Summary
Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des images de l’intestin lors d’une blessure induite par laser. En exposant l’intestin de la souris à un laser multiphotonique, la perte d’une ou de plusieurs cryptes est induite localement. En imageant à plusieurs reprises la zone endommagée pendant des mois, la dynamique en temps réel de la récupération intestinale est capturée.
Abstract
Étudier la récupération intestinale in vivo est un défi technique exquis. L’absence de protocoles d’imagerie longitudinale a empêché de mieux comprendre la dynamique à l’échelle des cellules et des tissus qui orchestre la régénération intestinale. Ici, nous décrivons une méthode de microscopie intravitale qui induit localement des lésions tissulaires à l’échelle de la crypte unique et suit la réponse régénérative de l’épithélium intestinal chez les souris vivantes. Des cryptes simples ou des champs intestinaux plus importants ont été ablés par un laser infrarouge multiphotonique de haute intensité d’une manière contrôlée dans le temps et l’espace. L’imagerie intravitale répétitive à long terme a permis de suivre les zones endommagées au fil du temps et de surveiller la dynamique des cryptes pendant la récupération des tissus sur une période de plusieurs semaines. Des événements de remodelage de crypte tels que la fission, la fusion et la disparition de la crypte ont été observés dans le tissu voisin lors de dommages induits par laser. Ce protocole permet l’étude de la dynamique des cryptes dans des contextes homéostatiques et physiopathologiques, tels que le vieillissement et l’initiation tumorale.
Introduction
La muqueuse épithéliale de l’intestin est constamment mise à l’épreuve par les acides gastriques, les toxines et le microbiote qui peuvent perturber la barrière épithéliale. La structure intestinale et l’organisation des tissus sont spécialisées pour s’auto-renouveler et réparer constamment les dommages. L’épithélium monocouche de l’intestin grêle est organisé en unités crypte-villosités1. En homéostasie, les cellules souches intestinales Lgr5+ auto-renouvelées qui résident à la base de la crypte donnent naissance à une descendance différenciée. Les cellules filles différenciées se déplacent jusqu’à l’extrémité de l’axe des villosités à la manière d’un tapis roulant, où elles sont éliminées de sorte que la muqueuse intestinale est reconstituée en 3-5 jours 2,3. À long terme, toutes les cellules Lgr5+ ne contribuent pas également au renouvellement tissulaire, car cela dépend également de la capacité des cellules à se déplacer contre la bande transporteuse vers la base de la crypte (c’est-à-dire le mouvement rétrograde)4,5. En effet, lors de l’ablation des cellules Lgr5+ par, par exemple, le rayonnement, les cellules progénitrices à l’extérieur de la base de la crypte se déplacent dans la base pour dédifférencier et reconstituer le pool de cellules souches 6,7,8.
L’inflammation aiguë peut entraîner la perte de cellules souches Lgr5+ 9,10. En plus de la perte de cellules souches, de nombreux facteurs externes peuvent causer des dommages aigus à l’épithélium à l’échelle de la crypte. Il a été démontré que les radiations, les traitements chimiques et les antibiotiques endommagent les cryptes intestinales et les villosités11. De plus grands champs de cryptes et de villosités peuvent être affectés par des infections bactériennes, virales et parasitaires12. L’intestin possède une capacité remarquable à se remettre des dommages internes et externes à l’échelle de la crypte par la fission de la crypte (une division d’une crypte en deux)13. Après blessure, les cryptes dans la zone adjacente aux dommages subissent une fission pour reconstituer les numéros de crypte. Ce phénomène se produit également, bien que dans une moindre mesure, pendant l’homéostasie14,15. Pour contrebalancer une augmentation potentielle du nombre de cryptes pendant l’homéostasie, les cryptes peuvent également fusionner (fusionner deux cryptes en une seule)16,17. On ne sait pas si la fusion des cryptes joue également un rôle dans le rétablissement du nombre de cryptes après une blessure. De plus, la dynamique et les facteurs réglementaires de ce processus restent à élucider.
