Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse af termiske grænser for dyreplankton ved hjælp af en varmeblok

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

Denne protokol illustrerer brugen af kommercielt tilgængelige komponenter til at generere en stabil og lineær termisk gradient. En sådan gradient kan derefter anvendes til at bestemme den øvre termiske grænse for planktoniske organismer, især hvirvelløse larver.

Abstract

Termiske grænser og bredde er blevet brugt i vid udstrækning til at forudsige artsfordelingen. Da den globale temperatur fortsætter med at stige, er det afgørende at forstå, hvordan termisk grænse ændres med akklimatisering, og hvordan den varierer mellem livsstadier og populationer, for at bestemme arternes sårbarhed over for fremtidig opvarmning. De fleste marine organismer har komplekse livscyklusser, der omfatter tidlige planktoniske stadier. Mens kvantificering af den termiske grænse for disse små tidlige udviklingsstadier (titusinder til hundreder af mikron) hjælper med at identificere udviklingsmæssige flaskehalse, kan denne proces være udfordrende på grund af den lille størrelse af målorganismer, stort bænkpladsbehov og høje indledende fabrikationsomkostninger. Her præsenteres en opsætning, der er rettet mod små mængder (ml til ti ml). Denne opsætning kombinerer kommercielt tilgængelige komponenter for at generere en stabil og lineær termisk gradient. Produktionsspecifikationer for opsætningen samt procedurer til at introducere og opregne levende versus døde individer og beregne dødelig temperatur præsenteres også.

Introduction

Termisk tolerance er nøglen til organismers overlevelse og funktion 1,2. Da planeten fortsætter med at varme på grund af menneskeskabte kulstofemissioner, lægges der stigende vægt på bestemmelse og anvendelse af termiske grænser3. Forskellige endepunkter, såsom dødelighed, manglende udvikling og tab af mobilitet, er blevet brugt til at bestemme både øvre og nedre termiske grænser4. Disse termiske grænser betragtes ofte som en proxy for en organismes termiske niche. Disse oplysninger bruges igen til at identificere arter, der er mere sårbare over for global opvarmning, samt forudsige fremtidig artsfordeling og de resulterende artsinteraktioner 3,5,6,7. Det kan dog være udfordrende at bestemme termiske grænser, især for små planktoniske organismer.

For planktoniske organismer, især larvestadierne hos marine hvirvelløse dyr, kan den termiske grænse bestemmes ved kronisk eksponering. Kronisk eksponering opnås ved at opdrætte larver ved flere temperaturer over dage til uger og bestemme den temperatur, hvor larveoverlevelse og / eller udviklingshastighed reducerer 8,9,10. Denne tilgang er imidlertid temmelig tidskrævende og kræver store inkubatorer og erfaring med larvehold (se reference11 for en god introduktion til dyrkning af marine hvirvelløse larver).

Alternativt kan akut eksponering for termisk stress bruges til at bestemme termiske grænser. Ofte involverer denne bestemmelsesmetode at placere små hætteglas med larver i temperaturstyrede tørre bade 12,13,14, udnytte termiske gradientfunktioner i PCR-termiske cyklere15,16 eller lægge glasflasker / mikrocentrifugerør langs en termisk gradient genereret ved påført opvarmning og afkøling på enderne af store aluminiumsblokke med huller, hvor hætteglassene passer tæt17, 18,19. Typiske tørre bade genererer en enkelt temperatur; Derfor skal togsæt betjenes samtidigt for at vurdere ydeevnen på tværs af en række temperaturer. Termiske cyklister genererer en gradient, men rummer kun et lille prøvevolumen (120 μL) og kræver omhyggelige manipulationer. I lighed med termiske cyklister skaber store aluminiumblokke lineære og stabile temperaturgradienter. Begge tilgange kan kombineres med logistisk eller probit regression for at beregne den dødelige temperatur for 50% procent af befolkningen (LT50)12,20,21. De anvendte aluminiumsblokke var imidlertid ~ 100 cm lange; Denne størrelse kræver et stort laboratorierum og adgang til specialiserede computer numeriske kontrolfræsemaskiner til at bore hullerne. Sammen med at bruge to vandbade af forskningskvalitet til at opretholde måltemperaturen, er de økonomiske omkostninger ved at samle opsætningen høje.

