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Biology

Bestimmung der thermischen Grenzen für Zooplankton mit einem Wärmeblock

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

Das vorliegende Protokoll veranschaulicht die Verwendung kommerziell erhältlicher Komponenten zur Erzeugung eines stabilen und linearen thermischen Gradienten. Ein solcher Gradient kann dann verwendet werden, um die obere thermische Grenze von Planktonorganismen, insbesondere wirbellosen Larven, zu bestimmen.

Abstract

Thermische Grenzen und Breite wurden häufig verwendet, um die Verbreitung von Arten vorherzusagen. Da die globale Temperatur weiter steigt, ist es wichtig zu verstehen, wie sich die thermische Grenze mit der Akklimatisierung ändert und wie sie zwischen Lebensstadien und Populationen variiert, um die Anfälligkeit von Arten für zukünftige Erwärmung zu bestimmen. Die meisten Meeresorganismen haben komplexe Lebenszyklen, die frühe planktonische Stadien umfassen. Während die Quantifizierung der thermischen Grenze dieser kleinen frühen Entwicklungsstadien (Dutzende bis Hunderte von Mikrometern) hilft, Entwicklungsengpässe zu identifizieren, kann dieser Prozess aufgrund der geringen Größe der Zielorganismen, des großen Platzbedarfs auf der Bank und der hohen anfänglichen Herstellungskosten eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Aufbau vorgestellt, der auf kleine Volumina (ml bis zehn ml) ausgerichtet ist. Dieser Aufbau kombiniert handelsübliche Komponenten, um einen stabilen und linearen thermischen Gradienten zu erzeugen. Produktionsspezifikationen des Aufbaus sowie Verfahren zur Einführung und Zählung lebender und toter Individuen und zur Berechnung der tödlichen Temperatur werden ebenfalls vorgestellt.

Introduction

Die thermische Toleranz ist der Schlüssel zum Überleben und zur Funktion von Organismen 1,2. Da sich der Planet aufgrund anthropogener Kohlenstoffemissionen weiter erwärmt, wird der Bestimmung und Anwendung thermischer Grenzwerte zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt3. Verschiedene Endpunkte wie Mortalität, Entwicklungsstörungen und Mobilitätsverlust wurden verwendet, um sowohl die oberen als auch die unteren thermischen Grenzen zu bestimmen4. Diese thermischen Grenzen werden oft als Proxy für die thermische Nische eines Organismus angesehen. Diese Informationen werden wiederum verwendet, um Arten zu identifizieren, die anfälliger für die globale Erwärmung sind, sowie die zukünftige Artenverteilung und die daraus resultierenden Arteninteraktionenvorherzusagen 3,5,6,7. Die Bestimmung thermischer Grenzen, insbesondere für kleine planktonische Organismen, kann jedoch eine Herausforderung darstellen.

Für planktonische Organismen, insbesondere die Larvenstadien mariner Wirbelloser, kann die thermische Grenze durch chronische Exposition bestimmt werden. Chronische Exposition wird erreicht, indem Larven bei mehreren Temperaturen über Tage bis Wochen aufgezogen werden und die Temperatur bestimmt wird, bei der das Überleben und/oder die Entwicklungsrate der Larven abnimmt 8,9,10. Dieser Ansatz ist jedoch ziemlich zeitaufwendig und erfordert große Inkubatoren und Erfahrung in der Larvenzucht (siehe Referenz11 für eine gute Einführung in die Kultivierung mariner wirbelloser Larven).

