Summary
O presente protocolo descreve a maceração e limpeza de ossos de cadáveres com uma técnica de imersão em banho de água quente e selada a vácuo. Este é um método de baixo custo, seguro e eficaz para produzir espécimes anatômicos para planejamento cirúrgico e educação médica como uma alternativa aos modelos impressos tridimensionais (3D).
Abstract
Os modelos ósseos servem a muitos propósitos, incluindo a melhoria da compreensão anatômica, o planejamento cirúrgico pré-operatório e a referência intraoperatória. Diversas técnicas para a maceração de tecidos moles têm sido descritas, principalmente para análise forense. Para pesquisa clínica e uso médico, esses métodos foram substituídos por modelos impressos tridimensionais (3D), que exigem equipamentos e conhecimentos substanciais e são caros. Aqui, o osso vertebral de ovinos cadavéricos foi limpo por selagem a vácuo do espécime com detergente comercial para lavar louça, imersão em banho de água quente e, posteriormente, remoção manual do tecido mole. Isso eliminou as desvantagens dos métodos de maceração anteriormente existentes, como a existência de odores desagradáveis, o uso de produtos químicos perigosos, equipamentos substanciais e altos custos. A técnica descrita produziu amostras limpas e secas, mantendo detalhes anatômicos e estrutura para modelar com precisão as estruturas ósseas que podem ser úteis para o planejamento pré-operatório e referência intraoperatória. O método é simples, de baixo custo e eficaz para a preparação de modelos ósseos para educação e planejamento cirúrgico em medicina veterinária e humana.
Introduction
A remoção de tecidos moles e a limpeza de ossos são necessárias para fins forenses, pesquisa médica e biológica e educação veterinária e médica. A maioria das técnicas foi desenvolvida para fins forenses, minimizando os danos ao osso para preservar o máximo de detalhes possível. Isso pode fornecer um modelo ósseo preciso e tangível para o planejamento cirúrgico pré-operatório, bem como para a tomada de decisão intraoperatória para ajudar a minimizar as complicações 1,2,3. Isso é benéfico na cirurgia, reduzindo os tempos de operação e a perda de sangue e melhorando a comunicação entre os cirurgiões, em comparação com o planejamento com imagens 2D4. O uso desses modelos também pode reduzir a dependência de imagens intraoperatórias, como a fluoroscopia, o que pode reduzir a exposição ao pessoal à radiação.
O osso esquelético de cadáveres tem sido historicamente usado para esses modelos; no entanto, os avanços tecnológicos têm empurrado para o uso de modelos fabricados e, mais recentemente, modelos impressos tridimensionais (3D). Os modelos ósseos dependem da disponibilidade de amostras cadavéricas e da eficiência do processamento dessas amostras em modelos utilizáveis. A impressão 3D tem a vantagem da liberdade criativa, permitindo modelos anatômicos e específicos do paciente, especialmente quando anormalidades anatômicas ou neoplasias estão presentes, ou se o hardware precisa ser fabricado ou aumentado para se adequar ao paciente1. Essas amostras também podem ser esterilizadas e manipuladas por cirurgiões durante um procedimento. No entanto, essa liberdade tem um custo, pois requer tomografia computadorizada (TC), os materiais e equipamentos necessários podem ser caros, e a expertise é essencial para a criação dos modelos no software requerido 1,4. Além disso, esses fatores podem limitar a precisão e a qualidade do modelo e, consequentemente, o planejamento cirúrgico e o sucesso1. Os modelos impressos em 3D podem não ser a melhor escolha para os casos em que não há necessidade de anatomia específica do paciente e onde há uma exigência imediata para o modelo.
