Summary
Il presente protocollo illustra l'uso di componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Tale gradiente può quindi essere utilizzato per determinare il limite termico superiore degli organismi planctonici, in particolare delle larve di invertebrati.
Abstract
I limiti termici e l'ampiezza sono stati ampiamente utilizzati per prevedere la distribuzione delle specie. Mentre la temperatura globale continua a salire, capire come cambia il limite termico con l'acclimatazione e come varia tra le fasi della vita e le popolazioni è vitale per determinare la vulnerabilità delle specie al riscaldamento futuro. La maggior parte degli organismi marini ha cicli di vita complessi che includono i primi stadi planctonici. Mentre quantificare il limite termico di questi piccoli stadi iniziali di sviluppo (da decine a centinaia di micron) aiuta a identificare i colli di bottiglia dello sviluppo, questo processo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni degli organismi bersaglio, del grande spazio richiesto al banco e degli elevati costi iniziali di fabbricazione. Qui viene presentata una configurazione orientata verso piccoli volumi (da ml a decine di ml). Questa configurazione combina componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Vengono inoltre presentate le specifiche di produzione della configurazione, nonché le procedure per introdurre ed enumerare individui vivi rispetto a quelli morti e calcolare la temperatura letale.
Introduction
La tolleranza termica è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione degli organismi 1,2. Mentre il pianeta continua a riscaldarsi a causa delle emissioni antropogeniche di carbonio, viene prestata crescente attenzione alla determinazione e all'applicazione dei limiti termici3. Vari endpoint, come la mortalità, il mancato sviluppo e la perdita di mobilità, sono stati utilizzati per determinare i limiti termici superiori e inferiori4. Questi limiti termici sono spesso considerati un proxy per la nicchia termica di un organismo. Queste informazioni vengono a loro volta utilizzate per identificare le specie più vulnerabili al riscaldamento globale, nonché per prevedere la distribuzione futura delle specie e le interazioni delle specie risultanti 3,5,6,7. Tuttavia, determinare i limiti termici, specialmente per i piccoli organismi planctonici, può essere difficile.
Per gli organismi planctonici, in particolare gli stadi larvali degli invertebrati marini, il limite termico può essere determinato attraverso l'esposizione cronica. L'esposizione cronica si ottiene allevando larve a diverse temperature per giorni o settimane e determinando la temperatura alla quale la sopravvivenza larvale e/o il tasso di sviluppo si riduconodi 8,9,10. Tuttavia, questo approccio richiede piuttosto tempo e richiede grandi incubatori ed esperienza nell'allevamento delle larve (vedi riferimento11 per una buona introduzione alla coltura di larve di invertebrati marini).
In alternativa, l'esposizione acuta allo stress termico può essere utilizzata per determinare i limiti termici. Spesso, questo approccio di determinazione comporta il posizionamento di piccole fiale con larve in bagni asciutti a temperatura controllata 12,13,14, sfruttando le funzioni di gradiente termico nei termociclatori PCR 15,16, o mettendo fiale di vetro / tubi di microcentrifuga lungo un gradiente termico generato dal riscaldamento e raffreddamento applicati alle estremità di grandi blocchi di alluminio con fori in cui le fiale si adattano perfettamente 17, 18,19. I tipici bagni secchi generano una singola temperatura; Pertanto, è necessario utilizzare più unità contemporaneamente per valutare le prestazioni in un intervallo di temperature. I termociclatori generano un gradiente, ma possono contenere solo un piccolo volume di campione (120 μL) e richiedono un'attenta manipolazione. Simile ai termociclatori, i grandi blocchi di alluminio creano gradienti di temperatura lineari e stabili. Entrambi gli approcci possono essere accoppiati con la regressione logistica o probit per calcolare la temperatura letale per il 50% della popolazione (LT50)12,20,21. Tuttavia, i blocchi di alluminio utilizzati erano lunghi ~ 100 cm; Questa dimensione richiede un ampio spazio di laboratorio e l'accesso a fresatrici a controllo numerico computerizzate specializzate per praticare i fori. Insieme all'utilizzo di due bagni d'acqua di livello di ricerca per mantenere la temperatura target, il costo finanziario dell'assemblaggio della configurazione è elevato.