Derfor sigter dette arbejde mod at udvikle et alternativt middel til at generere en stabil, lineær temperaturgradient med kommercielt tilgængelige dele. Et sådant produkt skal have et lille fodaftryk og bør let kunne anvendes til forsøg med akut termisk stresseksponering for planktonorganismer. Denne protokol er udviklet med zooplankton, der er <1 mm i størrelse som målorganismer, og dermed blev den optimeret til brug af et 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugerør. Større undersøgelsesorganismer vil kræve beholdere, der er større end de 1,5 ml mikrocentrifugerør, der anvendes, og forstørrede huller i aluminiumsblokkene.

Ud over at gøre forsøgsapparatet mere tilgængeligt har dette arbejde til formål at forenkle databehandlingsrørledningen. Mens kommerciel statistisk software giver rutiner til at beregne LT50 ved hjælp af logistisk eller probit regression, er licensomkostningerne ikke trivielle. Derfor vil et brugervenligt script, der er afhængig af det open source statistiske program R22 , gøre dataanalyse mere tilgængelig.

Denne protokol viser, hvordan en kompakt varmeblok kan fremstilles med kommercielt tilgængelige dele og anvendes til at udsætte zooplankton (larver af sanddollaren Dendraster excentricus) for akut varmestress for at bestemme deres øvre termiske grænse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af varmeblokken

  1. Tilslut 120 V, 100 W strimmelvarmeren til reostaten (se Materialetabel).
  2. Forbered aluminiumsblokken på 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm x 5 tommer ved at bore 60 huller i et 6 x 10 gitter (se Materialetabel). Sørg for, at hullerne er fordelt 2 cm fra centrum til centrum i begge retninger. Hver skal være 1,1 cm i diameter og 4,2 cm dyb (figur 1).
    BEMÆRK: Udfør boringen på en fræsemaskine eller borepresse med højhastighedsstålbor. Varmeelementet og køleelementet blev begge valgt til at dække så meget af kontaktfladen på de 15,2 cm x 5 cm overflader som muligt.
  3. Bor yderligere to huller på en af overfladerne på 20,3 cm x 5 cm mellem 1. og 2. kolonne og 9. og 10. kolonne, der svarer til størrelsen på temperaturregulatorsonderne (se Materialetabel).
  4. Konstruer en kasse fra 1,2 cm (0,5 tommer) klare akrylplader (se Materialetabel) for både at holde elementerne på plads og isolere den færdige varmeblok. Brug to lag akryl til at isolere bagsiden af varmeelementet (figur 1).
  5. I den endelige samling påføres termisk pasta (se Materialetabel) for at maksimere varmeledningsevnen fra varmeelementet ind i blokken og fra blokken til køleelementet.

2. Bestemmelse af termiske gradientindstillinger

  1. Tilslut vandbadet/akvariekøleren med Tygon-slangen (se Materialetabel). Isoler slangen med skumrørisolering efter behov.
  2. Indsæt termostatsonden i hullerne på siden af aluminiumsblokken. Sørg for, at sonde 1 er placeret i nærheden af varmeelementet.
  3. Anbring mikrocentrifugerør fyldt til randen (1,5 ml) med ledningsvand i alle de fræsede huller (60 rør i alt).
  4. Tænd for temperaturregulatoren, og indstil stopopvarmningstemperaturen for sonde 1 til 35-37 °C og sonde 2 til 21,5-22,5 °C.
    BEMÆRK: Den foreslåede termostat har to stikkontakter, der fungerer uafhængigt; Kun sonde 1 bruges til regulering af varm temperatur i denne særlige brugssag. Indstil derfor temperaturen på sonde 2 til temperaturen i den lave ende.
  5. Drej reostaten for at tænde varmeelementet og indstil det til medium.
  6. Tænd for vandbadet/akvariekøleren, og indstil køletemperaturen til 15 °C.
  7. Kontroller, at blokken er varm i den ene ende og afkølet i den anden efter 10 min.
    FORSIGTIG: De udsatte ender af varmeelementet kan være varme; rør ikke ved dem.
  8. Kontroller temperaturen inde i hvert mikrocentrifugerør ved hjælp af et termoelement med en K-type elektrode (se Materialetabel) hvert 10. minut bagefter. Temperaturen stabiliseres efter ~ 60 min og ser lineær ud (figur 2).
  9. Juster slutpunkternes værdier ved at ændre indstillingerne for temperaturregulatoren og vandbadet efter behov.