Alternativ kann die akute Exposition gegenüber thermischer Belastung zur Bestimmung thermischer Grenzen verwendet werden. Häufig beinhaltet dieser Bestimmungsansatz die Platzierung kleiner Fläschchen mit Larven in temperaturgesteuerten Trockenbädern 12,13,14, die Nutzung thermischer Gradientenfunktionen in PCR-Thermocyclern15,16 oder das Aufstellen von Glasfläschchen/Mikrozentrifugenröhrchen entlang eines thermischen Gradienten, der durch Erhitzen und Abkühlen an den Enden großer Aluminiumblöcke mit Löchern erzeugt wird, in die die Fläschchen eng passen 17, 18,19. Typische Trockenbäder erzeugen eine einzige Temperatur; Daher müssen mehrere Einheiten gleichzeitig betrieben werden, um die Leistung über einen Temperaturbereich zu bewerten. Thermocycler erzeugen einen Gradienten, nehmen aber nur ein kleines Probenvolumen (120 μL) auf und erfordern sorgfältige Manipulationen. Ähnlich wie Thermocycler erzeugen große Aluminiumblöcke lineare und stabile Temperaturgradienten. Beide Ansätze können mit logistischer oder Probit-Regression gekoppelt werden, um die tödliche Temperatur für 50% Prozent der Bevölkerung zu berechnen (LT50)12,20,21. Die verwendeten Aluminiumblöcke waren jedoch ~100 cm lang; Diese Größe erfordert einen großen Laborraum und Zugang zu spezialisierten numerisch gesteuerten Fräsmaschinen zur Bohrung der Löcher. Zusammen mit der Verwendung von zwei Wasserbädern in Forschungsqualität zur Aufrechterhaltung der Zieltemperatur sind die finanziellen Kosten für die Montage des Setups hoch.

Daher zielt diese Arbeit darauf ab, ein alternatives Mittel zur Erzeugung eines stabilen, linearen Temperaturgradienten mit kommerziell erhältlichen Teilen zu entwickeln. Ein solches Produkt muss einen geringen Platzbedarf haben und sollte leicht für Experimente zur akuten thermischen Stressexposition von Planktonorganismen verwendet werden können. Dieses Protokoll wurde mit Zooplankton entwickelt, das als Zielorganismen <1 mm groß ist, und wurde daher für die Verwendung eines 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens optimiert. Größere Studienorganismen benötigen Behälter, die größer sind als die verwendeten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und vergrößerte Löcher in den Aluminiumblöcken.

Neben der Verbesserung des Zugangs zu den experimentellen Geräten zielt diese Arbeit darauf ab, die Datenverarbeitungspipeline zu vereinfachen. Während kommerzielle Statistiksoftware Routinen zur Berechnung von LT50 mittels logistischer oder Probit-Regression bereitstellt, sind die Lizenzkosten nicht trivial. Daher würde ein einfach zu bedienendes Skript, das auf dem Open-Source-Statistikprogramm R22 basiert, die Datenanalyse zugänglicher machen.

Dieses Protokoll zeigt, wie ein kompakter Wärmeblock mit handelsüblichen Teilen hergestellt und angewendet werden kann, um Zooplankton (Larven des Sanddollars Dendraster excentricus) akutem Hitzestress auszusetzen, um seine obere thermische Grenze zu bestimmen.

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Protocol

1. Herstellung des Wärmeblocks

  1. Verkabeln Sie den 120 V, 100 W Heizstreifen mit dem Rheostat (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie den 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 Zoll x 5 Zoll x 2 Zoll) Aluminiumblock vor, indem Sie 60 Löcher in ein 6 x 10 Raster bohren (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass die Löcher 2 cm von Mitte zu Mitte in beide Richtungen verteilt sind. Jeder sollte einen Durchmesser von 1,1 cm haben und 4,2 cm tief sein (Abbildung 1).
    HINWEIS: Führen Sie das Bohren auf einer Fräsmaschine oder Bohrpresse mit Schnellarbeitsstahlbohrern durch. Heizelement und Kühlelement wurden beide so gewählt, dass sie so viel wie möglich von der Kontaktfläche der 15,2 cm x 5 cm großen Flächen abdecken.
  3. Bohren Sie zwei zusätzliche Löcher auf einer der 20,3 cm x 5 cm großen Oberflächen zwischen der 1. und 2. Säule und der 9. und 10. Säule, die der Größe der Temperaturreglersonden entsprechen (siehe Materialtabelle).
  4. Konstruieren Sie ein Gehäuse aus 1,2 cm (0,5 Zoll) klaren Acrylplatten (siehe Materialtabelle), um sowohl die Elemente an Ort und Stelle zu halten als auch den fertigen Wärmeblock zu isolieren. Verwenden Sie zwei Schichten Acryl, um die Rückseite des Heizelements zu isolieren (Abbildung 1).
  5. Tragen Sie in der Endmontage Wärmeleitpaste auf (siehe Materialtabelle), um die Wärmeleitfähigkeit vom Heizelement in den Block und vom Block zum Kühlelement zu maximieren.

