Summary
O presente protocolo ilustra o uso de componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. Tal gradiente pode então ser usado para determinar o limite térmico superior de organismos planctônicos, particularmente larvas de invertebrados.
Abstract
Limites térmicos e amplitude têm sido amplamente utilizados para prever a distribuição de espécies. À medida que a temperatura global continua a subir, entender como o limite térmico muda com a aclimatação e como ele varia entre os estágios da vida e as populações é vital para determinar a vulnerabilidade das espécies ao aquecimento futuro. A maioria dos organismos marinhos tem ciclos de vida complexos que incluem estágios planctônicos iniciais. Embora quantificar o limite térmico desses pequenos estágios iniciais de desenvolvimento (dezenas a centenas de mícrons) ajude a identificar gargalos de desenvolvimento, esse processo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho dos organismos-alvo, à grande necessidade de espaço de bancada e ao alto custo inicial de fabricação. Aqui, uma configuração voltada para pequenos volumes (mL a dezenas de mL) é apresentada. Esta configuração combina componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. As especificações de produção da configuração, bem como os procedimentos para introduzir e enumerar indivíduos vivos versus mortos e calcular a temperatura letal, também são apresentados.
Introduction
A tolerância térmica é fundamental para a sobrevivência e função dos organismos 1,2. À medida que o planeta continua a aquecer devido às emissões antropogénicas de carbono, está a ser dada cada vez mais atenção à determinação e aplicação de limites térmicos3. Vários desfechos, como mortalidade, falha no desenvolvimento e perda de mobilidade, têm sido utilizados para determinar os limites térmicos superiores e inferiores4. Esses limites térmicos são frequentemente considerados um proxy para o nicho térmico de um organismo. Essas informações, por sua vez, são utilizadas para identificar espécies mais vulneráveis ao aquecimento global, bem como prever a distribuição futura de espécies e as interações resultantes das espécies 3,5,6,7. No entanto, determinar limites térmicos, especialmente para pequenos organismos planctônicos, pode ser um desafio.
Para organismos planctônicos, particularmente os estágios larvais de invertebrados marinhos, o limite térmico pode ser determinado através da exposição crônica. A exposição crônica é alcançada pela criação de larvas a várias temperaturas ao longo de dias a semanas e pela determinação da temperatura na qual a sobrevivência larval e/ou a taxa de desenvolvimento reduzem 8,9,10. No entanto, esta abordagem é bastante demorada e requer grandes incubadoras e experiência na criação de larvas (ver referência11 para uma boa introdução à cultura de larvas de invertebrados marinhos).
Alternativamente, a exposição aguda ao estresse térmico pode ser usada para determinar os limites térmicos. Muitas vezes, essa abordagem de determinação envolve a colocação de pequenos frascos com larvas em banhos secos com temperatura controlada 12,13,14, alavancando funções de gradiente térmico em termocicladores de PCR 15,16 ou colocando frascos de vidro/tubos de microcentrífuga ao longo de um gradiente térmico gerado pelo aquecimento e resfriamento aplicados nas extremidades de grandes blocos de alumínio com orifícios nos quais os frascos se encaixam confortavelmente 17, 18,19. Banhos secos típicos geram uma única temperatura; portanto, várias unidades devem ser operadas simultaneamente para avaliar o desempenho em uma faixa de temperaturas. Os termocicladores geram um gradiente, mas acomodam apenas um pequeno volume de amostra (120 μL) e requerem manipulações cuidadosas. Semelhante aos termocicladores, grandes blocos de alumínio criam gradientes de temperatura lineares e estáveis. Ambas as abordagens podem ser acopladas à regressão logística ou probit para calcular a temperatura letal para 50% por cento da população (LT50)12,20,21. No entanto, os blocos de alumínio utilizados tinham ~ 100 cm de comprimento; esse tamanho demanda um grande espaço de laboratório e acesso a fresadoras especializadas em controle numérico por computador para perfurar os furos. Juntamente com o uso de dois banhos de água de grau de pesquisa para manter a temperatura alvo, o custo financeiro de montagem da configuração é alto.
Portanto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um meio alternativo para gerar um gradiente de temperatura estável e linear com peças comercialmente disponíveis. Tal produto deve ter uma pegada pequena e deve ser capaz de ser facilmente utilizado para experiências de exposição ao stress térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo é desenvolvido com zooplâncton que tem <1 mm de tamanho como organismos-alvo e, assim, foi otimizado para o uso de um tubo microcentrífugo de 1,5 ou 2 mL. Organismos de estudo maiores exigirão recipientes maiores do que os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usados e furos ampliados nos blocos de alumínio.