3. Termisk eksponering og levende:død optælling

BEMÆRK: Trin 2 kan udelades, når de ønskede indstillinger for temperaturgradienten er bestemt.

  1. Tænd for det recirkulerende vandbad og varmelegeme, og indstil dem til henholdsvis 15 °C og 37 °C for at generere en temperaturgradient fra 19,5 °C til 37 °C.
  2. For at sikre, at den termiske gradient er lineær, skal du placere mikrocentrifugerør fyldt til randen (1,5 ml) med ledningsvand i alle de fræsede huller (60 rør i alt).
  3. Lad varmeblokken nå den indstillede temperatur ved at vente 45-60 min. Kontroller temperaturen inde i hvert mikrocentrifugerør ved hjælp af et termoelement med en K-type elektrode for at se, om den har nået den forventede temperatur. Bemærk disse temperaturer.
  4. Hvis undersøgelsesorganismerne er >500 μm store og let kan overføres fra en beholder til en anden (f.eks. en vandloppe), fyldes et 1,5 ml mikrocentrifugerør med 750 μL 0,45 μm filtreret havvand. Alternativt, hvis undersøgelsesorganismerne er små, skal du fylde et 1,5 ml mikrocentrifugerør med 250 μL 0,45 μm filtreret havvand.
    BEMÆRK: For de repræsentative data blev larver af sanddollar Dendraster excentrics , som er 2, 4 og 6 dage efter befrugtning, anvendt (se Materialetabel). Den gennemsnitlige (± S.D., n = 15 for hver alder) størrelse af disse individer var henholdsvis 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm og 292 ± 14 μm. Da disse larver let kan koncentreres (trin 3.5), blev mikrocentrifugerørene fyldt med 750 μL filtreret havvand.
  5. Forsøgsorganismernes kultur koncentreres med omvendt filtrering (dvs. masken anbringes i beholderen med forsøgsorganismerne, og vand fjernes gennem toppen af masken), således at forsøgsorganismerne forbliver i bunden af bægerglasset11.
    BEMÆRK: Et 30 μm nylonnet blev brugt til de undersøgte larvesand dollars (se Materialetabel).
  6. Skyl den koncentrerede dyreprøve med filtreret havvand (f.eks. ved dyrkning med algefødevarer eller andre kemikalier). Gentag den omvendte filtrering endnu en gang for at koncentrere dyreprøven.
  7. Anbring et kendt antal individuelle organismer i de halvfyldte mikrocentrifugerør. Tæl de små planktoniske organismer under et dissekerende mikroskop (se Materialetabel) og overfør dem med Pasteur-pipetter af glas.
    BEMÆRK: Antallet af organismer, der skal placeres, er størrelsesafhængigt; For larvesand dollars, der var ~ 200 μm i størrelse, var 20 individer pr. Mikrocentrifugerør passende.
    FORSIGTIG: Glaspipetter er mere ønskelige end plastpipetter, da nogle planktoniske organismer er hydrofobe og klæber til plastoverflader.
  8. Der tilsættes 0,45 μm filtreret havvand til mikrocentrifugerørene indeholdende dyr, indtil det endelige volumen er 1 ml.
  9. For at give organismerne mulighed for gradvist at varme op til den ønskede eksperimentelle temperatur, anbringes mikrocentrifugerørene med dyr, fremstillet i trin 3.7, i varmeblokken startende fra den kolde ende. Placer par mikrocentrifugerør på hver række (12 rør i alt).