2. Bestimmung der thermischen Gradienteneinstellungen

  1. Verbinden Sie den Wasserbad-/Aquarienkühler mit dem Tygon-Schlauch (siehe Materialtabelle). Isolieren Sie den Schlauch nach Bedarf mit einer Schaumrohrisolierung.
  2. Führen Sie die Thermostatsonde in die Löcher an der Seite des Aluminiumblocks ein. Stellen Sie sicher, dass Sonde 1 in der Nähe des Heizelements positioniert ist.
  3. In alle gefrästen Löcher (insgesamt 60 Röhrchen) gefüllte Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) mit Leitungswasser gefüllt.
  4. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie die Heiztemperatur von Sonde 1 auf 35-37 °C und Sonde 2 auf 21,5-22,5 °C ein.
    HINWEIS: Der vorgeschlagene Thermostat verfügt über zwei Steckdosen, die unabhängig voneinander arbeiten. Nur Sonde 1 wird in diesem speziellen Anwendungsfall zur Regulierung der warmen Temperatur verwendet. Stellen Sie daher die Temperatur von Sonde 2 auf die Temperatur am unteren Ende ein.
  5. Drehen Sie den Rheostat, um das Heizelement einzuschalten, und stellen Sie es auf mittel.
  6. Schalten Sie den Wasserbad-/Aquarienkühler ein und stellen Sie die Temperatur des Kühlers auf 15 °C ein.
  7. Überprüfen Sie, ob der Block an einem Ende warm und am anderen Ende nach 10 Minuten abkühlt.
    ACHTUNG: Die freiliegenden Enden des Heizelements können heiß sein; Berühren Sie sie nicht.
  8. Überprüfen Sie danach alle 10 Minuten die Temperatur in jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Thermoelement mit einer Elektrode vom Typ K (siehe Materialtabelle). Die Temperatur stabilisiert sich nach ~60 min und erscheint linear (Abbildung 2).
  9. Passen Sie die Werte der Endpunkte an, indem Sie die Einstellungen des Temperaturreglers und des Wasserbades nach Bedarf ändern.

3. Wärmeexposition und Leben:Tot-Zählung

HINWEIS: Schritt 2 kann weggelassen werden, sobald die gewünschten Einstellungen für den Temperaturgradienten festgelegt wurden.

