Summary
本协议说明了使用市售组件来产生稳定和线性的热梯度。然后，这种梯度可用于确定浮游生物，特别是无脊椎动物幼虫的热上限。
Abstract
热极限和广度已被广泛用于预测物种分布。随着全球气温的持续上升，了解热极限如何随着驯化而变化以及它在生命阶段和种群之间如何变化对于确定物种对未来变暖的脆弱性至关重要。大多数海洋生物具有复杂的生命周期，包括早期浮游阶段。虽然量化这些小的早期发育阶段（数十到数百微米）的热极限有助于识别发育瓶颈，但由于目标生物体体积小、工作台空间要求大以及初始制造成本高，这一过程可能具有挑战性。这里介绍了一种面向小体积（mL至数十mL）的设置。该设置结合了市售组件，以产生稳定和线性的热梯度。还介绍了该装置的生产规格，以及引入和枚举活体与死体以及计算致死温度的程序。
Introduction
耐热性是生物生存和功能的关键1，2。随着人为碳排放导致地球继续变暖，热极限的确定和应用越来越受到关注3.各种终点，如死亡率、发育迟缓和活动能力丧失，已被用于确定热上限和下限4。这些热极限通常被认为是生物体热生态位的代表。这些信息反过来用于识别更容易受到全球变暖影响的物种，以及预测未来的物种分布和由此产生的物种相互作用3，5，6，7。然而，确定热极限，特别是对于小型浮游生物，可能具有挑战性。
对于浮游生物，特别是海洋无脊椎动物的幼虫阶段，可以通过长期暴露来确定热极限。慢性暴露是通过在数天至数周内在几个温度下饲养幼虫并确定幼虫存活率和/或发育率降低的温度来实现的8，9，10。然而，这种方法相当耗时，需要大型孵化器和幼虫饲养经验（有关培养海洋无脊椎动物幼虫的良好介绍，请参见参考文献11）。
或者，急性暴露于热应力可用于确定热极限。通常，这种测定方法涉及将带有幼虫的小瓶放入温控干浴12，13，14中，利用PCR热循环仪15，16中的热梯度功能，或将玻璃小瓶/微量离心管沿着施加加热和冷却产生的热梯度放置在大铝块的末端，这些铝块带有小瓶紧贴的孔17， 18，19.典型的干浴产生单一温度;因此，必须同时运行多个单元，以评估不同温度范围内的性能。热循环仪产生梯度，但只能容纳少量样品（120 μL），并且需要仔细操作。与热循环仪类似，大型铝块可产生线性且稳定的温度梯度。这两种方法都可以与逻辑或概率回归相结合，以计算50%人口（LT50）的致死温度12，20，21。但是，使用的铝块长~100厘米;这种尺寸需要较大的实验室空间，并使用专门的计算机数控铣床来钻孔。再加上使用两个研究级水浴来保持目标温度，组装装置的财务成本很高。
因此，这项工作旨在开发一种替代方法，以使用市售部件生成稳定的线性温度梯度。这种产品必须具有较小的占地面积，并且应该能够轻松用于浮游生物的急性热应力暴露实验。该协议是用大小为<1 mm的浮游动物作为目标生物开发的，因此，它针对使用1.5或2 mL微量离心管进行了优化。较大的研究生物体将需要大于所用 1.5 mL 微量离心管的容器和铝块上的扩大孔。
除了使实验装置更易于访问之外，这项工作还旨在简化数据处理管道。虽然商业统计软件提供了使用逻辑或概率回归计算LT50 的例程，但许可成本并非微不足道。因此，依赖于开源统计程序R22 的易于使用的脚本将使数据分析更易于访问。
该协议展示了如何使用市售部件制造紧凑的加热块，并应用于将浮游动物（沙美元 Dendraster excentricus的幼虫）暴露于急性热应激以确定其热上限。
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Protocol
1. 加热块的制造
- 将 120 V、100 W 带状加热器连接到变阻器（参见 材料表）。