  10. Vent 10 min.
  11. Flyt de par mikrocentrifugerør, der er indsat i trin 3.9, til de tilstødende borede huller med varmere temperaturer. Placer yderligere par mikrocentrifugerør i hver række i den kolde ende. Hver række vil nu have fire rør. Vent yderligere 10 minutter.
  12. Fortsæt med at tilføje mikrocentrifugerør med dyr ved at skifte deres positioner fra den koldere ende til den varmere ende parvis. Vent 10 minutter mellem hvert skift, indtil varmeblokken er helt fyldt.
    BEMÆRK: Trin 3.9-3.12 betragtes som en ramping-up fase for at øge temperaturen oplevet af undersøgelsesorganismerne gradvist.
  13. Lad dyrene inkubere ved den angivne temperatur i 2 timer. Dette trin er eksperimentets konstante temperatureksponeringsfase.
    1. Kontroller temperaturen på mikrocentrifugerørene med et termoelement hver time, hvis inkubationsperioden overstiger 2 timer.
      BEMÆRK: Juster inkubationstiden baseret på de eksperimentelle behov. Hvis inkubationen er længere end 2 timer, skal du kontrollere rørets temperatur med jævne tidsintervaller med et termoelement i tilfælde af uforudsete udstyrsfejl. For at minimere forstyrrelser af undersøgelsesorganismerne skal du tilfældigt placere seks eller flere mikrocentrifugerør, der kun er fyldt med filtreret havvand, i blokken til temperaturovervågning.
  14. Ved afslutningen af inkubationsperioden måles temperaturen inde i hvert mikrocentrifugerør ved hjælp af et termoelement med en K-type elektrode. Bemærk disse temperaturer.
  15. Fjern alle 60 mikrocentrifugerør med dyr, og læg dem i præmærkede holdere.
  16. Rørene inkuberes (trin 3.14) ved den forudbestemte temperatur, såsom opdrætstemperaturen, i 1 time, som er genopretningsperioden.
    BEMÆRK: Restitutionsperioden kan være artsspecifik. For larvesanddollaren var opdrætstemperaturen 18 °C, og prøven blev derfor anbragt i et miljøkammer. Se relevant litteratur og/eller udfør et forsøgseksperiment for at sikre, at antallet af levende:døde ikke blev påvirket af restitutionsperiodens længde. I de repræsentative data var antallet af dyr i live efter 1 time det samme som efter 12 eller 24 timers genopretning.
  17. For at opregne andelen af forsøgsorganismen, der er i live efter den termiske eksponering, overføres indholdet af et individuelt mikrocentrifugerør til en 35 mm petriskål ved hjælp af en glaspipette.
  18. Overhold og bemærk det relative antal individer, der stadig er aktive (levende), og dem, der har beslaglagt svømning eller opløst (død) under et dissekerende mikroskop. Sørg for, at det samlede antal observerede individer svarer til antallet af individer, der placeres i rørene i trin 3.7. Kontroller siden af mikrocentrifugerørene og petriskålen for enkeltpersoner, hvis tallene ikke stemmer overens.