  1. Schalten Sie das Umlaufwasserbad und die Heizung ein und stellen Sie sie auf 15 °C bzw. 37 °C ein, um einen Temperaturgradienten von 19,5 °C bis 37 °C zu erzeugen.
  2. Um sicherzustellen, dass der thermische Gradient linear ist, platzieren Sie Mikrozentrifugenröhrchen, die bis zum Rand (1,5 ml) mit Leitungswasser gefüllt sind, in alle gefrästen Löcher (insgesamt 60 Röhrchen).
  3. Lassen Sie den Heizblock die eingestellte Temperatur erreichen, indem Sie 45-60 min warten. Überprüfen Sie die Temperatur in jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Thermoelement mit einer K-Elektrode, um festzustellen, ob es die erwartete Temperatur erreicht hat. Beachten Sie diese Temperaturen.
  4. Wenn die Studienorganismen >500 μm groß sind und leicht von einem Behälter in einen anderen (z. B. einen Ruderfußkrebs) übertragen werden können, füllen Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 750 μL 0,45 μm gefiltertem Meerwasser. Alternativ, wenn die Studienorganismen klein sind, füllen Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 μL 0,45 μm gefiltertem Meerwasser.
    HINWEIS: Für die repräsentativen Daten wurden Larven der Sanddollar-Dendraster-Exzentriker verwendet, die 2, 4 und 6 Tage nach der Befruchtung sind (siehe Materialtabelle). Die durchschnittliche Größe (± S.D., n = 15 für jedes Alter) dieser Individuen betrug 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm bzw. 292 ± 14 μm. Da diese Larven leicht konzentriert werden können (Schritt 3.5), wurden die Mikrozentrifugenröhrchen mit 750 μL gefiltertem Meerwasser gefüllt.
  5. Konzentrieren Sie die Kultur der Studienorganismen mit umgekehrter Filterung (d. h. legen Sie das Netz in den Behälter, in dem sich die Studienorganismen befinden, und entfernen Sie Wasser durch die Oberseite des Netzes), so dass die Studienorganismen im Boden des Becherglases11 verbleiben.
    HINWEIS: Für die untersuchten Larvensanddollars wurde ein 30-μm-Nylonnetz verwendet (siehe Materialtabelle).
  6. Spülen Sie die konzentrierte Tierprobe mit gefiltertem Meerwasser (z. B. bei der Kultivierung mit Algenfutter oder anderen Chemikalien). Wiederholen Sie die Rückwärtsfilterung noch einmal, um die Tierprobe zu konzentrieren.
  7. Legen Sie eine bekannte Anzahl einzelner Organismen in die halbgefüllten Mikrozentrifugenröhrchen. Zählen Sie die kleinen Planktonorganismen unter einem Seziermikroskop (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie mit Pasteurpipetten aus Glas.
    HINWEIS: Die Anzahl der zu platzierenden Organismen ist größenabhängig; Für Larvensanddollar, die ~200 μm groß waren, waren 20 Individuen pro Mikrozentrifugenröhrchen angemessen.
    VORSICHT: Glaspipetten sind wünschenswerter als Kunststoffpipetten, da einige planktonische Organismen hydrophob sind und an Kunststoffoberflächen haften.
  8. 0,45 μm gefiltertes Meerwasser in die Mikrozentrifugenröhrchen mit Tieren geben, bis das Endvolumen 1 ml beträgt.
  9. Damit sich die Organismen allmählich auf die gewünschte Versuchstemperatur erwärmen können, legen Sie die in Schritt 3.7 vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen mit Tieren beginnend vom kalten Ende in den Wärmeblock. Legen Sie Paare von Mikrozentrifugenröhrchen auf jede Reihe (insgesamt 12 Röhrchen).
  10. Warten Sie 10 Min.
  11. Bewegen Sie die in Schritt 3.9 eingeführten Mikrozentrifugenröhrchen in die benachbarten Bohrlöcher mit wärmeren Temperaturen. Platzieren Sie zusätzliche Paare von Mikrozentrifugenröhrchen in jeder Reihe am kalten Ende. Jede Reihe hat nun vier Röhren. Warten Sie weitere 10 Minuten.
  12. Fügen Sie weiterhin Mikrozentrifugenröhrchen mit Tieren hinzu, indem Sie ihre Positionen paarweise vom kälteren Ende zum wärmeren Ende verschieben. Warten Sie 10 Minuten zwischen jeder Schicht, bis der Heizblock vollständig gefüllt ist.
    HINWEIS: Die Schritte 3.9-3.12 gelten als Anlaufphase, um die Temperatur der untersuchten Organismen schrittweise zu erhöhen.
  13. Lassen Sie die Tiere bei der vorgesehenen Temperatur für 2 h inkubieren. Dieser Schritt ist die konstante Temperaturexpositionsphase des Experiments.
    1. Überprüfen Sie die Temperatur der Mikrozentrifugenröhrchen stündlich mit einem Thermoelement, wenn die Inkubationszeit 2 h überschreitet.
      HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit an die experimentellen Anforderungen an. Wenn die Inkubationszeit länger als 2 h dauert, überprüfen Sie die Temperatur der Rohre in regelmäßigen Zeitabständen mit einem Thermoelement im Falle eines unvorhergesehenen Geräteausfalls. Um die Störung der Studienorganismen zu minimieren, platzieren Sie zufällig sechs oder mehr Mikrozentrifugenröhrchen, die nur mit gefiltertem Meerwasser gefüllt sind, zur Temperaturüberwachung in den Block.
  14. Messen Sie am Ende der Inkubationszeit die Temperatur in jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Thermoelement mit einer K-Elektrode. Beachten Sie diese Temperaturen.
  15. Entfernen Sie alle 60 Mikrozentrifugenröhrchen mit Tieren und legen Sie sie in vorbeschriftete Halter.
  16. Inkubieren Sie die Röhrchen (Schritt 3.14) bei der vorgegebenen Temperatur, z. B. der Aufzuchttemperatur, für 1 h, was der Erholungsphase entspricht.
    HINWEIS: Die Erholungsphase kann artspezifisch sein. Für den Larvensanddollar betrug die Aufzuchttemperatur 18 °C, so dass die Probe in eine Klimakammer gegeben wurde. Konsultieren Sie einschlägige Literatur und/oder führen Sie ein Probeexperiment durch, um sicherzustellen, dass die Anzahl lebend:tot nicht durch die Länge der Erholungsphase beeinflusst wurde. In den repräsentativen Daten war die Anzahl der nach 1 h lebenden Tiere die gleiche wie nach 12 oder 24 h Genesung.
  17. Um den Anteil des Studienorganismus zu zählen, der nach der thermischen Exposition am Leben ist, wird der Inhalt eines einzelnen Mikrozentrifugenröhrchens mit einer Glaspipette auf eine 35 mm große Petrischale überführt.
  18. Beobachten und notieren Sie die relative Anzahl der Individuen, die noch aktiv (am Leben) sind und diejenigen, die schwimmend gegriffen oder sich unter einem Seziermikroskop aufgelöst haben (tot). Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der beobachteten Individuen der Anzahl der in Schritt 3.7 in die Röhrchen eingesetzten Individuen entspricht. Überprüfen Sie die Seite der Mikrozentrifugenröhrchen und der Petrischale auf Personen, wenn die Zahlen nicht übereinstimmen.