- 通过在 6 x 10 网格中钻 60 个孔来准备 20.3 厘米 x 15.2 厘米 x 5 厘米（8 英寸 x 5 英寸 x 2 英寸）铝块（请参阅 材料表）。确保孔在两个方向上从中心到中心间隔 2 厘米。每个直径应为1.1厘米，深4.2厘米（图1）。
注意： 使用高速钢钻头在铣床或钻床上进行钻孔。加热元件和冷却元件的选择都尽可能多地覆盖 15.2 cm x 5 cm 表面的接触面。 - 在第 1列和第2 列以及第 9 列和第 10列之间的 20.3 cm x 5 cm 表面上钻两个额外的孔，与温度控制器探头的尺寸相匹配（参见材料表）。
- 用 1.2 厘米（0.5 英寸）的透明亚克力板（见 材料表）构建一个外壳，以将元件固定到位并绝缘完成的加热块。使用两层丙烯酸来绝缘加热元件的背面（图1）。
- 在最终装配中，涂上导热膏（见 材料表），以最大限度地提高从加热元件到块以及从块到冷却元件的热传导。
2. 确定热梯度设置
- 将水浴/水族箱冷却器与Tygon管连接（见 材料表）。根据需要用泡沫管绝缘材料对管道进行绝缘。
- 将恒温器探头插入铝块侧面的孔中。确保探头 1 位于加热元件附近。
- 将装有自来水的微量离心管放入所有铣削孔（总共 60 个管）中。
- 打开温度控制器，将探头1的停止加热温度设置为35-37°C，探头2的停止加热温度设置为21.5-22.5°C。
注意：建议的恒温器有两个独立运行的插座;在此特定用例中，仅使用探头 1 来调节暖温。因此，将探头 2 的温度设置为低端温度的温度。 - 旋转变阻器以打开加热元件并将其设置为中等。
- 打开水浴/水族箱冷却器并将冷却器温度设置为15°C。
- 10分钟后检查块的一端是否温暖，另一端是否冷却。
注意：加热元件的暴露端可能很热;不要触摸它们。 - 之后每10分钟使用带有K型电极的热电偶（参见 材料表）检查每个微量离心管内的温度。温度将在~60分钟后稳定并呈线性（图2）。
- 根据需要通过更改温度控制器和水浴的设置来调整端点的值。
3. 热暴露和活：死枚举
注意：确定所需的温度梯度设置后，可以省略步骤2。
- 打开循环水浴和加热器，分别设置为15°C和37°C，以产生从19.5°C到37°C的温度梯度。
- 为确保热梯度呈线性，请将装有自来水的微量离心管放入所有铣削孔（共 60 个管）中。
- 让加热块等待45-60分钟达到设定温度。使用带有K型电极的热电偶检查每个微量离心管内的温度，以查看其是否达到预期温度。注意这些温度。
- 如果研究生物体的大小为 >500 μm，并且可以轻松地从一个容器转移到另一个容器（例如桡足类），则在 1.5 mL 微量离心管中填充 750 μL 0.45 μm 过滤海水。或者，如果研究生物体较小，则在 1.5 mL 微量离心管中填充 250 μL 0.45 μm 过滤海水。
注：代表性数据为受精后2、4、6天的沙元 石斛 幼虫（见 材料表）。这些个体的平均大小（± S.D.，每个年龄n = 15）分别为152±7μm，260±17μm和292±14μm。鉴于这些幼虫可以很容易地浓缩（步骤3.5），微量离心管中填充750μL过滤的海水。 - 用反向过滤浓缩研究生物的培养物（即将网状物放在装有研究生物体的容器中，并通过网状物顶部除去水分），使研究生物体保持在烧杯11的底部。
注意：30μm尼龙网用于研究的幼虫砂美元（见 材料表）。 - 用过滤的海水冲洗浓缩的动物样品（例如，用藻类食品或其他化学品培养时）。再次重复反向过滤以浓缩动物样品。
- 将已知数量的单个生物放入半填充的微量离心管中。在解剖显微镜下计数小型浮游生物（见 材料表），并用玻璃巴斯德移液管转移它们。
注意：要放置的生物数量取决于大小;对于~200μm大小的幼虫砂美元，每个微量离心管20个是合适的。
注意：玻璃移液器比塑料移液器更受欢迎，因为一些浮游生物具有疏水性，会粘附在塑料表面上。 - 向含有动物的微量离心管中加入0.45μm过滤的海水，直到最终体积为1mL。
- 为了使生物体逐渐升温到所需的实验温度，将步骤3.7中制备的带有动物的微量离心管从冷端开始放入加热块中。在每排上放置成对的微量离心管（总共 12 个管）。
- 等待 10 分钟。
- 将步骤3.9插入的微量离心管对移动到温度较高的相邻钻孔中。在冷端的每一排中放置额外的微量离心管。现在每排将有四个管子。再等 10 分钟。
- 继续通过成对将动物的位置从较冷端移动到较暖端来添加带有动物的微量离心管。在每个班次之间等待 10 分钟，直到加热块完全填满。
注意：步骤3.9-3.12被认为是逐渐增加研究生物体所经历的温度的上升阶段。 - 让动物在指定温度下孵育2小时。这一步是实验的恒温暴露阶段。
- 如果孵育期超过2小时，则每小时用热电偶检查微量离心管的温度。
注意：根据实验需要调整孵育时间。如果孵育时间超过2小时，则在发生不可预见的设备故障时，用热电偶定期检查管的温度。为了尽量减少对研究生物的干扰，将六个或更多仅装满过滤海水的微量离心管随机放入块中进行温度监测。
- 如果孵育期超过2小时，则每小时用热电偶检查微量离心管的温度。
- 在孵育期结束时，使用带有K型电极的热电偶测量每个微量离心管内的温度。注意这些温度。
- 取出所有60个装有动物的微量离心管，并将它们放在预先标记的支架中。
- 将试管（步骤3.14）在预定温度（例如饲养温度）下孵育1小时，这是恢复期。
注意：恢复期可能因物种而异。对于幼虫砂美元，饲养温度为18°C，因此将样品置于环境室中。查阅相关文献和/或进行试验实验，以确保活：死计数不受恢复期长短的影响。在代表性数据中，1小时后存活的动物数量与恢复12或24小时后的动物数量相同。 - 为了枚举热暴露后存活的研究生物的比例，使用玻璃移液管将单个微量离心管的内容物转移到35毫米培养皿上。
- 观察并注意仍然活跃（活着）和那些在解剖显微镜下游泳或溶解（死亡）的个体的相对数量。确保观察到的个体总数等于步骤3.7中放入管中的个体数。如果数字不匹配，请检查微量离心管和培养皿的侧面是否有个人。
4. LT50 的计算
- 生成至少具有以下标题的 CSV 格式的数据表：感兴趣的分组变量、以 °C 为单位的管温度、活着的个体数和死亡的个体数。
注意：对于代表性数据，感兴趣的分组变量被年龄取代，因为目标是比较年龄组。 - 要使用逻辑回归拟合数据，请使用具有二项分布的广义线性模型。 补充编码文件 1 显示了使用开源软件 R22 的示例示例脚本。
- 要确定中位热上限 （LT 50），请计算50% 个体存活的预测变量值（即温度）。 补充编码文件 2 显示了使用 R22 中 MASS23 中的函数 dose.p 的示例脚本。
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Representative Results
该协议的目标是确定浮游动物的热上限。为此，需要稳定和线性的热梯度。通过将水浴温度设置为8°C，将加热器设置为39°C，所提出的设置能够产生14°C至40°C的热梯度（图2A）。温度梯度可以通过改变端点值来缩小和移动。通过将加热器设置为37°C，将水浴设置为15°C，还产生了范围较窄（19°C至37°C）的热梯度。 块中的温度在设置后45分钟至1小时内稳定（图2B）。
为了说明该协议在浮游动物中的应用，检查了由LT50表示的热上限的变化，通过沙美元幼虫（石斛）幼虫的个体发生。重量砂美元是商业获得的（见 材料表）。通过注射0.5-1mL的0.35M氯化钾诱导配子的释放。收集的鸡蛋通过63μm尼龙网和0.45μm过滤海水冲洗。将精子收集干并保存在冰上。卵子以每毫升~104 个精子受精。用来自三个雄性和三个雌性的配子以每毫升五个个体创建共同的花园培养物。将这些幼虫培养物保存在盐度为32 psu的过滤海水中，在18°C下，在12：12的明暗循环下，每隔一天完全换水一次。
随着幼虫砂美元的发育，热上限从受精后2天的28.6°C（±0.02°C标准时间内）增加到受精后4天的28.8°C（±0.02°C标准），受精后6天为29.3°C（±0.02°C-E）（图3）。这些热上限表明，在太平洋沿岸~20°C或更低的夏季平均海面温度期间，沙美元生活在其热极限内。然而，随着海洋热浪的频率和强度的增加，最高温度继续上升。2018 年 8 月，南加州湾记录了 26.4 °C 的峰值温度（Fumo 等人 24）。鉴于该物种在春季和夏季繁殖，在这些极端事件中，其早期生命阶段的存活率可能会减少。当温度达到26.5°C时，预测的存活率将降低10%。
使用Wheeler等人开发的比率测试25 进行的成对比较表明，三个年龄组之间的中位致死温度显着不同（p < 0.001）。早期阶段（原肠胚和2天大的早期棱镜）比较老的幼虫对热应力更敏感。这一观察结果表明，从单个发育时间点推导出的热极限并不代表该物种在其整个生命周期中。
图 1：加热块的标记图。 （A） 连接所有组件的设置的俯视图。（乙，四）加热器端子的放置和连接。（中，E）将热交换器（冷却埃莱梅内特）和相关管道放置在水浴中。请点击此处查看此图的大图。
图2：加热块在1小时内的温度变化，终点设置为15和37°C 。 （A）在1小时内实现了线性梯度。端点设置的更改会改变温度范围，最大范围为14°C至40°C。 （B）重复行之间的温差可以忽略不计（<0.8°C）;为（B）中的每个设置绘制来自两个重复行的数据。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：幼虫砂美元（石斛）在 19 至 37 °C 的温度范围内通过个体发生（受精后 2、4 和 6 天 [dpf]）的存活率。 每个数据面代表在特定温度下孵育2小时后存活1小时恢复期的幼虫比例。在统计软件R中使用具有二项分布的广义线性模型执行逻辑回归。 请点击此处查看此图的大图。
补充编码文件 1： 一个 R 脚本，用于通过分步示例为数据集生成逻辑曲线。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件 2： 用于生成 LT50 估计值的 R 脚本。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议提供了一种可访问和可定制的方法，通过急性热暴露来确定小型浮游生物的热极限。10孔设计和灵活的温度端点，由下端的水浴和上端的加热器控制，使人们能够精确地确定LT50。使用这种方法，可以检测到<1°C的热极限差异（图3）。这种方法可以快速确定各种物种的热极限（以小时为单位），并且结果值已应用于多种物种分布模型2，21。然而，重要的是要注意，与慢性暴露8，26相比，急性暴露可能会提供不同的热耐受性估计。
当前设计的一个主要优点是，在较小的占地面积（20.3 cm x 15.2 cm x 5 cm）内包括10次温度处理和6次重复。以前的出版物使用类似的热梯度方法来确定热极限，使用更大的铝棒（27 年为 180 厘米 x 10 厘米 x 6 厘米，10 年为 91 厘米× 25 厘米× 15 厘米，17 年为 60 厘米 x20 厘米）。虽然保持单一温度的干浴较小（例如，18.5 cm x 18.5 cm x 2.5 cm）并提供多次重复，但需要几个单元（超过四个）来生成包含多个温度的性能曲线，或者实验需要随着时间的推移重复，这可能会引入混杂因素。加热块设计降低了制造成本和空间要求。制造可以用钻床完成，或者没有立即使用铣床的研究人员可以选择商业CNC加工服务。使用市售零件进一步控制了制造成本。如果可以使用现有的加热/冷却水浴或水族箱冷却器，则零件的剩余成本总计不到350美元。否则，可以以 150 < 美元的价格购买 10 加仑（~35 升）鱼缸的水族箱冷却器。
当前的设计可以修改以适应研究人员的需求。如果目标生物体的尺寸较大，闪烁瓶是很好的替代容器，并且需要更大的孔。也就是说，铝块在当前设计中是可拆卸的，因此可以制作和更换多个块以满足实验需求。如果实验的目标是确定较低的热极限或专注于极性生物，则在主铝块的两端放置冷却水块更合适。
与浮游动物的其他研究类似，目前的协议不包括逐渐冷却阶段20，27。如果他们的研究生物体对温度突然下降敏感，研究人员可以考虑成对移除微量离心管并将它们向下移动温度梯度（即，逆转步骤3.9-3.12），以实现逐渐冷却。
此设置的效用可能会因几个因素而降低，即选择 （1） 端点温度设置，（2） 暴露和恢复持续时间，以及 3） 用于确定二项式状态的指标（活与死;发达与非发达）。为了解决这些潜在的限制，强烈建议进行初步测试。
由于逻辑回归假定二项分布，因此首选生存率和死亡率为 100% 的终点。对于海洋生物，合理的起始范围是收集地点的年平均海面温度加上10-15°C。 然后，在这样的初步试验之后，人们可以缩小所研究的温度范围，因为孔之间的温差越小，LT50 估计值就越精细。
暴露和恢复的持续时间因物种而异。例如，Kuo等人27允许幼年海螺（Nucella canaliculata）恢复24小时，而Hammond等人28允许幼虫紫色海胆（Stronglylocentrotus purprtaus）恢复1小时。可以执行一个简短的实验来确定恢复期之间的 live：dead 计数是否不同。根据所选二项式状态的定义（例如，活与死），恢复时间可能不是必需的。如果实验的目标是测试发育过程（如切割和原肠胚形成）是否在一定温度范围内发生。换句话说，模型中使用的二项式状态将发展与未发展8，19，21。固定剂如4%多聚甲醛必须在热暴露期间添加到样品中，没有任何恢复时间。
为了确保准确计数和确定二项式状态（活态与死态;显影 与 非显影状态），建议在恢复时间后按随机顺序对样本进行计数，以避免潜在的观察者偏差。如果有足够的人员，不同的研究人员可以计算重复行并比较他们的结果。或者，个人可以重复计算样本的一小部分并检查数字是否一致。
另一个潜在的限制是缺乏来自独立样本29的LT50的误差估计。当前的数据分析方法沿拟合逻辑曲线（补充编码文件 1）提供 95% 的置信区间和 LT50 的标准误差（补充编码文件 2）。这些误差边界是通过曲线拟合过程生成的，而不是通过对样本总体中的个体进行多次测量生成的。鉴于当前的热块设计有六行，可以拟合每行的数据以生成六个LT50估计值并获得基于观测值的误差估计值。
总之，提出了一种可应用于各种浮游动物的确定急性热极限的可访问方法。此设置可用于确定各种生物的热极限，并确定易受攻击的发育阶段。这些信息有助于改进对全球气候变化时有机体性能和潜在群落相互作用的预测。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了斯沃斯莫尔学院[KC]的教师研究基金以及BJ的Robert Reynolds和Lucinda Lewis'70暑期研究奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
