften. Nach dem Eingießen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in die aminierte Platte und dem Wechsel alle 4 h für 24 h behält jedoch nur Gelatine-NB eine starke Fluoreszenz bei, was darauf hinweist, dass sie stark haftet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Gelatine-NB an der Gewebeoberfläche haften kann, um eine gleichmäßige und stabile dichte Schicht zu bilden. Wie in Abbildung 3F gezeigt, sind die Spektren einer Hornhautoberfläche und einer mit Gelatine behandelten Oberfläche nahezu gleich. In der mit Gelatine behandelten Gruppe tritt jedoch bei 400 eV ein zusätzlicher Peak auf, der auf die Bildung vieler C = N-Bindungen im Gewebe nach der Behandlung mit UV-aktivierter Gelatine-NB12 hinweist.
Abbildung 1: Schritte der NB-COOH-Synthesereaktion. Die Abbildung zeigt eine schematische Darstellung der Synthesereaktion Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Design und Synthese von Gelatine-NB . (A) Schematische Darstellung der chemischen Reaktion zur Gelatine-NB-Bildung. (B) Schematische Darstellung der photogetriggerten chemischen Strukturumwandlung des Gelatine-NB-Hydrogels. O-Nitrobenzol wird unter UV-Bestrahlung in NB-Gruppen umgewandelt. Dann könnte die aktive Aldehydgruppe anschließend mit Aminogruppen vernetzen, um Schiff-Basen zu bilden. (C) Schematische Darstellung des gelatine-NB-bildenden Hydrogels und der Beschichtung unter verschiedenen Zufuhrverhältnissen. Diese Zahl wurde von12 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung von Gelatine-NB. (A) Die unterschiedliche Gelierleistung von Gelatine-NB mit verschiedenen Zufuhrverhältnissen von NB. (1-4) repräsentieren 0,5, 1, 2 bzw. 4 NB-Zufuhrverhältnisse von Gelatine-NB. (B) Grobansicht der inaktivierten modifizierten Gelatine-NB-Lösung und der Gelatine-NB-Lösung nach UV-Beleuchtung. (C) REM-Bilder der verletzten Hornhautoberfläche, der Gelatine und der mit Gelatine-NB-4-Proteinbeschichtung behandelten Hornhautoberfläche. Maßstabsbalken: 30 μm (obere Felder); 40 μm (Bodenplatten, vergrößert). (D) Fluoreszenzbilder der Dickdarmoberfläche der Maus, markiert durch Gelatine und Gelatine-NB-Molekularbeschichtung. Maßstabsbalken: 200 μm. (E) Fluoreszenzbilder der markierten Gelatine und der mit Gelatine-NB-Molekularbeschichtung behandelten aminierten Platten bei 0 h und 24 h. Maßstabsbalken: 20 μm. (F) Röntgenphotonenspektroskopie (XPS) der Gelatine-NB-4-Bindung an Gewebe. Die Verschiebung der Bindungsenergien des Peptids -C-NH- und der Aminoamingruppe C-NH2 aufgrund des Auftretens eines C = N-Bindungspeaks zeigt die UV-induzierte Bildung von Schiff-Basen. Diese Zahl wurde von5 auf12 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Klebstoffe sind eine neue Materialklasse. Immer mehr Forscher widmen sich der Synthese verschiedener Arten von Klebstoffen und versuchen, ihre Anwendungen in der Biotechnologie, im Tissue Engineering, in der regenerativen Medizin und in anderen Bereichen zu finden, was in den letzten Jahren zu einer starken Entwicklung geführt hat. Neben der starken Haftung von Klebstoffen achten die Forscher auch verstärkt auf andere Eigenschaften wie Injektionsfähigkeit, Selbstheilung, Blutstillung, antibakterielle, kontrollierte Entfernung usw.13. Diese neuen Anwendungen erweitern das Anwendungsspektrum von Klebstoffen mit vielversprechenden Anwendungsperspektiven erheblich.
In dieser Arbeit wurde die Synthesemethode eines neuartigen Hydrogel-Gelatine-NB vorgestellt. Gelatine-NB hat eine starke Adhäsion und es wird berichtet, dass es in der klinischen Praxis zur Reparatur von Hornhautverletzungen und Darmverletzungen angewendet werden kann 5,12. Daher ist es von großem akademischen und anwendungsbezogenen Wert, die Herstellungsmethode von Gelatine-NB bekannt zu machen.
Der wichtigste Schritt zur Herstellung von Gelatine-NB ist der Syntheseprozess. Wir schlagen das Konzept des Futterverhältnisses (FR) vor, das das molare Verhältnis zwischen der NB-Gruppe und der primären Aminogruppe in Gelatine darstellt. Der FR für die Synthese von Gelatine-NB ist keine Konstante und kann entsprechend der Art der adhärenten Gewebeschnittstelle eingestellt werden. Für Kaninchenhornhäute beträgt die FR von Gelatine-NB-Augentropfen FRNB = 2, während die Anzahl der Aminogruppen auf der Oberfläche von Mausdickpunkten relativ hoch ist12; FRNB = 2 erweist sich dafür als nicht optimal und muss in der Regel auf etwa 4 erhöht werden, um den optimalen Hafteffekt zu erzielen. Bei der Synthese von Gelatine-NB in verschiedenen Anwendungsszenarien ist es notwendig, vor dem Experiment einen FR-Gradienten einzustellen, um den besten Adhäsionseffekt zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir in dem Artikel erwähnt, dass NB immer von UV-Licht ferngehalten werden muss, da NB-Gruppen sehr empfindlich gegenüber UV-Licht sind; Wir empfehlen, während des Syntheseprozesses alle direkten Lichtquellen so weit wie möglich zu vermeiden, um den Einfluss von UV-Licht auf NB-Gruppen zu minimieren.
Gleichzeitig weist diese Synthesetechnologie einige Einschränkungen auf. So führt beispielsweise die geringe Ausbeute an Rohprodukten zu einem höheren Rohstoffverbrauch. Wir versuchen, verschiedene Reaktionsbedingungen zu ändern, um die Ausbeute zu verbessern, wie z.B. die Anpassung der Reaktionstemperatur und die weitere Verlängerung der Reaktionszeit. Wir werden den Forschungsfortschritt rechtzeitig aktualisieren. Die Forscher können sich auf das Video beziehen, um die Herstellungsstrategie von Gelatine-o-Nitrosobenzaldehyd zu verbessern oder die Gruppe auf dieser Grundlage weiter zu modifizieren, um weitere biomedizinische Anforderungen zu erfüllen. Wir glauben, dass die in diesem Artikel beschriebene Synthesemethode von Gelatine-o-Nitrosobenzaldehyd die Entwicklung der biosynthetischen und regenerativen Medizin beschleunigen wird. Darüber hinaus wird erwartet, dass Gelatine-NB in Zukunft in kritischen klinischen Fällen wie Blutungen durch akute Gefäßverletzungen, Leber- und Milzrupturen und Magenperforationen weiter angewendet wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
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