4. Berechnung von LT50

  1. Generieren Sie eine Datentabelle im CSV-Format mit mindestens den folgenden Überschriften: Gruppierungsvariable von Interesse, Temperatur der Röhre in °C, Anzahl der lebenden Individuen und Anzahl der toten Individuen.
    HINWEIS: Für die repräsentativen Daten wird die interessierende Gruppierungsvariable durch das Alter ersetzt, da das Ziel darin besteht, zwischen Altersgruppen zu vergleichen.
  2. Um die Daten an die logistische Regression anzupassen, verwenden Sie ein verallgemeinertes lineares Modell mit einer Binomialverteilung. Ergänzende Kodierungsdatei 1 zeigt ein Beispielskript mit der Open-Source-Software R22.
  3. Um die mittlere obere thermische Grenze (LT 50) zu bestimmen, berechnen Sie den Prädiktorwert (d. H. Temperatur), bei dem50% der Individuen überlebten. Ergänzende Kodierungsdatei 2 zeigt ein Beispielskript mit der Funktion dose.p aus der MASS23 in R22.

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Representative Results

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die obere thermische Grenze des Zooplanktons zu bestimmen. Dazu ist ein stabiler und linearer thermischer Gradient erforderlich. Der vorgeschlagene Aufbau war in der Lage, einen thermischen Gradienten von 14 °C bis 40 °C zu erzeugen, indem die Wasserbadtemperatur auf 8 °C und die Heizung auf 39 °C eingestellt wurde (Abbildung 2A). Der Temperaturgradient kann durch Ändern der Endpunktwerte verengt und verschoben werden. Ein thermischer Gradient mit einem engeren Bereich (19 °C bis 37 °C) wurde ebenfalls erzeugt, indem die Heizung auf 37 °C und das Wasserbad auf 15 °C eingestellt wurden. Die Temperatur im Block stabilisiert sich innerhalb von 45 Minuten bis 1 Stunde nach der Einrichtung (Abbildung 2B).