Além de tornar o aparato experimental mais acessível, este trabalho visa simplificar o pipeline de processamento de dados. Embora o software estatístico comercial forneça rotinas para calcular o LT50 usando regressão logística ou probit, o custo de licenciamento não é trivial. Portanto, um script fácil de usar que se baseia no programa estatístico de código aberto R22 tornaria a análise de dados mais acessível.
Este protocolo mostra como um bloco de calor compacto pode ser fabricado com peças comercialmente disponíveis e ser aplicado para expor o zooplâncton (larvas do Dendraster excentricus) ao estresse térmico agudo para determinar seu limite térmico superior.
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Protocol
1. Fabricação do bloco de calor
- Ligue o aquecedor de tiras de 120 V e 100 W ao reostato (ver Tabela de Materiais).
- Prepare o bloco de alumínio de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pol x 5 pol x 2 pol) perfurando 60 furos em uma grade de 6 x 10 (consulte Tabela de Materiais). Certifique-se de que os orifícios estão espaçados 2 cm de centro para centro em ambas as direções. Cada um deve ter 1,1 cm de diâmetro e 4,2 cm de profundidade (Figura 1).
NOTA: Execute a perfuração em uma fresadora ou prensa de perfuração com brocas de aço de alta velocidade. O elemento de aquecimento e o elemento de resfriamento foram escolhidos para cobrir o máximo possível da superfície de contato das superfícies de 15,2 cm x 5 cm. - Faça dois furos adicionais em uma das superfícies de 20,3 cm x 5 cm entre a 1ª e a 2ª coluna e a9ª e 10ª colunas, combinando o tamanho das sondas controladoras de temperatura (consulte Tabela de Materiais).
- Construa uma caixa a partir de folhas de acrílico transparente de 1,2 cm (0,5 pol.) (ver Tabela de Materiais) para manter os elementos no lugar e isolar o bloco de calor completo. Use duas camadas de acrílico para isolar a parte de trás do elemento de aquecimento (Figura 1).
- Na montagem final, aplique pasta térmica (consulte Tabela de Materiais) para maximizar a condutância térmica do elemento de aquecimento para o bloco e do bloco para o elemento de resfriamento.
2. Determinação das definições de gradiente térmico
- Conecte o resfriador de banho-maria/aquário com a tubulação Tygon (consulte Tabela de materiais). Isole a tubulação com isolamento de tubo de espuma, conforme necessário.
- Insira a sonda do termostato nos orifícios na lateral do bloco de alumínio. Certifique-se de que a sonda 1 esteja posicionada perto do elemento de aquecimento.
- Colocar tubos de microcentrífuga cheios até a borda (1,5 mL) com água da torneira em todos os orifícios fresados (60 tubos no total).
- Ligue o controlador de temperatura e ajuste a temperatura de aquecimento de parada da sonda de 1 a 35-37 °C e da sonda de 2 a 21,5-22,5 °C.
NOTA: O termostato proposto tem duas tomadas que operam de forma independente; apenas a sonda 1 é usada para regular a temperatura quente neste caso de uso específico. Portanto, defina a temperatura da sonda 2 para a temperatura de extremidade baixa. - Gire o reostato para ligar o elemento de aquecimento e defina-o como médio.
- Ligue o banho de água/refrigerador do aquário e ajuste a temperatura do chiller para 15 °C.
- Verifique se o bloco está quente em uma extremidade e esfriar na outra após 10 min.
CUIDADO: As extremidades expostas do elemento de aquecimento podem estar quentes; não os toque. - Verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K (consulte a Tabela de Materiais) a cada 10 minutos depois. A temperatura se estabilizará após ~60 min e aparecerá linear (Figura 2).
- Ajuste os valores dos pontos de extremidade alterando as configurações do controlador de temperatura e do banho-maria, conforme necessário.
3. Exposição térmica e enumeração viva: morta
NOTA: A etapa 2 pode ser omitida quando as configurações desejadas para o gradiente de temperatura forem determinadas.
- Ligue o banho-maria de recirculação e o aquecedor e ajuste-os a 15 °C e 37 °C, respectivamente, para gerar um gradiente de temperatura de 19,5 °C a 37 °C.
- Para garantir que o gradiente térmico seja linear, coloque tubos de microcentrífuga cheios até a borda (1,5 mL) com água da torneira em todos os orifícios fresados (60 tubos no total).