Pertanto, questo lavoro mira a sviluppare un mezzo alternativo per generare un gradiente di temperatura stabile e lineare con parti disponibili in commercio. Tale prodotto deve avere un ingombro ridotto e deve poter essere facilmente utilizzato per esperimenti di esposizione acuta allo stress termico per organismi planctonici. Questo protocollo è sviluppato con zooplancton di dimensioni <1 mm come organismi bersaglio e, quindi, è stato ottimizzato per l'uso di una provetta da microcentrifuga da 1,5 o 2 ml. Gli organismi di studio più grandi richiederanno contenitori più grandi delle provette di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzate e fori allargati nei blocchi di alluminio.
Oltre a rendere più accessibile l'apparato sperimentale, questo lavoro mira a semplificare la pipeline di elaborazione dei dati. Mentre il software statistico commerciale fornisce routine per calcolare LT50 utilizzando la regressione logistica o probit, il costo della licenza non è banale. Pertanto, uno script facile da usare che si basa sul programma statistico open source R22 renderebbe l'analisi dei dati più accessibile.
Questo protocollo mostra come un blocco termico compatto può essere fabbricato con parti disponibili in commercio ed essere applicato per esporre lo zooplancton (larve del dollaro di sabbia Dendraster excentricus) allo stress termico acuto per determinare il loro limite termico superiore.
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Protocol
1. Fabbricazione del blocco termico
- Collegare il riscaldatore a strisce da 120 V, 100 W al reostato (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare il blocco di alluminio di 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pollici x 5 pollici x 2 pollici) praticando 60 fori in una griglia 6 x 10 (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi che i fori siano distanziati di 2 cm da centro a centro in entrambe le direzioni. Ciascuno dovrebbe avere un diametro di 1,1 cm e una profondità di 4,2 cm (Figura 1).
NOTA: Eseguire la foratura su una fresatrice o una pressa con punte in acciaio ad alta velocità. L'elemento riscaldante e l'elemento di raffreddamento sono stati entrambi scelti per coprire il più possibile la superficie di contatto delle superfici di 15,2 cm x 5 cm. - Praticare due fori aggiuntivi su una delle superfici di 20,3 cm x 5 cm tra la 1a e la 2a colonna e la 9ae 10acolonna, corrispondenti alle dimensioni delle sonde del regolatore di temperatura (vedi Tabella dei materiali).
- Costruire una custodia da fogli acrilici trasparenti da 1,2 cm (0,5 pollici) (vedere la tabella dei materiali) per mantenere gli elementi in posizione e isolare il blocco termico completato. Utilizzare due strati di acrilico per isolare il lato posteriore dell'elemento riscaldante (Figura 1).
- Nell'assemblaggio finale, applicare la pasta termica (vedere la tabella dei materiali) per massimizzare la conduttanza termica dall'elemento riscaldante nel blocco e dal blocco all'elemento di raffreddamento.
2. Determinazione delle impostazioni del gradiente termico
- Collegare il refrigeratore a bagnomaria/acquario con tubi Tygon (vedere Tabella dei materiali). Isolare il tubo con l'isolamento del tubo di schiuma secondo necessità.
- Inserire la sonda del termostato nei fori sul lato del blocco di alluminio. Assicurarsi che la sonda 1 sia posizionata vicino all'elemento riscaldante.
- Posizionare i tubi di microcentrifuga riempiti fino all'orlo (1,5 ml) con acqua di rubinetto in tutti i fori fresati (60 tubi in totale).
- Accendere il regolatore di temperatura e impostare la temperatura di arresto del riscaldamento della sonda da 1 a 35-37 °C e della sonda da 2 a 21,5-22,5 °C.