Um die Anwendung dieses Protokolls auf Zooplankton zu veranschaulichen, wurde die Änderung der oberen thermischen Grenze, angezeigt durch LT50, durch Ontogenese in den Larven der Sanddollars (Dendraster excentricus) untersucht. Gravid Sanddollars wurden kommerziell gewonnen (siehe Tabelle der Materialien). Die Freisetzung von Gameten wurde durch Injektion von 0,5-1 ml 0,35 M Kaliumchlorid induziert. Die gesammelten Eier wurden durch 63 μm Nylonnetz mit 0,45 μm gefiltertem Meerwasser gespült. Das Sperma wurde trocken gesammelt und auf Eis gehalten. Die Eier wurden bei ~104 Spermien pro ml befruchtet. Gemeinsame Gartenkulturen wurden mit Gameten von drei Männchen und drei Weibchen bei fünf Individuen pro ml geschaffen. Diese Larvenkulturen wurden in gefiltertem Meerwasser mit einem Salzgehalt von 32 psu bei 18 °C unter einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 mit vollständigem Wasserwechsel jeden zweiten Tag gehalten.

Als sich Larvensanddollars entwickelten, stieg die obere thermische Grenze von 28,6 °C (± 0,02 °C S.E) 2 Tage nach der Befruchtung auf 28,8 °C (± 0,02 °C S.E) 4 Tage nach der Befruchtung und 29,3 °C (± 0,02 °C S.E) 6 Tage nach der Befruchtung (Abbildung 3). Diese oberen thermischen Grenzen deuten darauf hin, dass Sanddollars während der durchschnittlichen Sommertemperatur der Meeresoberfläche von ~ 20 ° C oder niedriger entlang der Pazifikküste innerhalb ihrer thermischen Grenze leben. Mit zunehmender Häufigkeit und Intensität mariner Hitzewellen steigt die Höchsttemperatur jedoch weiter an. Eine Spitzentemperatur von 26,4 °C wurde im August 2018 in der Southern California Bight aufgezeichnet (Fumo et al.24). Da sich diese Arten im Frühjahr und Sommer vermehren, wird das Überleben ihrer frühen Lebensphase während dieser Extremereignisse wahrscheinlich abnehmen. Die vorhergesagte Überlebensrate würde um 10% sinken, wenn die Temperatur 26,5 ° C erreicht.

Paarweise Vergleiche mit dem von Wheeler et al.25 entwickelten Verhältnistest deuten darauf hin, dass die mediane letale Temperatur zwischen den drei Altersgruppen signifikant unterschiedlich war (p < 0,001). Frühere Stadien (Gastula und frühe Prismen, die 2 Tage alt waren) waren empfindlicher gegenüber thermischem Stress als ältere Larven. Diese Beobachtung legt nahe, dass die thermische Grenze, die von einem einzigen Zeitpunkt der Entwicklung abgeleitet wird, nicht repräsentativ für diese Art während ihrer gesamten Lebensgeschichte ist.

Figure 1
Abbildung 1: Beschriftetes Diagramm des Heizblocks. (A) Draufsicht des Setups mit allen angeschlossenen Komponenten. (B,D) Platzierung und Anschlüsse für die Heizklemmen. (C,E) Platzierung des Wärmetauschers (Kühlelement) und der zugehörigen Schläuche zum Wasserbad. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Temperaturänderungen im Wärmeblock über 1 h mit Endpunkten auf 15 und 37 °C . (A) Innerhalb von 1 h wurde ein linearer Gradient erreicht. Die Änderung der Endpunkteinstellungen variiert den Temperaturbereich, und der größte Bereich lag zwischen 14 °C und 40 °C. (B) Der Temperaturunterschied zwischen den Replikationsreihen war vernachlässigbar (<0,8 °C); Daten aus zwei Replikationszeilen wurden für jede Einstellung in (B) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Überleben von Larvensanddollars (Dendraster excentricus) über einen Temperaturbereich von 19 bis 37 °C durch Ontogenese (2, 4 und 6 Tage nach der Befruchtung [dpf]). Jedes Datum stellt den Anteil der Larven dar, die eine 2-stündige Inkubation bei der spezifischen Temperatur gefolgt von einer 1-stündigen Erholungsphase überlebt haben. Eine logistische Regression wurde unter Verwendung des verallgemeinerten linearen Modells mit Binomialverteilung in der statistischen Software R durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: Ein R-Skript zum Generieren von Logistikkurven für den Datensatz mit einem Schritt-für-Schritt-Beispiel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 2: Ein R-Skript zum Generieren von LT50-Schätzungen . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Dieses Protokoll bietet einen zugänglichen und anpassbaren Ansatz zur Bestimmung der thermischen Grenzen von kleinen Planktonorganismen durch akute thermische Exposition. Das 10-Loch-Design und die flexiblen Temperaturendpunkte, die durch das Wasserbad am unteren Ende und die Heizung am oberen Ende gesteuert werden, ermöglichen eine präzise Bestimmung des LT50. Mit diesem Ansatz konnte ein Unterschied in der thermischen Grenze von <1 °C festgestellt werden (Abbildung 3). Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle Bestimmung der thermischen Grenzen (in Stunden) für eine Vielzahl von Arten, und die resultierenden Werte wurden auf mehrere Speziesverteilungsmodelleangewendet 2,21. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die akute Exposition wahrscheinlich eine andere thermische Toleranzschätzung liefert als die chronische Exposition 8,26.