Les modèles de lésions sont indispensables pour étudier la régénération tissulaire in vivo. Divers modèles de blessures ont été utilisés pour étudier la régénération des tissus intestinaux. Les stratégies expérimentales antérieures utilisaient une radiothérapie à forte dose pour épuiser les pools de cellules souches18 ou un traitement au sulfate de dextrane sodique (DSS) pour induire une colite chronique et aiguë et une perte de cryptes chez la souris19,20. L’ablation unicellulaire par des moyens génétiques ou optiques a été utilisée pour affiner les lésions tissulaires et considérée comme un outil attrayant pour démêler le rôle des cellules souches et progénitrices 21,22 et étudier la régénération vasculaire23. De plus, un système de biopsie-lésion a été développé pour induire des dommages dans des champs plus grands de plusieurs cryptes et villosités24. Il est important de noter que la réponse à l’insulte dommageable peut varier le long de l’axe proximal-distal de l’intestin, comme indiqué pour la radiothérapie, qui a causé plus de dommages dans l’intestin grêle que dans le côlon25. Cela souligne la nécessité de méthodes ciblées qui contrôlent à la fois l’étendue de l’insulte dommageable et sa localisation dans le tractus intestinal.
L’étendue des dommages et la récupération ont généralement été évaluées par des moyens statiques, qui fournissent des informations limitées sur la dynamique de la récupération des tissus. La microscopie intravitale (MIV) a ouvert des possibilités uniques de quantifier le comportement des cellules souches, le remodelage épithélial et la régénération dans de nombreux organes 26,27,28,29,30, et a fourni des informations percutantes sur la biologie intestinale 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Ici, nous décrivons une méthode pour causer des dommages intestinaux définis spatio-temporels et capturer la récupération de la muqueuse épithéliale intestinale. Nous utilisons l’ablation laser à deux photons pour endommager les cryptes intestinales et suivre la réponse immédiate de la plaie et la récupération à long terme par microscopie intravitale répétitive. Notre protocole permet de cartographier le remodelage régénératif de l’architecture du tissu intestinal en réponse à des lésions tissulaires locales. La dynamique des cryptes, y compris les événements de fission et de fusion, peut être facilement quantifiée et suivie au fil du temps. L’application de l’ablation au laser et de l’imagerie intravitale répétitive peut être utilisée comme plate-forme pour étudier la dynamique à l’échelle tissulaire de l’architecture intestinale au cours de l’homéostasie et de la physiopathologie, telles que l’initiation tumorale.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux décrites dans cette étude ont été réalisées conformément aux directives et à l’approbation de l’Animal Welfare Body (AWB) de l’Institut néerlandais du cancer (NKI).
NOTE : Consultez le comité d’éthique animale de l’institut avant d’effectuer toute expérimentation animale.
1. Préparation à la chirurgie et à l’imagerie intravitale
- Traitements pré-chirurgicaux
- Induire K19-CreERT237 âgés de 8 à 12 semaines : Rosa26-mTmG 38 et Lgr5eGFP-IRES-CreERT218 : Rosa26-Confetti39 souris en injectant du tamoxifène dissous dans de l’huile de tournesol par voie intrapéritonéale 4 à 6 semaines avant la chirurgie (Figure 1).
- Appliquer l’analgésie. Injecter 200 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel) diluée dans du NaCl 0,9 % par 30 g de souris par voie sous-cutanée 30 minutes avant la chirurgie. Administrer du carprofène (0,067 mg/mL) dans un flacon contenant 125 mL d’eau potable autoclavée non acidifiée 24 heures avant la chirurgie. Alternativement, administrer une injection de carprofène par voie sous-cutanée (5 mg / kg) 30 minutes avant le début de la chirurgie.
- Préparation à la chirurgie
- Introduisez des outils chirurgicaux stériles autoclavés dans l’armoire des risques biologiques.
- Allumez le coussin chauffant et réglez la température à 37 °C.
- Préparation à l’imagerie intravitale
- Allumez la chambre à température contrôlée du microscope au moins 4 heures avant l’imagerie pour laisser suffisamment de temps pour stabiliser la température.