Métodos comumente aplicados para a remoção de tecidos moles do osso cadavérico incluem limpeza manual, maceração bacteriana, maceração química, cozimento e maceração de insetos 5,6. O sucesso desses métodos geralmente se baseia no custo, no tempo, na mão de obra, no equipamento, na segurança e na qualidade do produto final 5,7. A limpeza manual requer mais trabalho e uma quantidade significativa de tempo, mas envolve o mínimo de equipamento5. A maceração bacteriana consiste em deixar a amostra em banho-maria fria ou morna por longos períodos de tempo, muitas vezes até 3 semanas, permitindo que as bactérias decomponham o tecido6. Isso cria odores desagradáveis, requer equipamentos adicionais para tratar as bactérias e cria um risco à biossegurança para o usuário 5,6. O uso de besouros dermestídeos é muito eficaz com mão-de-obra mínima, mas requer a aquisição de uma colônia e criação dos animais, não sendo considerado um investimento econômico se utilizado com pouca frequência 6,7. A maceração química geralmente envolve o uso de enzimas como tripsina, pepsina e papaína, ou detergentes comerciais contendo substâncias como surfactantes e enzimas 5,8. Embora esse método proporcione resultados mais rápidos, os produtos químicos utilizados, como hidróxido de sódio, amônia, água sanitária e gasolina, podem representar um risco à saúde e à segurança e produzir odores nocivos que requerem equipamentos de proteção individual (EPIs) e exaustor 5,7,8,9. Finalmente, o aquecimento prolongado fornece outro método minimamente intensivo, mas pode produzir odores que requerem ventilação10.
Um método simples, seguro e de baixo custo para a preparação de modelos anatômicos ósseos forneceria uma ferramenta útil para cirurgiões, estudantes, educadores e pesquisadores. Este artigo descreve um novo método para a preparação de modelos ósseos esqueléticos que evita odores desagradáveis e produtos químicos nocivos e produz um modelo cirúrgico detalhado com o mínimo de equipamento e mão de obra.
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Protocol
As espinhas lombares foram colhidas de ovelhas adultas Merino (Ovis aries) de 4 anos de idade, seguindo as diretrizes éticas do Comitê de Ética e Cuidado Animal dos Laboratórios de Pesquisa Cirúrgica e Ortopédica. Seguindo o método institucionalmente aprovado de eutanásia humana, as espinhas lombares foram colhidas usando uma ferramenta de dissecção afiada, primeiro incidindo através da pele e tecidos subcutâneos, seguido de fáscia e musculatura antes da desarticulação nas junções toracolombar e lombossacral. Uma amostra colhida é mostrada na Figura 1A.
1. Preparação para o banho inicial
- Remova manualmente o tecido mole (músculo, tecido conjuntivo, gordura, etc.) usando uma ferramenta de dissecção afiada (lâmina de bisturi número 22) da amostra óssea antes de processar ainda mais.
Observação : esta etapa é opcional; no entanto, a remoção do máximo de tecido mole possível reduz o tempo que o banho-maria leva para macerar os tecidos. O tamanho do espécime (~20 cm x 10 cm x 8 cm) também é reduzido; portanto, mais amostras podem ser instaladas no banho. - Sele a amostra em um saco plástico selado à prova de calor depois de remover o ar. Recomenda-se usar um saco de vácuo usando um dispositivo comercial de vedação a vácuo (consulte Tabela de materiais).
NOTA: Não são necessários aditivos para o banho inicial de 24 horas. Se houver músculo significativo cobrindo todas as superfícies do osso e se já houver um mínimo de tecido mole e a maioria das superfícies ósseas da amostra estiver exposta, prossiga para a etapa 3.2 (Figura 1B).
2. Procedimento para o banho inicial
- Submergir completamente a amostra selada em banho-maria a 70 °C durante 24 h.
- Após 24 h, retire o saco do banho, abra o saco e deixe a amostra arrefecer até ser manuseável.
3. Preparação para os banhos subsequentes
- Remova o máximo de tecido mole possível do osso usando um bisturi afiado e água corrente, conforme necessário.
- Desarticular quaisquer articulações usando um bisturi afiado para expor o tecido cartilaginoso.
- Mantenha as peças desarticuladas in situ usando material como fios ortopédicos ou abraçadeiras (consulte Tabela de Materiais) para manter a posição anatômica.
- Selar a amostra num saco de vácuo juntamente com 10 ml de detergente para lavar louça (ver Tabela de Materiais) e 10 ml de água da torneira.