NOTA: Il termostato proposto ha due prese che funzionano in modo indipendente; Solo la sonda 1 viene utilizzata per regolare la temperatura calda in questo particolare caso d'uso. Pertanto, impostare la temperatura della sonda 2 su quella della temperatura di fascia bassa. - Ruotare il reostato per accendere l'elemento riscaldante e impostarlo su medio.
- Accendere il refrigeratore a bagnomaria/acquario e impostare la temperatura del refrigeratore a 15 °C.
- Controllare che il blocco sia caldo su un'estremità e freddo sull'altra dopo 10 minuti.
ATTENZIONE: Le estremità esposte dell'elemento riscaldante possono essere calde; Non toccarli. - Controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K (vedi Tabella dei materiali) ogni 10 minuti successivi. La temperatura si stabilizzerà dopo ~ 60 minuti e apparirà lineare (Figura 2).
- Regolare i valori degli endpoint modificando le impostazioni del regolatore di temperatura e del bagno d'acqua in base alle esigenze.
3. Esposizione termica e enumerazione dei vivi:morti
NOTA: il passaggio 2 può essere omesso una volta determinate le impostazioni desiderate per il gradiente di temperatura.
- Accendere il bagno d'acqua e il riscaldatore di ricircolo e impostarli rispettivamente su 15 °C e 37 °C per generare un gradiente di temperatura da 19,5 °C a 37 °C.
- Per garantire che il gradiente termico sia lineare, posizionare tubi di microcentrifuga riempiti fino all'orlo (1,5 ml) con acqua di rubinetto in tutti i fori fresati (60 tubi in totale).
- Lasciare che il blocco termico raggiunga la temperatura impostata aspettando 45-60 min. Controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K per vedere se ha raggiunto la temperatura prevista. Nota queste temperature.
- Se gli organismi in studio hanno dimensioni di >500 μm e possono essere facilmente trasferiti da un contenitore all'altro (ad esempio, un copepodi), riempire una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 750 μL di acqua di mare filtrata da 0,45 μm. In alternativa, se gli organismi in studio sono piccoli, riempire una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 250 μL di acqua di mare filtrata da 0,45 μm.
NOTA: Per i dati rappresentativi, sono state utilizzate larve del Dendraster excentrics, che sono 2, 4 e 6 giorni dopo la fecondazione (vedi Tabella dei materiali). La dimensione media (± S.D., n = 15 per ogni età) di questi individui era rispettivamente di 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm e 292 ± 14 μm. Dato che queste larve possono essere facilmente concentrate (fase 3.5), le provette della microcentrifuga sono state riempite con 750 μL di acqua di mare filtrata. - Concentrare la coltura degli organismi in studio con il filtraggio inverso (cioè posizionare la maglia nel contenitore contenente gli organismi in studio e rimuovere l'acqua attraverso la parte superiore della maglia), in modo che gli organismi in studio rimangano nella parte inferiore del becher11.
NOTA: Una rete di nylon da 30 μm è stata utilizzata per i dollari di sabbia larvale studiati (vedi Tabella dei materiali). - Risciacquare il campione animale concentrato con acqua di mare filtrata (ad esempio, quando si coltiva con alimenti algali o altri prodotti chimici). Ripetere ancora una volta il filtraggio inverso per concentrare il campione animale.
- Inserire un numero noto di singoli organismi nelle provette di microcentrifuga riempite a metà. Contare i piccoli organismi planctonici al microscopio da dissezione (vedi Tabella dei materiali) e trasferirli con pipette Pasteur di vetro.
NOTA: Il numero di organismi da posizionare dipende dalle dimensioni; Per i dollari di sabbia larvale che avevano dimensioni ~ 200 μm, 20 individui per tubo di microcentrifuga erano appropriati.
ATTENZIONE: Le pipette di vetro sono più desiderabili delle pipette di plastica poiché alcuni organismi planctonici sono idrofobi e si attaccano alle superfici di plastica. - Aggiungere 0,45 μm di acqua di mare filtrata alle provette di microcentrifuga contenenti animali fino a quando il volume finale è di 1 ml.