- Deixe o bloco de calor atingir a temperatura definida esperando 45-60 min. Verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K para ver se atingiu a temperatura esperada. Observe essas temperaturas.
- Se os organismos do estudo tiverem >500 μm de tamanho e puderem ser facilmente transferidos de um recipiente para outro (por exemplo, um copépode), encha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 750 μL de água do mar filtrada de 0,45 μm. Alternativamente, se os organismos do estudo forem pequenos, encha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 250 μL de 0,45 μm de água do mar filtrada.
NOTA: Para os dados representativos, foram utilizadas larvas do dólar de areia excêntricos de Dendraster , que são 2, 4 e 6 dias pós-adubação, (ver Tabela de Materiais). O tamanho médio (± S.D., n = 15 para cada idade) desses indivíduos foi de 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm e 292 ± 14 μm, respectivamente. Dado que essas larvas podem ser facilmente concentradas (etapa 3.5), os tubos de microcentrífuga foram preenchidos com 750 μL de água do mar filtrada. - Concentrar a cultura dos organismos de estudo com filtragem reversa (ou seja, colocar a malha no recipiente que contém os organismos de estudo e remover a água através do topo da malha), de modo que os organismos de estudo permaneçam no fundo do copo11.
NOTA: Uma malha de nylon de 30 μm foi utilizada para os dólares de areia larval estudados (ver Tabela de Materiais). - Lave a amostra animal concentrada com água do mar filtrada (por exemplo, ao cultivar com alimentos de algas ou outros produtos químicos). Repetir a filtragem inversa mais uma vez para concentrar a amostra animal.
- Coloque um número conhecido de organismos individuais nos tubos de microcentrífuga meio cheios. Conte os pequenos organismos planctônicos sob um microscópio de dissecação (ver Tabela de Materiais) e transfira-os com pipetas Pasteur de vidro.
NOTA: O número de organismos a serem colocados depende do tamanho; para larvas de areia de tamanho ~200 μm, 20 indivíduos por tubo de microcentrífuga foram apropriados.
CUIDADO: As pipetas de vidro são mais desejáveis do que as pipetas de plástico, pois alguns organismos planctônicos são hidrofóbicos e aderem às superfícies plásticas. - Adicionar 0,45 μm de água do mar filtrada aos tubos de microcentrífuga contendo animais até que o volume final seja de 1 ml.
- Para permitir que os organismos se aqueçam gradualmente até a temperatura experimental desejada, coloque os tubos de microcentrífuga com animais, preparados na etapa 3.7, no bloco de calor a partir da extremidade fria. Coloque pares de tubos de microcentrífuga em cada fileira (12 tubos no total).
- Aguarde 10 min.
- Mover os pares de tubos de microcentrífuga inseridos no passo 3.9 para os furos perfurados adjacentes com temperaturas mais quentes. Coloque pares adicionais de tubos de microcentrífuga em cada fileira na extremidade fria. Cada fileira terá agora quatro tubos. Aguarde mais 10 min.
- Continue a adicionar tubos de microcentrífuga com animais, mudando suas posições da extremidade mais fria para a extremidade mais quente em pares. Aguarde 10 minutos entre cada turno até que o bloco de calor esteja completamente cheio.
NOTA: As etapas 3.9-3.12 são consideradas uma fase de aumento para aumentar a temperatura experimentada pelos organismos do estudo gradualmente. - Deixar os animais incubarem à temperatura designada durante 2 h. Esta etapa é a fase de exposição constante à temperatura do experimento.
- Verifique a temperatura dos tubos de microcentrífuga com um termopar a cada hora se o período de incubação exceder 2 h.
NOTA: Ajustar o tempo de incubação com base nas necessidades experimentais. Se a incubação for superior a 2 h, verifique a temperatura dos tubos em intervalos de tempo regulares com um termopar em caso de falha imprevista do equipamento. Para minimizar a perturbação dos organismos do estudo, coloque aleatoriamente seis ou mais tubos de microcentrífuga preenchidos apenas com água do mar filtrada no bloco para monitoramento da temperatura.
- Verifique a temperatura dos tubos de microcentrífuga com um termopar a cada hora se o período de incubação exceder 2 h.
- No final do período de incubação, meça a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K. Observe essas temperaturas.
- Retire todos os 60 tubos de microcentrífuga com animais e coloque-os em suportes pré-rotulados.
- Incubar os tubos (passo 3.14) à temperatura predeterminada, como a temperatura de criação, durante 1 h, que é o período de recuperação.
NOTA: O período de recuperação pode ser específico da espécie. Para a larva de dólar de areia, a temperatura de criação foi de 18 °C e, assim, a amostra foi colocada em câmara ambiental. Consulte a literatura relevante e/ou conduza um experimento experimental para garantir que a contagem de mortos:vivos não tenha sido afetada pela duração do período de recuperação. Nos dados representativos, o número de animais vivos após 1 h foi o mesmo que após 12 ou 24 h de recuperação. - Para enumerar a proporção de organismo em estudo que está vivo após a exposição térmica, transfira o conteúdo de um tubo de microcentrífuga individual para uma placa de Petri de 35 mm usando uma pipeta de vidro.
- Observe e observe o número relativo de indivíduos que ainda estão ativos (vivos) e aqueles que capturaram a natação ou se dissolveram (mortos) sob um microscópio de dissecação. Certifique-se de que o número total de indivíduos observados seja igual ao número de indivíduos colocados nos tubos na etapa 3.7. Verifique o lado dos tubos de microcentrífuga e da placa de Petri para indivíduos se os números não corresponderem.
4. Cálculo do LT50
- Gere uma tabela de dados em formato CSV com pelo menos os seguintes cabeçalhos: variável de agrupamento de interesse, temperatura do tubo em °C, número de indivíduos vivos e número de indivíduos mortos.
NOTA: Para os dados representativos, a variável de agrupamento de interesse é substituída por idade, uma vez que o objetivo é comparar entre as faixas etárias. - Para ajustar os dados com regressão logística, use um modelo linear generalizado com distribuição binomial. O Arquivo de Codificação Suplementar 1 mostra um exemplo de script de exemplo usando o software de código aberto R22.
- Para determinar o limite térmico superior mediano (LT 50), calcule o valor preditor (ou seja, temperatura) no qual50% dos indivíduos sobreviveram. O Arquivo de Codificação Suplementar 2 mostra um script de exemplo usando a função dose.p do MASS23 em R22.
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Representative Results
O objetivo deste protocolo é determinar o limite térmico superior do zooplâncton. Para isso, é necessário um gradiente térmico estável e linear. A configuração proposta foi capaz de gerar um gradiente térmico variando de 14 °C a 40 °C, ajustando a temperatura do banho-maria para 8 °C e o aquecedor para 39 °C (Figura 2A). O gradiente de temperatura pode ser estreitado e deslocado alterando os valores de ponto de extremidade. Um gradiente térmico com uma faixa mais estreita (19 °C a 37 °C) também foi gerado pela fixação do aquecedor a 37 °C e do banho-maria a 15 °C. A temperatura no bloco se estabiliza dentro de 45 min a 1 h da configuração (Figura 2B).
Para ilustrar a aplicação deste protocolo ao zooplâncton, examinou-se a alteração do limite térmico superior, indicada pelo LT50, através da ontogenia nas larvas dos dólares de areia (Dendraster excentricus). Dólares de areia gravídica foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). A liberação de gametas foi induzida pela injeção de 0,5-1 mL de cloreto de potássio 0,35 M. Os ovos coletados foram enxaguados através de tela de nylon de 63 μm com água do mar filtrada de 0,45 μm. O esperma foi coletado seco e mantido no gelo. Os óvulos foram fertilizados a ~104 espermatozoides por mL. Culturas de jardim comuns foram criadas com gametas de três machos e três fêmeas em cinco indivíduos por mL. Essas culturas larvais foram mantidas em água do mar filtrada com uma salinidade de 32 psu a 18 °C sob um ciclo claro:escuro de 12:12 com mudança completa da água a cada dois dias.
À medida que os dólares de areia larval se desenvolveram, o limite térmico superior aumentou de 28,6 °C (± 0,02 °C S.E) em 2 dias pós-fertilização para 28,8 °C (± 0,02 °C S.E) em 4 dias pós-fertilização e 29,3 °C (± 0,02 °C S.E) em 6 dias pós-fertilização (Figura 3). Esses limites térmicos superiores sugerem que os dólares de areia vivem dentro de seu limite térmico durante a temperatura média da superfície do mar no verão de ~ 20 ° C ou inferior ao longo da costa do Pacífico. No entanto, com o aumento da frequência e intensidade das ondas de calor marinhas, a temperatura máxima continua a subir. Uma temperatura de pico de 26,4 °C foi registrada no sul da Califórnia Bight em agosto de 2018 (Fumo et al.24). Dado que esta espécie se reproduz na primavera e no verão, a sobrevivência de seu estágio inicial de vida provavelmente diminuirá durante esses eventos extremos. A sobrevivência prevista diminuiria em 10% quando a temperatura atingisse 26,5 °C.
Comparações pareadas pelo teste de razão desenvolvido por Wheeler et al.25 sugerem que a mediana da temperatura letal foi significativamente diferente entre as três faixas etárias (p < 0,001). Estágios iniciais (gastrula e prismas iniciais com 2 dias de idade) foram mais sensíveis ao estresse térmico do que larvas mais velhas. Esta observação sugere que o limite térmico deduzido de um único ponto de tempo de desenvolvimento não é representativo dessa espécie ao longo de sua história de vida.
Figura 1: Diagrama rotulado do bloco de calor. (A) Vista superior da configuração com todos os componentes conectados. (B,D) Colocação e conexões para os terminais do aquecedor. (C,E) Colocação do permutador de calor (elemenet de arrefecimento) e das tubagens associadas ao banho-maria. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mudanças de temperatura no bloco de calor ao longo de 1 h com endpoints ajustados para 15 e 37 °C . (A) Um gradiente linear foi alcançado dentro de 1 h. A alteração nas configurações do endpoint varia a faixa de temperatura, e a maior faixa foi de 14 °C a 40 °C. (B) A diferença de temperatura entre as fileiras replicadas foi insignificante (<0,8 °C); os dados de duas linhas replicadas foram plotados para cada configuração em (B). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Sobrevivência de larvas de areia (Dendraster excentricus) em uma faixa de temperatura de 19 a 37 °C através de ontogenia (2, 4 e 6 dias pós-fertilização [dpf]). Cada dado representa a proporção de larvas que sobreviveram a uma incubação de 2 h à temperatura específica, seguida de um período de recuperação de 1 h. Uma regressão logística foi realizada utilizando o modelo linear generalizado com distribuição binomial no software estatístico R. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Arquivo de codificação suplementar 1: Um script R para gerar curvas logísticas para o conjunto de dados com um exemplo passo a passo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 2: Um script R para gerar estimativas LT50 . Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este protocolo fornece uma abordagem acessível e personalizável para determinar os limites térmicos de pequenos organismos de plâncton através da exposição térmica aguda. O design de 10 furos e os endpoints de temperatura flexíveis, controlados pelo banho-maria na extremidade inferior e pelo aquecedor na extremidade superior, permitem determinar o LT50 com precisão. Usando essa abordagem, uma diferença no limite térmico que é de <1 °C pôde ser detectada (Figura 3). Essa abordagem fornece uma rápida determinação dos limites térmicos (em horas) para uma variedade de espécies, e os valores resultantes têm sido aplicados a modelos de distribuição de múltiplas espécies 2,21. No entanto, é importante ressaltar que a exposição aguda provavelmente fornece uma estimativa de tolerância térmica diferente quando comparada à exposição crônica 8,26.
Uma grande vantagem do projeto atual é que 10 tratamentos de temperatura e seis repetições estão incluídos em uma pequena área de cobertura (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm). Publicações anteriores usando uma abordagem semelhante de gradiente térmico para determinar limites térmicos utilizaram barras de alumínio maiores (180 cm x 10 cm x 6 cm em 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm em 10 e 60 cm x20 cm em17). Enquanto os banhos secos que mantêm uma única temperatura são menores (por exemplo, 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) e oferecem múltiplas replicações, várias unidades (mais de quatro) são necessárias para gerar uma curva de desempenho que inclua várias temperaturas, ou os experimentos precisam ser repetidos ao longo do tempo, o que poderia introduzir fatores de confusão. O design do bloco de calor reduz o custo de fabricação e os requisitos de espaço. A fabricação pode ser concluída com uma prensa de perfuração, ou pesquisadores sem acesso imediato a uma fresadora podem optar por serviços comerciais de usinagem CNC. O uso de peças comercialmente disponíveis controla ainda mais o custo de fabricação. Se alguém puder usar um banho de água de aquecimento / resfriamento existente ou resfriadores de aquário, o custo restante das peças totaliza menos de US $ 350. Caso contrário, os resfriadores de aquário para um tanque de peixes de 10 galões (~ 35 L) podem ser comprados por < $ 150.
O desenho atual pode ser modificado para atender às necessidades do pesquisador. Se os organismos alvo forem maiores em tamanho, frascos de cintilação são bons recipientes alternativos, e buracos maiores seriam necessários. Dito isto, o bloco de alumínio é removível no projeto atual, de modo que vários blocos podem ser feitos e trocados para atender às necessidades experimentais. Se o objetivo do experimento é determinar um limite térmico inferior ou se concentrar em organismos polares, colocar blocos de água de resfriamento em ambas as extremidades do bloco de alumínio principal é mais apropriado.
À semelhança de outros estudos sobre zooplâncton, o protocolo atual não inclui uma fase de resfriamento gradual20,27. Os pesquisadores podem considerar a remoção dos tubos de microcentrífuga em pares e deslocá-los para baixo do gradiente de temperatura (ou seja, invertendo as etapas 3.9-3.12) para alcançar o resfriamento gradual se os organismos de estudo forem sensíveis a uma diminuição súbita da temperatura.
A utilidade dessa configuração pode ser diminuída por vários fatores, a saber, a escolha de (1) as configurações de temperatura do ponto final, (2) a duração da exposição e da recuperação e 3) a métrica usada para determinar o estado binomial (vivo vs. morto; desenvolvido vs. não desenvolvido). Para abordar essas possíveis limitações, o teste preliminar é altamente recomendado.
Como a regressão logística assume uma distribuição binomial, os desfechos com 100% de sobrevida e mortalidade são preferidos. Para os organismos marinhos, uma gama de partida razoável seria a temperatura média anual da superfície do mar do local de colheita acrescida de 10-15 °C. Pode-se então estreitar a faixa de temperatura investigada após tal teste inicial, pois quanto menor a diferença de temperatura entre os buracos, mais ajustada a estimativa LT50 .
A duração da exposição e da recuperação são específicas da espécie. Por exemplo, Kuo et al.27 permitiram que os búzios juvenis (Nucella canaliculata) se recuperassem por 24 h, enquanto Hammond et al.28 permitiram que os ouriços-roxos larvais (Stronglylocentrotus purprtaus) se recuperassem por 24 h, enquanto Hammond et al.28 permitiram que os ouriços-roxos larvais (Stronglylocentrotus purprtaus) se recuperassem. Pode-se realizar um pequeno experimento para determinar se a contagem de vivos:mortos difere entre os períodos de recuperação. Dependendo da definição do estado binomial escolhido (por exemplo, vivo versus morto), o tempo de recuperação pode não ser necessário. Se o objetivo do experimento é testar se os processos de desenvolvimento, como clivagem e gastrulação, ocorrem em uma faixa de temperaturas. Em outras palavras, o estado binomial utilizado no modelo seria desenvolvido versus não desenvolvido 8,19,21. Fixadores como o paraformaldeído a 4% devem ser adicionados às amostras no período de exposição térmica sem qualquer tempo de recuperação.
Para garantir a contagem precisa e a determinação do estado binomial (vivo vs. morto; desenvolvido vs. não desenvolvido), é aconselhável contar as amostras após o tempo de recuperação aleatoriamente para evitar possíveis vieses do observador . Se houver pessoal suficiente, diferentes pesquisadores poderiam contar as linhas replicadas e comparar seus resultados. Alternativamente, os indivíduos podem contar repetidamente um pequeno subconjunto das amostras e verificar se os números são consistentes.
Outra limitação potencial é a falta de estimativa de erro do LT50 a partir de amostras independentes29. O método atual de análise de dados fornece um intervalo de confiança de 95% ao longo da curva logística ajustada (Arquivo de Codificação Suplementar 1) e um erro padrão do LT50 (Arquivo de Codificação Suplementar 2). Esses limites de erro são gerados a partir do processo de ajuste da curva, não por meio de múltiplas medidas de indivíduos da população amostral. Dado que o projeto atual do bloco de calor tem seis linhas, pode-se ajustar os dados de cada linha para gerar seis estimativas LT50 e obter as estimativas de erro baseadas em observação.
Em resumo, uma abordagem acessível para determinar limites térmicos agudos que podem ser aplicados a uma ampla variedade de zooplâncton é apresentada. Esta configuração pode ser usada para determinar os limites térmicos de vários organismos e para identificar estágios de desenvolvimento que são vulneráveis. Essas informações podem ajudar a melhorar a previsão do desempenho do organismo e as potenciais interações da comunidade em face das mudanças climáticas globais.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Faculdade do Swarthmore College [KC] e pela Robert Reynolds e Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship para BJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