Ein großer Vorteil des aktuellen Designs besteht darin, dass 10 Temperaturbehandlungen und sechs Replikate auf einer kleinen Stellfläche (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm) enthalten sind. Frühere Publikationen, die einen ähnlichen thermischen Gradientenansatz zur Bestimmung der thermischen Grenzen verwendeten, verwendeten Aluminiumstangen, die größer waren (180 cm x 10 cm x 6 cm in 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm in 10 und 60 cm x 20 cm in17). Während Trockenbäder, die eine einzelne Temperatur halten, kleiner sind (z. B. 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) und mehrere Replikate bieten, sind mehrere Einheiten (mehr als vier) erforderlich, um eine Leistungskurve zu erstellen, die mehrere Temperaturen enthält, oder die Experimente müssen im Laufe der Zeit wiederholt werden, was Störfaktoren verursachen könnte. Das Heizblockdesign reduziert sowohl die Herstellungskosten als auch den Platzbedarf. Die Fertigung kann mit einer Bohrmaschine abgeschlossen werden, oder Forscher ohne unmittelbaren Zugang zu einer Fräsmaschine könnten sich für kommerzielle CNC-Bearbeitungsdienste entscheiden. Die Verwendung handelsüblicher Teile kontrolliert die Herstellungskosten zusätzlich. Wenn man ein vorhandenes Heiz- / Kühlwasserbad oder Aquarienkühler verwenden kann, belaufen sich die verbleibenden Kosten der Teile auf weniger als 350 US-Dollar. Ansonsten können Aquarienkühler für ein 10 Gallonen (~ 35 L) Aquarium für < $ 150 gekauft werden.

Das aktuelle Design kann an die Bedürfnisse des Forschers angepasst werden. Wenn die Zielorganismen größer sind, sind Szintillationsfläschchen gute alternative Behälter, und größere Löcher wären erforderlich. Das heißt, der Aluminiumblock ist im aktuellen Design abnehmbar, so dass mehrere Blöcke hergestellt und ausgetauscht werden können, um den experimentellen Anforderungen gerecht zu werden. Wenn das Ziel des Experiments darin besteht, eine untere thermische Grenze zu bestimmen oder sich auf polare Organismen zu konzentrieren, ist es angemessener, Kühlwasserblöcke an beiden Enden des Aluminiumhauptblocks zu platzieren.

Ähnlich wie bei anderen Studien über Zooplankton sieht das derzeitige Protokoll keine allmähliche Abkühlphase20,27 vor. Die Forscher können erwägen, die Mikrozentrifugenröhrchen paarweise zu entfernen und sie den Temperaturgradienten nach unten zu verschieben (dh die Schritte 3.9-3.12 umzukehren), um eine allmähliche Abkühlung zu erreichen, wenn ihre Studienorganismen empfindlich auf einen plötzlichen Temperaturabfall reagieren.

Der Nutzen dieses Aufbaus kann durch mehrere Faktoren verringert werden, nämlich die Wahl von (1) den Einstellungen der Endpunkttemperatur, (2) der Exposition und Erholungsdauer und 3) der Metrik, die zur Bestimmung des Binomialzustands verwendet wird (lebend vs. tot; entwickelt vs. nicht entwickelt). Um diese potenziellen Einschränkungen zu beheben, werden vorläufige Tests dringend empfohlen.