- Per consentire agli organismi di riscaldarsi gradualmente fino alla temperatura sperimentale desiderata, posizionare le provette di microcentrifuga con animali, preparate al punto 3.7, nel blocco termico a partire dall'estremità fredda. Posizionare coppie di provette per microcentrifuga su ogni fila (12 provette in totale).
- Attendere 10 min.
- Spostare le coppie di tubi di microcentrifuga inseriti al punto 3.9 nei fori adiacenti con temperature più calde. Posizionare ulteriori coppie di tubi per microcentrifuga in ogni fila all'estremità fredda. Ogni fila avrà ora quattro tubi. Attendere altri 10 minuti.
- Continuare ad aggiungere provette di microcentrifuga con gli animali spostando le loro posizioni dall'estremità più fredda a quella più calda in coppia. Attendere 10 minuti tra ogni turno fino a quando il blocco termico non è completamente riempito.
NOTA: I passaggi 3.9-3.12 sono considerati una fase di accelerazione per aumentare gradualmente la temperatura sperimentata dagli organismi di studio. - Lascia che gli animali incubano alla temperatura designata per 2 ore. Questa fase è la fase di esposizione a temperatura costante dell'esperimento.
- Controllare la temperatura delle provette della microcentrifuga con una termocoppia ogni ora se il periodo di incubazione supera le 2 ore.
NOTA: Regolare il tempo di incubazione in base alle esigenze sperimentali. Se l'incubazione è più lunga di 2 ore, controllare la temperatura dei tubi a intervalli di tempo regolari con una termocoppia in caso di guasto imprevisto dell'apparecchiatura. Per ridurre al minimo il disturbo agli organismi in studio, posizionare in modo casuale sei o più tubi di microcentrifuga riempiti solo con acqua di mare filtrata nel blocco per il monitoraggio della temperatura.
- Controllare la temperatura delle provette della microcentrifuga con una termocoppia ogni ora se il periodo di incubazione supera le 2 ore.
- Al termine del periodo di incubazione, misurare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K. Nota queste temperature.
- Rimuovere tutti i 60 tubi di microcentrifuga con animali e metterli in supporti pre-etichettati.
- Incubare i tubi (fase 3.14) alla temperatura predeterminata, come la temperatura di allevamento, per 1 ora, che è il periodo di recupero.
NOTA: il periodo di recupero può essere specie-specifico. Per il dollaro di sabbia larvale, la temperatura di allevamento era di 18 °C, e quindi il campione è stato posto in una camera ambientale. Consultare la letteratura pertinente e/o condurre un esperimento di prova per assicurarsi che il conteggio dei morti vivi non sia stato influenzato dalla durata del periodo di recupero. Nei dati rappresentativi, il numero di animali vivi dopo 1 ora era lo stesso di dopo 12 o 24 ore di recupero. - Per enumerare la proporzione di organismo in studio che è vivo dopo l'esposizione termica, trasferire il contenuto di una singola provetta di microcentrifuga su una capsula di Petri da 35 mm utilizzando una pipetta di vetro.
- Osserva e nota il numero relativo di individui che sono ancora attivi (vivi) e quelli che hanno preso il nuoto o si sono dissolti (morti) sotto un microscopio da dissezione. Assicurarsi che il numero totale di individui osservati sia uguale al numero di individui inseriti nei tubi nella fase 3.7. Controllare il lato delle provette della microcentrifuga e della capsula di Petri per gli individui se i numeri non corrispondono.
4. Calcolo di LT50
- Generare una tabella di dati in formato CSV con almeno le seguenti intestazioni: raggruppamento variabile di interesse, temperatura del tubo in °C, numero di individui vivi e numero di individui morti.
NOTA: per i dati rappresentativi, la variabile di raggruppamento di interesse è sostituita dall'età poiché l'obiettivo è quello di confrontare tra gruppi di età. - Per adattare i dati alla regressione logistica, utilizzare un modello lineare generalizzato con una distribuzione binomiale. Il file di codifica supplementare 1 mostra uno script di esempio che utilizza il software open source R22.