REMARQUE: Le temps nécessaire peut varier en fonction de la machine utilisée. - Maintenez la température à l’intérieur de la chambre climatique stable à 37 °C.
- Allumez le microscope à deux photons, le scanner et le laser.
- Lancez le logiciel d’imagerie.
- Réglez la longueur d’onde du laser à 960 nm et ouvrez l’obturateur.
- Allumez la chambre à température contrôlée du microscope au moins 4 heures avant l’imagerie pour laisser suffisamment de temps pour stabiliser la température.
2. Chirurgie et imagerie intravitale
- Exposition chirurgicale de l’intestin
- Anesthésiez la souris à l’aide d’isoflurane à 2%-3% et placez-la sur un coussin chauffant, recouvert d’un chiffon stérile. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en évaluant la fréquence et la qualité de la respiration (une respiration/seconde) et en vérifiant le réflexe de la souris.
- Couvrez les yeux de la souris avec une pommade pour les yeux.
- Injecter 200 μL de solution saline stérile préchauffée par voie sous-cutanée.
- Rasez l’abdomen et enlevez les poils. Changez le tissu stérile dans la zone chirurgicale.
- Insérez une sonde rectale pour surveiller la température de la souris.
NOTE: La température doit être d’environ 37 ° C. - Mettez une nouvelle paire de gants stériles.
- Nettoyez la zone chirurgicale de manière circulaire avec des gommages alternés de solution antiseptique suivis de 80% d’éthanol trois fois. Enlevez l’excès d’éthanol avec un coton-tige stérile.
REMARQUE: Il est essentiel de surveiller la souris pour l’hypothermie à ce stade. - Couvrez la souris avec un champ chirurgical stérile.
- Vérifiez le réflexe de la souris.
- Faites une incision verticale médiane de ~10 mm à travers la peau à l’aide d’un scalpel stérile.
- Inciser la linea alba à l’aide de ciseaux pour séparer les muscles droits de l’abdomen et ouvrir l’abdomen.
- Trouvez le caecum de la souris à l’aide de cotons-tiges stériles trempés dans une solution saline préchauffée stérile pour l’utiliser comme point de référence.
- Faites une petite incision dans un morceau de gaze stérile, mouillez-la dans une solution saline stérile préchauffée et placez-la au-dessus de l’incision.
- Sortez l’intestin avec des cotons-tiges stériles trempés dans une solution saline stérile préchauffée. Gardez l’intestin hydraté en ajoutant une solution saline préchauffée stérile.
- Placez une chambre d’imagerie stérile sur mesure à côté de la souris.
- Transférez la souris dans la boîte d’imagerie stérile préchauffée.
- Placez l’intestin sur le verre stérile de la boîte d’imagerie. Placez la tête de la souris à l’intérieur du tube d’inhalation de la boîte d’imagerie, comme illustré à la figure 1.
- Si nécessaire, fixez la souris avec un film flexible stérile et du ruban adhésif.
- Placez la boîte d’imagerie contenant la souris dans la chambre du microscope.
- Imagerie intravitale
- Surveillez la souris pendant l’imagerie en vérifiant la fréquence et la profondeur de la respiration et la température via une sonde rectale toutes les 15 minutes. Le pourcentage d’isoflurane doit être maintenu entre 1% et 2%. Ajustez si nécessaire.
- Trouvez une région de l’intestin à l’aide de l’oculaire du microscope.
- Obtenez une vue à grand champ de la région d’intérêt à l’aide de la caméra interne du microscope, comme le montre la figure 2A.
- Imagez la région d’intérêt à l’aide du laser 960 nm du microscope multiphotonique. Ajustez la puissance et la longueur d’onde du laser en fonction des fluorophores utilisés dans l’expérience.
- Acquérir une pile z de 10 à 20 pas de 3 μm de la région d’intérêt.
- Ablation au laser
- Choisissez une ou plusieurs positions dans la mosaïque illustrée précédemment.