Da die logistische Regression von einer Binomialverteilung ausgeht, werden Endpunkte mit 100% Überleben und Mortalität bevorzugt. Für Meeresorganismen wäre ein vernünftiger Ausgangspunkt die mittlere jährliche Meeresoberflächentemperatur der Sammelstelle plus 10-15 °C. Man kann dann den untersuchten Temperaturbereich nach einem solchen ersten Versuch eingrenzen, denn je kleiner der Temperaturunterschied zwischen den Bohrungen ist, desto feiner abgestimmt ist die LT50-Schätzung .

Die Expositionsdauer und die Erholung sind artspezifisch. Zum Beispiel erlaubten Kuo et al.27 juvenilen Wellhornschnecken (Nucella canaliculata), sich für 24 h zu erholen, während Hammond et al.28 Larven purpurigeln (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 h zur Erholung erlaubten. Man könnte ein kurzes Experiment durchführen, um festzustellen, ob sich die Live:Dead-Zählung zwischen den Erholungsperioden unterscheidet. Abhängig von der Definition des gewählten Binomialzustands (z. B. lebend vs. tot) ist eine Wiederherstellungszeit möglicherweise nicht erforderlich. Wenn das Ziel des Experiments darin besteht, zu testen, ob Entwicklungsprozesse wie Spaltung und Gastrulation über einen Temperaturbereich hinweg ablaufen. Mit anderen Worten, der im Modell verwendete Binomialzustand wäre entwickelt und nicht entwickelt 8,19,21. Fixiermittel wie 4% Paraformaldehyd müssen den Proben während der thermischen Expositionszeit ohne Erholungszeit zugesetzt werden.

Um eine genaue Zählung und Bestimmung des Binomialzustands (lebend vs. tot; entwickelt vs. nicht entwickelt) zu gewährleisten, ist es ratsam, die Proben nach der Erholungszeit in zufälliger Reihenfolge zu zählen, um potenzielle Beobachterverzerrungen zu vermeiden . Wenn genügend Personal vorhanden ist, könnten verschiedene Forscher Replikationsreihen zählen und ihre Ergebnisse vergleichen. Alternativ können Einzelpersonen wiederholt eine kleine Teilmenge der Stichproben zählen und überprüfen, ob die Zahlen konsistent sind.

Eine weitere mögliche Einschränkung ist die fehlende Fehlerschätzung des LT50 aus unabhängigen Stichproben29. Die aktuelle Datenanalysemethode liefert ein 95%-Konfidenzintervall entlang der angepassten Logistikkurve (Supplementary Coding File 1) und einen Standardfehler des LT50 (Supplementary Coding File 2). Diese Fehlergrenzen werden aus dem Kurvenanpassungsprozess generiert, nicht durch mehrere Messungen von Individuen aus der Stichprobenpopulation. Da das aktuelle Heatblock-Design sechs Zeilen hat, kann man Daten aus jeder Zeile anpassen, um sechs LT50-Schätzungen zu generieren und die beobachtungsbasierten Fehlerschätzungen zu erhalten.

Zusammenfassend wird ein zugänglicher Ansatz zur Bestimmung akuter thermischer Grenzen vorgestellt, der auf eine Vielzahl von Zooplankton angewendet werden kann. Dieser Aufbau kann verwendet werden, um die thermischen Grenzen verschiedener Organismen zu bestimmen und Entwicklungsstadien zu lokalisieren, die anfällig sind. Diese Informationen können dazu beitragen, die Vorhersage der Leistung von Organismen und potenzieller Interaktionen zwischen Gemeinschaften angesichts des globalen Klimawandels zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird vom Faculty Research Fund des Swarthmore College [KC] und dem Robert Reynolds und Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship für BJ unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).

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Biologie Ausgabe 189 tödliche Temperatur kritisches thermisches Maximum obere thermische Grenzen globale Erwärmung Hitzestress marine wirbellose Larven
Bestimmung der thermischen Grenzen für Zooplankton mit einem Wärmeblock
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Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

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