- Per determinare il limite termico superiore mediano (LT 50), calcolare il valore predittivo (cioè la temperatura) al quale il50% degli individui è sopravvissuto. Il file di codifica supplementare 2 mostra uno script di esempio che utilizza la funzione dose.p dal MASS23 in R22.
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Representative Results
L'obiettivo di questo protocollo è determinare il limite termico superiore dello zooplancton. Per fare ciò, è necessario un gradiente termico stabile e lineare. La configurazione proposta è stata in grado di generare un gradiente termico compreso tra 14 °C e 40 °C impostando la temperatura del bagno d'acqua a 8 °C e il riscaldatore a 39 °C (Figura 2A). Il gradiente di temperatura può essere ridotto e spostato modificando i valori finali. È stato inoltre generato un gradiente termico con un intervallo più ristretto (da 19 °C a 37 °C) impostando il riscaldatore a 37 °C e il bagno d'acqua a 15 °C. La temperatura nel blocco si stabilizza entro 45 minuti a 1 ora dalla configurazione (Figura 2B).
Per illustrare l'applicazione di questo protocollo allo zooplancton, è stata esaminata la variazione del limite termico superiore, indicato da LT50, attraverso l'ontogenesi nelle larve dei dollari di sabbia (Dendraster excentricus). I dollari di sabbia gravida sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Il rilascio di gameti è stato indotto iniettando 0,5-1 ml di cloruro di potassio 0,35 M. Le uova raccolte sono state sciacquate attraverso una rete di nylon da 63 μm con acqua di mare filtrata da 0,45 μm. Lo sperma è stato raccolto asciutto e tenuto sul ghiaccio. Le uova sono state fecondate a ~ 104 spermatozoi per ml. Le culture da giardino comuni sono state create con gameti di tre maschi e tre femmine a cinque individui per ml. Queste colture larvali sono state mantenute in acqua di mare filtrata con una salinità di 32 psu a 18 °C sotto un ciclo luce:buio 12:12 con cambio completo dell'acqua a giorni alterni.
Con lo sviluppo dei dollari di sabbia larvale, il limite termico superiore è aumentato da 28,6 °C (± 0,02 °C S.E) a 2 giorni dopo la fecondazione a 28,8 °C (± 0,02 °C S.E) a 4 giorni dopo la fecondazione e 29,3 °C (± 0,02 °C S.E) a 6 giorni dopo la fecondazione (Figura 3). Questi limiti termici superiori suggeriscono che i dollari di sabbia vivono entro il loro limite termico durante la temperatura media estiva della superficie del mare di ~ 20 ° C o inferiore lungo la costa del Pacifico. Tuttavia, con l'aumentare della frequenza e dell'intensità delle ondate di calore marine, la temperatura massima continua a salire. Una temperatura di picco di 26,4 ° C è stata registrata nel sud della California Bight nell'agosto 2018 (Fumo et al.24). Dato che questa specie si riproduce in primavera e in estate, è probabile che la sopravvivenza della loro fase iniziale di vita diminuisca durante questi eventi estremi. La sopravvivenza prevista diminuirebbe del 10% quando la temperatura raggiunge i 26,5 °C.
I confronti a coppie utilizzando il test del rapporto sviluppato da Wheeler et al.25 suggeriscono che la temperatura letale mediana era significativamente diversa tra i tre gruppi di età (p < 0,001). Le fasi precedenti (gastrula e prismi precoci che avevano 2 giorni) erano più sensibili allo stress termico rispetto alle larve più vecchie. Questa osservazione suggerisce che il limite termico dedotto da un singolo punto temporale di sviluppo non è rappresentativo di quella specie per tutta la sua storia di vita.