- Utilisez la fonction d’étalonnage du point d’eau de Javel du logiciel d’imagerie à un zoom de 32 et une résolution de 124 x 124 pixels avec une vitesse de numérisation de 400 Hz, en utilisant la propriété de balayage bidirectionnel pendant 3 à 10 s, en fonction de l’ampleur des dommages visés. L’initiation des dommages dans la zone de la crypte peut être reconnue par une augmentation de l’autofluorescence dans les canaux vert et rouge.
- Répétez les deux étapes précédentes pour plusieurs régions dans la même souris.
- Après l’ablation, acquérir des piles z des régions endommagées pour confirmer l’emplacement et l’étendue des dommages.
- Fermeture du site chirurgical
- Placez la souris, encore sous anesthésie, dans une zone de suture stérile.
- Réinsérez l’intestin exposé dans l’abdomen à l’aide de coton-tiges stériles trempés dans une solution saline stérile préchauffée.
- Suturer la linea alba en effectuant une simple suture continue à l’aide d’une suture résorbable 5-0. Fermez les extrémités de la suture avec des nœuds chirurgicaux.
- Répétez la même étape avec la couche de peau.
- Éteignez la station d’isoflurane et nettoyez et stérilisez la boîte d’imagerie et l’incrustation.
- Nettoyez les outils chirurgicaux avec le nettoyant pour instruments chirurgicaux, le nettoyant enzymatique et le lubrifiant pour instruments chirurgicaux. Une fois séchés, stérilisez les outils chirurgicaux avec la boîte de chirurgie dans l’autoclave.
- Soins post-opératoires
- Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant que la cage est placée sur le coussin chauffant pendant ~ 1 h.
REMARQUE: Placez la souris avec d’autres compagnons de cage si possible. Le logement solitaire n’est pas nécessaire pour le rétablissement. - Vérifiez la température de la souris toutes les 15 minutes pendant la récupération.
- Injecter 200 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel) diluée dans du NaCl 0,9 % par 30 g de souris par voie sous-cutanée 6 à 12 h après la chirurgie.
- Administrer du carprofène (0,067 mg/mL) dans un flacon contenant 125 mL d’eau potable autoclavée non acidifiée pendant 72 heures après la chirurgie.
- Pesez la souris et surveillez le bien-être tous les jours pendant 1 semaine après la chirurgie.
- Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant que la cage est placée sur le coussin chauffant pendant ~ 1 h.
3. Chirurgie répétitive et imagerie intravitale
- Chirurgie
- Au deuxième point temporel (au moins 1 semaine après la première séance d’imagerie), répétez les étapes 1.1.2, 1.2, 1.3 et 2.1.
- Imagerie intravitale
- Répétez les étapes 2.2.1-2.2.3.
- Utilisez le modèle des vaisseaux sanguins pour trouver les mêmes régions d’intérêt imagées sur le premier point temporel.
- Répétez les étapes 2.2.4 et 2.2.5.
- Fermeture du site chirurgical
- Répétez l’étape 2.4.1.
- Si la souris n’est pas destinée à être imagée à un autre point temporel, sacrifiez la souris en effectuant une luxation cervicale sous anesthésie terminale. Sinon, passez à l’étape suivante.
NOTE: Selon les lignes directrices de la directive européenne 2010/63/UE, annexe IV, la luxation cervicale est une méthode acceptable. - Répétez les étapes 2.4.2-2.4.6.
- Soins post-opératoires
- Répétez les étapes 2.5.1 à 2.5.5.