NOTA: O volume de detergente depende da resistência, concentração e tamanho da amostra.
4. Procedimento para banhos subsequentes
- Submergir completamente a amostra selada em banho-maria a 70 °C durante 24 h.
- Após 24 h, retire o saco do banho, abra o saco e deixe a amostra arrefecer até ser manuseável.
- Evite deixar a amostra esfriar completamente, pois isso permite que a cartilagem amolecida endureça e adira ao osso, tornando-se mais difícil de remover.
NOTA: O tempo necessário para o processamento da amostra pode variar com base no tamanho e tipo, e a remoção repetida de banhos subsequentes pode ser desnecessária. Além disso, a amostra pode permanecer no banho por longos períodos, o que pode ajudar na remoção provisória de tecidos.
- Evite deixar a amostra esfriar completamente, pois isso permite que a cartilagem amolecida endureça e adira ao osso, tornando-se mais difícil de remover.
- Remova o máximo de tecido mole possível usando uma ferramenta de dissecação afiada (lâmina de bisturi número 22 em uma alça de bisturi dedicada) e água corrente.
- Repita o passo 4 conforme necessário até que o osso esteja livre de material de tecidos moles. Em nossa experiência, isso era necessário para ser repetido apenas uma vez.
5. Conclusão do procedimento
- Lave a amostra com detergente líquido e enxágue bem com água.
NOTA: O álcool pode ser usado para acelerar a secagem. - Deixar a amostra secar durante cerca de 48 h.
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Representative Results
Seguindo esse protocolo, foram criados modelos de coluna vertebral lombar de ovinos limpos e secos para planejamento e referência cirúrgica. Amostras constituídas por sete vértebras lombares foram processadas em até 4 dias utilizando este método, com um banho inicial para remover a maior parte do músculo e três banhos subsequentes. A conclusão dos banhos foi indicada pela facilidade com que a cartilagem e o tecido conjuntivo foram removidos do osso. Isso variou com base no tipo e localização da cartilagem; camadas finas eram facilmente removidas após um ou dois banhos, mas o material espesso cercado por outros tecidos, como discos intervertebrais, tomava três ou quatro banhos. Após a secagem por 48 h, esperava-se que os ossos fossem muito mais claros em cor e peso e se sentissem secos e não gordurosos. Os modelos ósseos produzidos fornecem uma representação precisa da anatomia, preservando as estruturas ósseas finas e os contornos do osso, especificamente facetas articulares, a placa terminal vertebral e os processos transversais, em comparação com os modelos impressos em 3D. Para comparação, uma coluna vertebral ovina lombar foi computadorizada com uma espessura de corte de 0,5 mm, importada para um software de modelagem 3D (ver Tabela de Materiais) e segmentada para produzir um modelo de uma vértebra individual. Este foi então impresso usando filamento de acrilonitrila butadieno estireno (ABS) em uma impressora 3D. A Figura 2 mostra o modelo impresso em 3D de uma coluna lombar de ovelha em comparação com o modelo anatômico cadavérico produzido a partir das imersões em banho de água quente seladas a vácuo. As imagens comparativas mostram que o modelo impresso em 3D não detalha com precisão detalhes ósseos finos dos espécimes cadavéricos, com uma perda de detalhes mais finos, como contornos do osso, especialmente nos processos transversais.
Figura 1: Amostras de coluna lombar de ovinos em diferentes estágios durante o processamento. (A) A coluna lombar recém-colhida requer preparação e um banho inicial (etapas 1-2), enquanto (B) a amostra com o mínimo de tecido mole pode prosseguir para banhos subsequentes (etapa 3.2). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação qualitativa entre modelos ósseos impressos em 3D e cadavéricos. Uma comparação de (A,B) um modelo impresso em 3D e (C,D) um modelo ósseo cadavérico demonstra perda de detalhes em pontos mais finos, como as extremidades dos processos transversais e detalhes facetárias no modelo impresso em 3D em relação ao osso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Espinhos lombares de ovinos processados por imersão em banho de água quente. Modelos de coluna lombar de ovinos processados na mesma etapa do processamento; no entanto, a amostra à esquerda (A) foi processada com detergente, e a amostra à direita (B) foi sem. A diferença de cor e textura deve ser notada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Esta nota técnica tem como objetivo descrever um método simples, seguro e de baixo custo para produzir um modelo anatômico ósseo para o benefício da educação veterinária e médica e para uso na educação anatômica e planejamento cirúrgico.
Testes piloto descobriram que uma temperatura de banho de 70 °C proporcionou o tempo de processamento mais rápido sem causar danos às amostras. Temperaturas mais altas causaram uma extensa quebra de colágeno dentro do osso, resultando em amostras quebradiças com uma textura calcária. O banho quente neste experimento foi especificamente para o processamento de amostras impressas em 3D e foi utilizado devido à sua conveniência; no entanto, outras opções comerciais mais baratas, como fogões lentos ou dispositivos sous vide, podem ser mais acessíveis.
A adição de detergente foi um passo crítico no protocolo. Em comparação com amostras sem detergente, a adição de detergente reduziu o tempo de conclusão de 168 h para 96 h. Amostras sem detergente não secaram completamente e pareciam visivelmente mais escuras com uma sensação gordurosa, ambas presumivelmente devido ao acúmulo de lipídios dentro da superfície óssea. Amostras preenchidas que pareçam escuras ou gordurosas podem indicar a necessidade de detergente adicional (Figura 3). Durante os testes piloto, o detergente sozinho não conseguiu se dispersar uniformemente ao longo das amostras, uma vez selado, exigindo o uso de água adicionalmente. Quando água e detergente foram adicionados aos sacos antes da vedação, ocasionalmente houve dificuldade em criar uma vedação a vácuo confiável, que pode ser evitada congelando líquidos de antemão. O detergente utilizado neste protocolo, um detergente geral para lavar louça, foi escolhido com base no custo e na disponibilidade. Este método pode ser realizado usando qualquer detergente para lavar louça para obter resultados semelhantes. Outros produtos de limpeza doméstica multiuso contendo 2-butoxietanol podem auxiliar na desengorduramento e na quebra dos tecidos moles de forma mais eficaz e, portanto, podem ser benéficos para amostras com cartilagem excessiva ou resistente, como discos intervertebrais7. Os detergentes enzimáticos que digerem ativamente os tecidos moles podem ser usados para reduzir o tempo de maceração em comparação com os detergentes de limpeza regulares, mas os efeitos podem ser imprevisíveis, especialmente se o usuário não estiver familiarizado com seu uso 6,10. Embora a maceração enzimática represente um maior risco para a saúde, ela tem o potencial de reduzir o tempo de processamento de dias para horas 5,6. Este método também se beneficia significativamente da agitação para promover uma reação enzimática com tecidos moles, que pode ser prejudicada pela falta de fluxo dentro do saco selado a vácuo.
A desarticulação das vértebras foi notavelmente mais fácil quando o detergente foi adicionado; além disso, após banhos de detergente subsequentes, os discos intervertebrais ficaram mais macios e fáceis de remover, presumivelmente devido a uma maior área de superfície para penetração de detergente uma vez desarticulados. Portanto, as amostras foram preenchidas em menor tempo quando desarticuladas de antemão. Da mesma forma, se as amostras iniciais contiverem áreas espessas de cartilagem, a remoção manual pode ser necessária entre os banhos para promover a penetração de detergente. Além disso, mexer um banho de maceração típico demonstrou reduzir significativamente o tempo necessário, mas isso não é possível com amostras ensacadas10. Adicionar detergente com pequenas quantidades de água no saco e desarticular as articulações o mais cedo possível pode reduzir o impacto dessas limitações.
Outro passo crítico foi evitar deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente após a remoção do banho quente, pois o calor residual permitiu uma remoção mais fácil da cartilagem amolecida das amostras. Quando deixada esfriar, essa cartilagem formava um revestimento duro e gelatinoso no osso que era difícil de remover sem reaquecer a amostra. Pela mesma razão, se a água corrente for usada para ajudar na remoção dos tecidos moles, recomenda-se o uso de água morna.
Ao contrário dos modelos impressos em 3D, este método produz amostras ósseas para replicar assuntos reais para o planejamento cirúrgico. O uso de detergentes suaves nesse método pode evitar alterações na integridade da superfície óssea, como visto quando se utilizam produtos alternativos, como água sanitária e peróxido de hidrogênio6. Com novos desenvolvimentos na impressão 3D para pesquisa médica, os modelos podem ser impressos com parâmetros personalizados, como a espessura cortical, que demonstraram fornecer uma simulação háptica positiva da colocação do parafuso pedicular na cirurgia da coluna vertebral11. No entanto, essas amostras podem ser caras de produzir e requerem softwares e equipamentos específicos, bem como planejamento e processamento meticulosos11,12. Além disso, a qualidade dos modelos impressos em 3D é limitada pelo equipamento e pode arriscar a perda de detalhes mais finos que são preservados dentro da amostra óssea13. Os modelos específicos do paciente e impressos em 3D têm várias aplicações práticas, enquanto os modelos anatômicos provenientes do osso podem fornecer detalhes anatômicos incomparáveis com custo e equipamento mínimos.
As limitações deste método incluem a disponibilidade de espécimes cadavéricos específicos para a sua aplicação. O método descrito remove completamente o tecido mole do osso, criando modelos que só podem ser usados para planejamento cirúrgico relacionado ao osso, e não é tão prático para visualizar articulação, biomecânica ou estruturas circundantes. Devido a essa perda de articulação, a reconstrução dos modelos pode ser necessária. O método de reconstrução varia de acordo com o tipo de osso e pode incluir silicone, fio, abraçadeiras ou cola. Embora se aproximem das localizações relativas dos ossos, essas técnicas não podem replicar a mecânica in vivo e reduzir a tradução para a prática cirúrgica. Outras limitações incluem o tempo necessário para remover o excesso de tecidos moles de grandes amostras, bem como cartilagem e outros tecidos moles, se presentes, com base na região anatômica da amostra.
A capacidade de produzir modelos ósseos simples pode afetar significativamente o sucesso cirúrgico. Modelos de planejamento cirúrgico têm benefícios comprovados, incluindo redução do tempo cirúrgico, colocação mais precisa de parafusos e implantes e menos complicações, como perda de sangue4. Isso é especialmente útil no caso da cirurgia veterinária, onde a anatomia varia muito de acordo com a espécie. Este protocolo simples tem o potencial de produzir modelos ósseos limpos a partir de cadáveres sem produtos químicos perigosos e odores constantes e requer o mínimo de equipamento e trabalho, especialmente quando comparado com as modernas técnicas de impressão 3D.
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Disclosures
Os autores têm que divulgar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension Elite 3D printer | Stratasys, Eden Prairie, MN, United States | 3D printer for production of surgical bone models based on reconstructed CT scans | |
| Mimics Innovation Suite | Materialise NV, Leuven, Belgium | Suite 24 | Software to create 3D models from imaging scans |
| Nylon cable ties | 4Cabling, Alexandria, NSW, Australia | 011.060.1042/011.060.1039 | Used to maintain connection between vertebral bodies |
| Orthopaedic wire | B Braun, Bella Vista, NSW, Australia | Used to maintain connection between vertebral bodies | |
| Support Cleaning Apparatus | Phoenix Analysis and Design Technologies, Tempe, AZ, United States | SCA-1200 | Hot water bath for immersion of the sealed sample. |
| Ultra Strength Original Dishwashing Liquid | Colgate-Palmolive, New York, NY, United States | Dishwashing liquid added to sealed bag with sample for cleaning of the bone model. | |
| Vacuum bags | Pacfood PTY LTD | Heat safe, sealable plastic bags | |
| Vacuum Food sealer | Tempoo (Aust) PTY LTD | Vacuum food sealer to seal vacuum bags prior to bath immersion |
References
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