Figura 1: Diagramma etichettato del blocco termico. (A) Vista dall'alto della configurazione con tutti i componenti collegati. (B,D) Posizionamento e connessioni per i terminali del riscaldatore. (C,E) Posizionamento dello scambiatore di calore (elettronica di raffreddamento) e dei relativi tubi a bagnomaria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Variazioni di temperatura nel blocco termico nell'arco di 1 ora con punti finali impostati a 15 e 37 °C . (A) Un gradiente lineare è stato raggiunto entro 1 ora. La modifica delle impostazioni dell'endpoint varia l'intervallo di temperatura e l'intervallo più ampio era compreso tra 14 °C e 40 °C. (B) La differenza di temperatura tra le righe replicate era trascurabile (<0,8 °C); i dati di due righe di replica sono stati tracciati per ogni impostazione in (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Sopravvivenza dei dollari di sabbia larvale (Dendraster excentricus) in un intervallo di temperatura compreso tra 19 e 37 °C attraverso l'ontogenesi (2, 4 e 6 giorni dopo la fecondazione [dpf]). Ogni dato rappresenta la proporzione di larve sopravvissute a un'incubazione di 2 ore alla temperatura specifica seguita da un periodo di recupero di 1 ora. Una regressione logistica è stata eseguita utilizzando il modello lineare generalizzato con distribuzione binomiale nel software statistico R. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codifica supplementare 1: Uno script R per generare curve logistiche per il set di dati con un esempio dettagliato. Clicca qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 2: Uno script R per generare stime LT50 . Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un approccio accessibile e personalizzabile per determinare i limiti termici di piccoli organismi plancton attraverso l'esposizione termica acuta. Il design a 10 fori e i punti finali di temperatura flessibili, controllati dal bagno d'acqua all'estremità inferiore e dal riscaldatore all'estremità superiore, consentono di determinare LT50 con precisione. Utilizzando questo approccio, è stata rilevata una differenza nel limite termico di <1 °C (Figura 3). Questo approccio fornisce una rapida determinazione dei limiti termici (in ore) per una varietà di specie, e i valori risultanti sono stati applicati a più modelli di distribuzione delle specie 2,21. Tuttavia, è importante notare che l'esposizione acuta probabilmente fornisce una stima di tolleranza termica diversa rispetto all'esposizione cronica 8,26.
Uno dei principali vantaggi del design attuale è che 10 trattamenti termici e sei repliche sono inclusi in un ingombro ridotto (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm). Le pubblicazioni precedenti che utilizzavano un approccio simile al gradiente termico per determinare i limiti termici utilizzavano barre di alluminio più grandi (180 cm x 10 cm x 6 cm in 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm in 10 e 60 cm x20 cm in 17). Mentre i bagni asciutti che mantengono una singola temperatura sono più piccoli (ad esempio, 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) e offrono più repliche, sono necessarie diverse unità (più di quattro) per generare una curva di prestazione che include più temperature, oppure gli esperimenti devono essere ripetuti nel tempo che potrebbero introdurre fattori confondenti. Il design del blocco termico riduce sia i costi di fabbricazione che i requisiti di spazio. La fabbricazione può essere completata con una pressa per trapano, oppure i ricercatori senza accesso immediato a una fresatrice potrebbero optare per servizi di lavorazione CNC commerciali. L'uso di parti disponibili in commercio controlla ulteriormente i costi di fabbricazione. Se è possibile utilizzare un bagno di acqua di riscaldamento / raffreddamento esistente o refrigeratori per acquari, il costo rimanente delle parti ammonta a meno di $ 350. Altrimenti, i refrigeratori per acquari per un acquario da 10 galloni (~ 35 L) possono essere acquistati per < $ 150.
Il design attuale può essere modificato per soddisfare le esigenze del ricercatore. Se gli organismi bersaglio sono di dimensioni maggiori, le fiale di scintillazione sono buoni contenitori alternativi e sarebbero necessari fori più grandi. Detto questo, il blocco di alluminio è rimovibile nel design attuale, quindi più blocchi possono essere realizzati e sostituiti per soddisfare le esigenze sperimentali. Se l'obiettivo dell'esperimento è determinare un limite termico inferiore o concentrarsi sugli organismi polari, posizionare blocchi di acqua refrigerante su entrambe le estremità del blocco di alluminio principale è più appropriato.