4. Beregning af LT50

  1. Generer en datatabel i CSV-format med mindst følgende overskrifter: gruppering af variabel af interesse, rørets temperatur i °C, antal levende individer og antal døde personer.
    BEMÆRK: For de repræsentative data erstattes grupperingsvariablen af interesse med alder, da målet er at sammenligne mellem aldersgrupper.
  2. For at tilpasse dataene med logistisk regression skal du bruge en generaliseret lineær model med en binomialfordeling. Supplerende kodningsfil 1 viser et eksempel på et script, der bruger open source-softwaren R22.
  3. For at bestemme den gennemsnitlige øvre termiske grænse (LT 50) beregnes forudsigelsesværdien (dvs. temperatur), hvor50% af individerne overlevede. Supplerende kodningsfil 2 viser et eksempelscript ved hjælp af funktionen dose.p fra MASS23 i R22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne protokol er at bestemme den øvre termiske grænse for zooplankton. For at gøre det er der brug for en stabil og lineær termisk gradient. Den foreslåede opsætning var i stand til at generere en termisk gradient fra 14 °C til 40 °C ved at indstille vandbadstemperaturen til 8 °C og varmeapparatet til 39 °C (figur 2A). Temperaturgradienten kan indsnævres og forskydes ved at ændre slutpunktsværdierne. En termisk gradient med et smallere område (19 °C til 37 °C) blev også genereret ved at indstille varmelegemet til 37 °C og vandbadet til 15 °C. Temperaturen i blokken stabiliseres inden for 45 minutter til 1 time efter opsætningen (figur 2B).

For at illustrere anvendelsen af denne protokol på zooplankton blev ændringen i den øvre termiske grænse, angivet med LT50, gennem ontogeni i larverne af sand dollars (Dendraster excentricus) undersøgt. Gravid sand dollars blev opnået kommercielt (se Tabel over materialer). Frigivelsen af gameter blev induceret ved injektion af 0, 5-1 ml 0, 35 M kaliumchlorid. De indsamlede æg blev skyllet gennem 63 μm nylonnet med 0,45 μm filtreret havvand. Sædcellerne blev opsamlet tørre og holdt på is. Æggene blev befrugtet med ~104 sædceller pr. ml. Fælles havekulturer blev skabt med kønsceller fra tre mænd og tre hunner med fem individer pr. ml. Disse larvekulturer blev opbevaret i filtreret havvand med en saltholdighed på 32 psu ved 18 ° C under en 12:12 lys: mørk cyklus med fuldstændig vandskift hver anden dag.

Efterhånden som larvesand udviklede sig, steg den øvre termiske grænse fra 28,6 °C (± 0,02 °C S.E) 2 dage efter befrugtning til 28,8 °C (± 0,02 °C S.E) 4 dage efter befrugtning og 29,3 °C (± 0,02 °C S.E) ved 6 dage efter befrugtning (figur 3). Disse øvre termiske grænser tyder på, at sanddollars lever inden for deres termiske grænse under den gennemsnitlige sommerhavoverfladetemperatur på ~ 20 ° C eller lavere langs Stillehavskysten. Men med stigende hyppighed og intensitet af marine hedebølger fortsætter den maksimale temperatur med at stige. En toptemperatur på 26,4 °C blev registreret i det sydlige Californien Bight i august 2018 (Fumo et al.24). I betragtning af at denne art reproducerer om foråret og sommeren, vil overlevelsen af deres tidlige livsfase sandsynligvis falde under disse ekstreme begivenheder. Det forventede overlevelsestal vil falde med 10 %, når temperaturen når op på 26,5 °C.

Parvise sammenligninger ved hjælp af forholdstesten udviklet af Wheeler et al.25 tyder på, at medianens dødelige temperatur var signifikant forskellig mellem de tre aldersgrupper (p < 0,001). Tidligere stadier (gastrula og tidlige prismer, der var 2 dage gamle) var mere følsomme over for termisk stress end ældre larver. Denne observation antyder, at den termiske grænse, der udledes af et enkelt udviklingstidspunkt, ikke er repræsentativ for den pågældende art gennem hele dens livshistorie.