Representative Results
Pour démontrer le type de résultats qui peuvent être obtenus à partir de la méthode d’ablation au laser combinée à l’imagerie intravitale, nous avons effectué une expérience comme le montre la figure 1. Tout d’abord, nous avons injecté K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) et Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Souris Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confettis) avec du tamoxifène pour marquer stochastiquement les cellules avec l’une des couleurs Confetti (ou protéine fluorescente verte [GFP] dans le cas des souris mTmG). K19-cre induit le traçage de la lignée à partir de toutes les cellules épithéliales, tandis que Lgr5-cre induit le traçage à partir de cellules souches seulement 8,18,37. L’injection de tamoxifène a été administrée 4 à 6 semaines avant la chirurgie et la première séance d’imagerie afin d’obtenir des cryptes dans lesquelles toutes les cellules sont monoclonales pour une certaine couleur. Une identification robuste des mêmes régions tissulaires sur plusieurs semaines est essentielle pour suivre le sort des mêmes cryptes au fil du temps. Les caractéristiques architecturales inhérentes aux tissus, telles que le système vasculaire, peuvent être utilisées comme repères tissulaires fiables et ont été enregistrées ici avec la caméra interne du microscope. De plus, l’étiquetage d’une petite fraction de cryptes avec (au moins deux) couleurs différentes a permis de reconnaître les mêmes cryptes à chaque session d’imagerie et de suivre leur comportement pendant le processus de régénération après les dommages au laser. Lors de l’exposition chirurgicale de l’intestin de la souris et de l’acquisition d’images de caméra et fluorescentes de la région d’intérêt (Figure 2A), les réglages du point d’eau de Javel du laser multiphotonique peuvent être utilisés pour ablater une ou plusieurs cryptes (Figure 2B,C). L’initiation des dommages pourrait être reconnue par une augmentation de l’autofluorescence dans les canaux vert et rouge. Pour étudier la dynamique de la récupération des cryptes, la chirurgie et la procédure d’imagerie ont été répétées des semaines / mois après la première séance d’imagerie et les structures inhérentes aux tissus (système vasculaire et modèles de cryptes marquées clonalement) ont été utilisées comme points de repère pour trouver exactement le même emplacement de la blessure (Figure 2). Lorsque cette méthode a été appliquée chez des souris Lgr5Cre-Confettis, où Lgr5-eGFP est exprimé de manière inégale, les changements dans le nombre et la forme des cryptes à la suite des dommages induits par laser ont pu être capturés (Figure 3). Alors que certaines régions n’ont montré aucun changement dans le nombre et la structure des cryptes (Figure 3B), d’autres régions ont montré un remodelage important de la crypte, comme on l’a vu dans le nombre d’événements de fission et de fusion des cryptes (Figure 3C) et la perte de cryptes 2 semaines après la blessure induite par le laser (Figure 3D). En introduisant différentes tailles de dommages et en quantifiant les événements de fission, de fusion et de disparition après l’ablation, comme dans l’exemple illustré (Figure 3E), la dynamique de la régénération induite par une blessure peut être cartographiée dans différents modèles murins.
Figure 1 : Représentation schématique de la configuration expérimentale. Le marquage in vivo des cellules intestinales est réalisé en injectant du tamoxifène par voie intrapéritonéale dans des modèles murins génétiquement modifiés pour induire une recombinaison médiée par Cre dans les cryptes intestinales. Après des jours ou des semaines (lorsque les cryptes sont monoclonales pour une certaine couleur), l’intestin est exposé chirurgicalement et soumis à une ablation au laser à l’aide d’un microscope multiphotonique avec une chambre à température contrôlée. L’étendue des dommages cryptiques est caractérisée immédiatement après l’ablation et la souris est autorisée à se remettre de la procédure. L’exposition chirurgicale répétée et la MIV sont utilisées pour surveiller la récupération intestinale au fil du temps. Le motif et la distribution du système vasculaire sanguin et des cryptes de couleurs différentes sont utilisés pour retrouver les mêmes régions des semaines ou des mois après l’ablation. Le remodelage de la crypte (p. ex. fission ou fusion) peut être observé sur le site des dommages des semaines après l’ablation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie longitudinale de la régénération tissulaire lors de lésions induites par laser dans l’intestin. Lorsque l’intestin est positionné exactement de la même manière, les vaisseaux sanguins de l’intestin peuvent être utilisés comme une carte pour trouver et imager exactement les mêmes régions. (A) Images de vue d’ensemble de la caméra de l’intestin. Les lignes blanches pointillées représentent le motif du système vasculaire voisin du site de dommage (boîte blanche), utilisé comme point de repère pour trouver la même région ablée au laser sur un autre point temporel. Les deux images inférieures montrent la vue agrandie de la boîte blanche. La flèche représente le site exact de l’ablation au laser au jour 1 et 1 mois plus tard. (B) Images fluorescentes d’une seule crypte endommagée capturées par microscope multiphotonique. La flèche dans la boîte bleue indique le site des dommages au jour 1 et 1 mois plus tard. (C) Images fluorescentes d’un champ endommagé de cryptes. Les flèches dans la boîte bleue marquent la région des dégâts au jour 1 et 1 mois plus tard. Barres d’échelle: 1 mm (A, haut); 0,25 mm (A, en bas); 200 μm (grande vue d’ensemble B et C); et 50 μm (images zoomées B et C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie intravitale du destin des cryptes après ablation au laser. (A) En utilisant le modèle des confettis, les cryptes étiquetées avec différentes couleurs peuvent être suivies au fil du temps pour cartographier la dynamique de récupération. La flèche blanche représente le site de l’ablation au laser. La boîte jaune représente une région voisine (<100 μm du site des dommages), tandis que les cases bleues et violettes représentent les régions éloignées (>100 μm) de la région ablée au laser. Différents modes de régénération sont observés. (B) Certaines régions restent inchangées comme dans la case violette. (C) D’autres régions présentent un remodelage de crypte sous forme de fission ou de fusion de cryptes; Les lignes blanches pointillées et les flèches représentent les événements de fission de crypte et les lignes pointillées orange et les flèches représentent les événements de fusion de crypte. (D) Dans certaines régions, la disparition de la crypte est observée, comme dans la boîte jaune où la crypte surlignée d’une ligne pointillée orange a disparu. (E) Un exemple de quantification montrant le nombre d’événements de remodelage de cryptes observés dans les zones voisines (c.-à-d. moins de 100 μm) et éloignées (c.-à-d. plus de 100 μm) du site endommagé. Barres d’échelle: 200 μm (A); 50 μm (B-J). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce protocole combine l’ablation microscopique au laser et la microscopie intravitale longitudinale pour suivre la régénération intestinale de la réponse précoce aux dommages au remodelage tissulaire à long terme. La technique a été établie dans le strict respect des considérations éthiques pour induire et imager l’ablation laser microscopique, et lorsqu’elle est suivie avec précision, elle maintiendra le bien-être des animaux. Pendant la chirurgie, il est important de s’assurer que l’intégrité de l’intestin est bien préservée. Cela peut être réalisé en manipulant doucement le tissu avec des cotons-tiges humides stériles, ce qui empêche le saignement ou le dessèchement du tissu. L’étendue des dommages microscopiques induits par laser doit également être soigneusement évaluée en imageant les différentes couches intestinales de la zone après l’ablation au laser. Si le chercheur souhaite adapter la fréquence des étapes expérimentales décrites dans ce protocole, le comité d’éthique animale de l’institut doit être consulté avant l’expérience pour établir la conséquence sur le bien-être.
La microscopie intravitale répétitive permet de surveiller la récupération tissulaire chez la même souris au fil du temps. L’exposition chirurgicale répétée de l’intestin accorde facilement un accès optique à l’ensemble du tractus intestinal. Les caractéristiques inhérentes aux tissus, telles que le système vasculaire, servent de points de repère pour identifier les mêmes régions intestinales à chaque séance d’imagerie. Ainsi, la même région tissulaire peut être imagée sur plusieurs semaines, ce qui permet de quantifier la régénération tissulaire à long terme dans la même zone intestinale chez la même souris. Le contrôle spatio-temporel offert par la méthode combinée de chirurgie et d’imagerie présente l’avantage que le même organe peut être imagé dans des conditions homéostatiques et régénérantes chez la même souris, ce qui contraste avec les modèles précédents de dommages aux organes entiers où les témoins et les échantillons en régénération provenaient de souris différentes 11,12,18,19,20 . Par conséquent, notre cadre expérimental minimise le nombre requis d’animaux nécessaires pour l’expérience et réduit la variation intra-animale.
Le dépannage du protocole doit commencer par un examen de la technique de manipulation de la souris et de l’intestin et un contrôle de l’équipement et des paramètres de microscopie. Il y a beaucoup d’étapes critiques dans ce protocole qui nécessitent une attention particulière. Tout d’abord, afin d’assurer le bien-être des animaux et une qualité élevée et continue des données, tous les travaux doivent être effectués dans un environnement stérile propre en utilisant une technique aseptique, et la température de la souris doit être maintenue pendant la chirurgie et chaque séance d’imagerie. Garder le tissu hydraté avec une solution saline stérile préchauffée pendant l’imagerie est essentiel et prévient la fibrose tissulaire.
Pour s’assurer que l’expérience est réalisée de manière reproductible, il est important d’aligner les lasers avant utilisation pour une acquisition optimale et de mesurer la puissance de sortie du laser multiphotonique au début de chaque session. Des paramètres tels que le type d’objectif, le grossissement, le temps de séjour, la puissance du laser et la longueur d’onde ont une influence sur l’étendue de l’ablation laser microscopique et doivent être pris en compte. Dans cette étude, l’ablation laser et l’imagerie sont réalisées avec une puissance laser de 1,2 W (hors de la lentille) à une longueur d’onde de 960 nm à travers un objectif Fluotar VISIR 25x / 0,95 WATER. La modification de la longueur d’onde ou des propriétés de balayage optique affecte l’étendue des dommages microscopiques. Une longueur d’onde plus faible (telle que 840 nm) se traduit par des photons de plus haute énergie et souvent par une sortie plus élevée du laser, et peut aggraver les dommages microscopiques. Un zoom plus élevé entraîne plus d’énergie par région, et donc moins de temps pour ablater les cryptes, et vice versa. Le temps d’habitation des pixels peut également être augmenté ou diminué pour modifier la vitesse d’ablation et l’étendue des dommages. Lorsque le tissu imagé n’est pas stable (par exemple, en raison de mouvements péristaltiques), l’ablation doit être effectuée rapidement. À cette fin, la vitesse d’ablation doit être optimisée, par exemple en augmentant le zoom et/ou la sortie laser.
Trouver la même région intestinale au cours de plusieurs séances d’imagerie est une autre étape critique qui doit être exécutée correctement pour assurer le succès de l’expérience. Pour ce faire, l’intestin doit être positionné exactement de la même manière à tous les points temporels. Nous recommandons de toujours utiliser le caecum comme point de référence pour trouver les mêmes régions dans l’intestin grêle et le gros intestin. L’étirement délicat du tissu d’intérêt avec des cotons-tiges garantit que la région d’intérêt est à portée de la distance de travail objective et maximise le nombre de régions qui peuvent être tracées. De plus, nous recommandons de toujours ablater et imager plusieurs positions microscopiques dans chaque souris pour tenir compte des régions qui peuvent ne pas être localisées lors d’une séance d’imagerie ultérieure. Si les régions ne peuvent pas être trouvées, même si le positionnement de l’intestin est correct, cela peut aider à repositionner la souris et à modifier l’orientation de la zone exposée. Le suivi des cryptes au fil du temps peut être fastidieux pour les expériences où des champs intestinaux plus importants de plusieurs cryptes adjacentes sont ablés. De telles insultes dommageables peuvent évoquer un remodelage tissulaire au-delà de la monocouche épithéliale, ce qui peut aboutir à une modification des repères tissulaires utilisés pour le suivi de la région au fil du temps. Choisir des points de repère à une distance suffisante du site endommagé et capturer des champs de vision plus grands qui dépassent la zone endommagée de plusieurs centaines de micromètres augmente les chances de réussite des expériences à long terme. En plus d’un positionnement incorrect de l’intestin sur la scène du microscope, les mouvements péristaltiques du tractus gastro-intestinal peuvent interférer avec l’imagerie. Ce problème peut être amélioré de deux façons. Si la fréquence des mouvements n’est pas trop élevée, le processus peut être répété dans la même région avec un temps d’exposition accru. Alternativement, des quantités plus élevées d’anesthésie peuvent être utilisées pour diminuer le péristaltisme. Nous recommandons de limiter les doses plus élevées d’isoflurane à de courts ajustements. Dans l’ensemble, les séances d’imagerie doivent être aussi courtes que possible, de manière optimale en dessous de 3 h, pour assurer une récupération rapide.
L’approche combinée de l’ablation au laser et de la microscopie intravitale longitudinale présente plusieurs avantages par rapport à d’autres modèles de dommages. Les modèles de dommages (chimiques) précédents n’avaient pas la capacité de confiner localement l’insulte dommageable 6,11,12,19,20. L’ablation au laser surmonte cette lacune en limitant les dommages à une région d’intérêt définie. Cela permet aux chercheurs de contrôler l’emplacement de la blessure, ainsi que l’étendue des dommages. La gravité des dommages peut être modulée pour ablater des cryptes ou des champs intestinaux microscopiques entiers pour informer sur les réponses régénératives à l’échelle de la crypte. En plus du contrôle spatial, l’ablation au laser permet également de chronométrer avec précision l’apparition des dommages, dépassant ainsi la précision des modèles médicamenteux, chimiques et d’infectionprécédents 9,10,11,12,19,20. Notre protocole s’appuie sur des études antérieures qui utilisaient l’ablation thermique induite par laser comme méthode pour induire des dommages localisés dans l’intestin21,23. Les modèles précédents de dommages induits par laser ont imagé des zones locales dans l’intestin grêle21 ou la surface luminale du côlon distal23. L’approche combinée de la chirurgie et de l’ablation au laser permet de visualiser l’épithélium intestinal (cryptes en particulier) à haute résolution, et d’effectuer une ablation au laser et une imagerie de suivi de la récupération tissulaire dans n’importe quelle position de l’intestin grêle, du caecum et du côlon proximal. Il capture la récupération des mêmes régions intestinales au fil du temps, permettant de visualiser différentes couches de l’intestin (muqueuse, sous-muqueuse, musculaire et séreuse) selon la configuration expérimentale. Notre technique est principalement adaptée à l’imagerie répétée à long terme pour une période de plusieurs semaines / mois. Pour étudier la dynamique de récupération à court terme des cryptes (par exemple, pendant plusieurs jours consécutifs après un dommage), l’approche d’ablation au laser décrite ici peut être combinée avec des fenêtres d’imagerie intravitale27,28,40.
Ce protocole peut être utilisé pour une multitude d’applications de recherche dans divers domaines scientifiques qui couvrent la régénération, l’immunologie et la recherche sur le cancer. L’imagerie longitudinale de la régénération intestinale met en lumière la dynamique cellulaire qui préserve l’intégrité épithéliale et la fonction barrière, permet la défense de l’hôte contre les agents pathogènes dans la lumière intestinale et qui sous-tend la clairance et la propagation des mutations oncogènes. Chaque question scientifique imposera des exigences uniques sur l’étendue des dommages induits par laser et la durée de l’imagerie. Les souris rapporteures fluorescentes et les colorants injectés peuvent considérablement étendre et affiner les données qui peuvent être acquises en permettant la visualisation de n’importe quelle cellule et structure d’intérêt. Par exemple, une souris Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confettis peut être utilisée pour visualiser les descendants des cellules souches, tandis que le rapporteur Rosa26-mTmG informe sur l’architecture des tissus. Ensemble, ces récentes avancées technologiques font de l’expérimentation intestinale intravitale un outil lucratif pour faire progresser notre compréhension de la biologie et des maladies intestinales.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par l’Organisation néerlandaise de la recherche scientifique NWO (Vici grant 09150182110004 à J.v.R. et Veni grant 09150161910151 à H.A.M), l’OCENW. GROOT.2019.085 (à J.v.R), et une bourse postdoctorale EMBO (subvention ALTF 452-2019 à H.A.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
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