Analogamente ad altri studi sullo zooplancton, l'attuale protocollo non prevede una fase di raffreddamento graduale20,27. I ricercatori possono prendere in considerazione la rimozione dei tubi della microcentrifuga a coppie e spostarli verso il basso del gradiente di temperatura (cioè invertendo i passaggi 3.9-3.12) per ottenere un raffreddamento graduale se i loro organismi di studio sono sensibili a un'improvvisa diminuzione della temperatura.
L'utilità di questa configurazione può essere diminuita da diversi fattori, vale a dire la scelta di (1) le impostazioni di temperatura dell'endpoint, (2) l'esposizione e la durata del recupero e 3) la metrica utilizzata per determinare lo stato binomiale (vivo vs morto; sviluppato vs non sviluppato). Per affrontare queste potenziali limitazioni, si raccomandano test preliminari.
Poiché la regressione logistica presuppone una distribuzione binomiale, sono preferiti endpoint con sopravvivenza e mortalità del 100%. Per gli organismi marini, un intervallo di partenza ragionevole sarebbe la temperatura media annua della superficie del mare del sito di raccolta più 10-15 °C. È quindi possibile restringere l'intervallo di temperatura studiato dopo tale prova iniziale, poiché minore è la differenza di temperatura tra i fori, più precisa è la stima LT50 .
La durata dell'esposizione e del recupero sono specie-specifiche. Ad esempio, Kuo et al.27 hanno permesso ai giovani buccini (Nucella canaliculata) di recuperare per 24 ore, mentre Hammond et al.28 hanno permesso ai ricci larvali viola (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 ora per il recupero. Si potrebbe eseguire un breve esperimento per determinare se il conteggio live:dead differisce tra i periodi di recupero. A seconda della definizione dello stato binomiale scelto (ad esempio, vivo vs. morto), il tempo di recupero potrebbe non essere necessario. Se l'obiettivo dell'esperimento è verificare se i processi di sviluppo, come la scissione e la gastrulazione, si verificano in un intervallo di temperature. In altre parole, lo stato binomiale utilizzato nel modello sarebbe sviluppato rispetto a 8,19,21 non sviluppato. Fissativi come la paraformaldeide al 4% devono essere aggiunti ai campioni durante il periodo di esposizione termica senza alcun tempo di recupero.
Per garantire un conteggio accurato e la determinazione dello stato binomiale (vivo vs. morto; sviluppato vs. non sviluppato), è consigliabile contare i campioni dopo il tempo di recupero in ordine casuale per evitare potenziali distorsioni dell'osservatore . Se c'è personale sufficiente, diversi ricercatori potrebbero contare le righe replicate e confrontare i loro risultati. In alternativa, gli individui possono contare ripetutamente un piccolo sottoinsieme dei campioni e verificare se i numeri sono coerenti.
Un'altra potenziale limitazione è la mancanza di stima degli errori dell'LT50 da campioni indipendenti29. L'attuale metodo di analisi dei dati fornisce un intervallo di confidenza del 95% lungo la curva logistica adattata (Supplementary Coding File 1) e un errore standard dell'LT50 (Supplementary Coding File 2). Questi limiti di errore sono generati dal processo di adattamento della curva, non attraverso misurazioni multiple di individui della popolazione campione. Dato che l'attuale progettazione del blocco termico ha sei righe, è possibile adattare i dati di ciascuna riga per generare sei stime LT50 e ottenere le stime degli errori basate sull'osservazione.
In sintesi, viene presentato un approccio accessibile per determinare i limiti termici acuti che possono essere applicati a un'ampia varietà di zooplancton. Questa configurazione può essere utilizzata per determinare i limiti termici di vari organismi e per individuare le fasi di sviluppo vulnerabili. Queste informazioni possono aiutare a migliorare la previsione delle prestazioni degli organismi e delle potenziali interazioni della comunità di fronte ai cambiamenti climatici globali.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal Faculty Research Fund dello Swarthmore College [KC] e dalla Robert Reynolds and Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship per BJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
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