Figure 1
Figur 1: Mærket diagram over varmeblokken. (A) Opsætningens øverste visning med alle komponenter tilsluttet. (B,D) Placering og tilslutninger til varmeterminalerne. (C,E) Placering af varmeveksleren (køle elemenet) og de tilhørende slanger til vandbadet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Temperaturændringer i varmeblokken over 1 time med endepunkter indstillet til 15 og 37 °C . (A) En lineær gradient blev opnået inden for 1 time. Ændring i slutpunktsindstillingerne varierer temperaturområdet, og det største interval var fra 14 °C til 40 °C. (B) Temperaturforskellen mellem replikerede rækker var ubetydelig (<0,8 °C); data fra to replikerede rækker blev afbildet for hver indstilling i (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Overlevelse af larvesand dollars (Dendraster excentricus) over et temperaturområde på 19 til 37 ° C gennem ontogeni (2, 4 og 6 dage efter befrugtning [dpf]). Hvert datum repræsenterer andelen af larver, der overlevede en 2 timers inkubation ved den specifikke temperatur efterfulgt af en 1 timers restitutionsperiode. En logistisk regression blev udført ved hjælp af den generaliserede lineære model med binomialfordeling i den statistiske software R. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende kodningsfil 1: Et R-script til generering af logistiske kurver for datasættet med et trinvist eksempel. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: Et R-script til at generere LT50-estimater . Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol giver en tilgængelig og tilpasselig tilgang til at bestemme de termiske grænser for små planktonorganismer gennem akut termisk eksponering. Det 10-hullers design og fleksible temperaturendepunkter, der styres af vandbadet i den nedre ende og varmelegemet i den øvre ende, gør det muligt at bestemme LT50 med præcision. Ved hjælp af denne fremgangsmåde kunne der påvises en forskel i den termiske grænse, der er <1 °C (figur 3). Denne fremgangsmåde giver en hurtig bestemmelse af termiske grænser (i timer) for en række arter, og de resulterende værdier er blevet anvendt på flere artsfordelingsmodeller 2,21. Det er dog vigtigt at bemærke, at akut eksponering sandsynligvis giver et andet termisk toleranceestimat sammenlignet med kronisk eksponering 8,26.

En stor fordel ved det nuværende design er, at 10 temperaturbehandlinger og seks replikater er inkluderet i et lille fodaftryk (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm). Tidligere publikationer, der brugte en lignende termisk gradientmetode til at bestemme termiske grænser, brugte aluminiumstænger, der var større (180 cm x 10 cm x 6 cm i 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm i 10 og 60 cm x20 cm i 17). Mens tørre bade, der holder en enkelt temperatur, er mindre (f.eks. 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) og tilbyder flere replikater, kræves der flere enheder (mere end fire) for at generere en præstationskurve, der inkluderer flere temperaturer, eller eksperimenterne skal gentages over tid, hvilket kan introducere forvirrende faktorer. Varmeblokdesignet reducerer både fabrikationsomkostningerne og pladskravene. Fremstillingen kan udføres med en borepresse, eller forskere uden øjeblikkelig adgang til en fræsemaskine kan vælge kommercielle CNC-bearbejdningstjenester. Brugen af kommercielt tilgængelige dele styrer yderligere fremstillingsomkostningerne. Hvis man kan bruge et eksisterende varme- / kølevandsbad eller akvariekølere, udgør de resterende omkostninger ved delene mindre end $ 350. Ellers kan akvariekølere til en 10 gallon (~ 35 L) akvarium købes for < $ 150.

Det nuværende design kan ændres, så det passer til forskerens behov. Hvis målorganismerne er større i størrelse, er scintillationsflasker gode alternative beholdere, og større huller ville være påkrævet. Når det er sagt, er aluminiumsblokken aftagelig i det nuværende design, så flere blokke kan laves og udskiftes for at passe til de eksperimentelle behov. Hvis målet med eksperimentet er at bestemme en lavere termisk grænse eller fokusere på polære organismer, er det mere hensigtsmæssigt at placere kølevandblokke i begge ender af hovedaluminiumblokken.

I lighed med andre undersøgelser af zooplankton omfatter den nuværende protokol ikke en gradvis afkølingsfase20,27. Forskere kan overveje at fjerne mikrocentrifugerørene parvis og flytte dem ned i temperaturgradienten (dvs. vende trin 3.9-3.12) for at opnå gradvis afkøling, hvis deres undersøgelsesorganismer er følsomme over for et pludseligt temperaturfald.

Nytten af denne opsætning kan mindskes af flere faktorer, nemlig valget af (1) slutpunktets temperaturindstillinger, (2) eksponerings- og restitutionsvarigheden og 3) den metrik, der bruges til at bestemme binomialtilstanden (levende vs. død; udviklet vs. ikke-udviklet). For at imødegå disse potentielle begrænsninger anbefales indledende test stærkt.

Da den logistiske regression antager en binomialfordeling, foretrækkes endepunkter med 100% overlevelse og dødelighed. For marine organismer vil et rimeligt udgangsinterval være den gennemsnitlige årlige havoverfladetemperatur på indsamlingsstedet plus 10-15 °C. Man kan derefter indsnævre det temperaturområde, der undersøges efter et sådant indledende forsøg, da jo mindre temperaturforskellen mellem hullerne er, jo mere finjusteret LT50-estimatet .

Varigheden af eksponering og genopretning er artsspecifik. For eksempel tillod Kuo et al.27 unge whelks (Nucella canaliculata) at komme sig i 24 timer, mens Hammond et al.28 tillod larve lilla urchins (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 time til genopretning. Man kunne udføre et kort eksperiment for at afgøre, om antallet af levende: døde varierer mellem genopretningsperioder. Afhængigt af definitionen af den valgte binomialtilstand (f.eks. levende vs. død) er restitutionstid muligvis ikke nødvendig. Hvis målet med eksperimentet er at teste, om udviklingsprocesser, såsom spaltning og gastrulation, forekommer over en række temperaturer. Med andre ord ville den binomiale tilstand, der blev brugt i modellen, blive udviklet versus ikke udviklet 8,19,21. Fikseringsmidler såsom 4% paraformaldehyd skal tilsættes prøverne i den termiske eksponeringsperiode uden restitutionstid.

For at sikre nøjagtig tælling og bestemmelse af binomialtilstand (levende vs. død; udviklet vs. ikke-udviklet) anbefales det at tælle prøverne efter genopretningstiden tilfældigt for at undgå potentielle observatørforstyrrelser . Hvis der er tilstrækkeligt personale, kan forskellige forskere tælle replikatrækker og sammenligne deres resultater. Alternativt kan enkeltpersoner gentagne gange tælle en lille delmængde af prøverne og kontrollere, om tallene er konsistente.

En anden potentiel begrænsning er manglen på fejlestimering af LT50 fra uafhængige prøver29. Den aktuelle dataanalysemetode giver et 95% konfidensinterval langs den tilpassede logistiske kurve (supplerende kodningsfil 1) og en standardfejl for LT50 (supplerende kodningsfil 2). Disse fejlgrænser genereres fra kurvetilpasningsprocessen, ikke gennem flere målinger af individer fra stikprøvepopulationen. I betragtning af det nuværende varmeblokdesign har seks rækker, kan man tilpasse data fra hver række for at generere seks LT50-estimater og få de observationsbaserede fejlestimater.

Sammenfattende præsenteres en tilgængelig tilgang til bestemmelse af akutte termiske grænser, der kan anvendes på en lang række dyreplankton. Denne opsætning kan bruges til at bestemme de termiske grænser for forskellige organismer og til at lokalisere udviklingsstadier, der er sårbare. Disse oplysninger kan hjælpe med at forbedre forudsigelsen af organismens ydeevne og potentielle samfundsinteraktioner i lyset af globale klimaændringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes af fakultetets forskningsfond for Swarthmore College [KC] og Robert Reynolds og Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship for BJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).

Tags

Biologi udgave 189 dødelig temperatur kritisk termisk maksimum øvre termiske grænser global opvarmning varmestress marine hvirvelløse larver
Bestemmelse af termiske grænser for dyreplankton ved hjælp af en varmeblok
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter