Summary
本协议描述了用真空密封的热水浴浸泡技术浸渍和清洁尸体骨。这是一种低成本、安全且有效的方法，用于生产用于手术计划和医学教育的解剖标本，可替代三维 （3D） 打印模型。
Abstract
骨骼模型有多种用途，包括提高解剖学理解、术前手术计划和术中参考。已经描述了几种用于软组织浸渍的技术，主要用于法医分析。对于临床研究和医疗用途，这些方法已被三维（3D）打印模型所取代，这些模型需要大量的设备和专业知识，而且成本高昂。在这里，尸体羊椎骨通过用商业洗碗剂真空密封标本，浸入热水浴中，然后手动去除软组织来清洁。这消除了以前存在的浸渍方法的缺点，例如存在恶臭，使用危险化学品，大量设备和高成本。所描述的技术产生了干净、干燥的样本，同时保持解剖细节和结构，以准确模拟可用于术前计划和术中参考的骨结构。该方法简单、成本低，对兽医和人类医学教育和手术计划的骨模型制备有效。
Introduction
去除软组织和清洁骨骼是法医、医学和生物学研究以及兽医和医学教育所必需的。大多数技术都是为法医目的而开发的，最大限度地减少对骨骼的损害，以保留尽可能多的细节。这可以为术前手术计划以及术中决策提供准确、有形的骨骼模型，以帮助最大限度地减少并发症1，2，3。与使用 2D 图像进行规划相比，这有利于手术，因为它可以减少手术时间和失血量，并改善外科医生之间的沟通4.使用这些模型还可以减少对术中成像（如透视）的依赖，这可以减少对人员的辐射暴露。
尸体的骨骼骨历来被用于这些模型;然而，技术进步已经推动了制造模型的使用，以及最近的三维（3D）打印模型。骨骼模型依赖于尸体样本的可用性以及将这些样本处理成可用模型的效率。3D打印具有创作自由的优势，允许解剖学和患者特定的模型，特别是当存在解剖异常或肿瘤时，或者如果硬件需要制造或增强以适应患者1。这些样本也可以在手术过程中由外科医生进行消毒和操作。然而，这种自由是有代价的，因为它需要计算机断层扫描（CT），所需的材料和设备可能很昂贵，并且专业知识对于在所需的软件中创建模型至关重要1，4。此外，这些因素会限制模型的精度和质量，从而限制手术计划和成功1.对于不需要患者特定的解剖结构并且对模型有直接需求的情况，3D打印模型可能不是最佳选择。
从尸体骨中去除软组织的常用方法包括手动清洁，细菌浸渍，化学浸渍，烹饪和昆虫浸渍5，6。这些方法的成功通常基于最终产品的成本、时间、劳动力、设备、安全性和质量5，7。手动清洁需要最多的劳动力和大量时间，但涉及的设备最少5.细菌浸渍包括将样品长时间留在冷水浴或温水浴中，通常长达 3 周，让细菌分解组织6.这会产生难闻的气味，需要额外的设备来处理细菌，并对用户造成生物安全危害5，6。使用真皮甲虫非常有效，劳动力最少，但需要获得动物的殖民地和饲养，如果不经常使用，则不被视为经济投资6，7。化学浸渍通常涉及使用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等酶，或含有表面活性剂和酶5，8 等物质的商业洗涤剂。虽然这种方法提供了更快的结果，但使用的化学品，如氢氧化钠、氨、漂白剂和汽油，可能会带来健康和安全风险，并产生有毒气味，需要个人防护装备 （PPE） 和通风橱5，7，8，9。最后，扩展加热提供了另一种最低强度的方法，但可能会产生需要通风的气味10。
一种简单、安全且低成本的解剖骨骼模型制备方法将为外科医生、学生、教育工作者和研究人员提供有用的工具。本文介绍了一种制备骨骼模型的新方法，该方法避免了难闻的气味和有毒化学物质，并以最少的设备和劳动力生成了详细的手术模型。
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Protocol
腰椎是从4岁的美利奴杂交成年母羊 （Ovis aries） 中收获的，遵循外科和骨科研究实验室动物护理和伦理委员会的伦理准则。按照机构认可的人道安乐死方法，使用锋利的解剖工具收获腰椎，首先切开皮肤和皮下组织，然后在胸腰椎和腰骶交界处进行筋膜和肌肉组织。收获的样品如图 1A所示。
1. 初始入浴的准备
- 在进一步处理之前，使用锋利的解剖工具（22 号手术刀刀片）从骨样本中手动去除软组织（肌肉、结缔组织、脂肪等）。
注意：此步骤是可选的;然而，尽可能多地去除软组织可以减少水浴浸渍组织所需的时间。试样尺寸（~20 cm x 10 cm x 8 cm）也减小;因此，可以将更多的样品安装到浴槽中。 - 去除空气后，将样品密封在热安全的可密封塑料袋中。建议使用带有商用真空密封装置的真空袋（见 材料表）。
注意：初始24小时浴不需要添加剂。如果有明显的肌肉覆盖骨骼的所有表面，并且已经有最小的软组织并且样品的大部分骨表面都暴露在外，请继续步骤3.2（图1B）。
2. 初始入浴程序
- 将密封样品完全浸没在70°C水浴中24小时。
- 24小时后，从浴中取出袋子，打开袋子，让样品冷却直至可处理。
3. 后续浴池的准备
- 根据需要使用锋利的手术刀和流水从骨头上去除尽可能多的软组织。
- 使用锋利的手术刀断开任何关节，露出软骨组织。
- 使用矫形线或扎带等材料将脱节的碎片保持在 原位 （见 材料表）以保持解剖位置。
- 将样品与 10 mL 餐具洗涤剂（参见 材料表）和 10 mL 自来水一起密封在真空袋中。
注意：洗涤剂的体积取决于样品的强度、浓度和大小。
4. 后续浴池的程序
- 将密封样品完全浸没在70°C水浴中24小时。
- 24小时后，从浴中取出袋子，打开袋子，让样品冷却直至可处理。
- 避免让样品完全冷却，因为这会使软化的软骨变硬并粘附在骨骼上，变得更加难以去除。
注意：样品处理所需的时间可能因尺寸和类型而异，并且可能不需要重复移除后续浴液。此外，样品可以在浴中停留较长时间，这可能有助于临时去除组织。
- 避免让样品完全冷却，因为这会使软化的软骨变硬并粘附在骨骼上，变得更加难以去除。
- 使用锋利的解剖工具（专用手术刀手柄上的 22 号手术刀刀片）和流水尽可能多地去除软组织。
- 根据需要重复步骤4，直到骨骼没有软组织材料。根据我们的经验，这只需要重复一次。
5. 完成程序
- 用液体洗涤剂清洗样品并用水彻底冲洗。
注意：酒精可用于加速干燥。 - 让样品干燥约48小时。
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Representative Results
按照该协议，创建了清洁干燥的绵羊腰椎柱模型，以供手术计划和参考。使用这种方法在4天内处理由7块腰椎组成的样本，其中1次初始浴以去除大部分肌肉，随后进行3次浴。浴的完成是通过从骨头中去除软骨和结缔组织的难易程度来表示的。这根据软骨的类型和位置而变化;洗一两次澡后很容易去除薄层，但被其他组织包围的厚材料，如椎间盘，需要三到四次洗澡。干燥48小时后，预计骨骼的颜色和重量会更轻，感觉干燥不油腻。与3D打印模型相比，生成的骨骼模型提供了解剖结构的准确表示，保留了骨骼的精细骨结构和轮廓，特别是关节面，椎体终板和横向过程。为了进行比较，将绵羊腰椎以0.5毫米的切片厚度进行CT扫描，导入3D建模软件（见 材料表），并分段以生成单个椎骨的模型。然后在3D打印机中使用丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）长丝进行打印。 图2 展示了绵羊腰椎的3D打印模型与真空密封热水浴浸泡产生的解剖尸体模型的比较。比较图像显示，3D打印模型没有准确详细说明尸体标本的精细骨细节，丢失了更精细的细节，例如骨骼轮廓，特别是在横向过程中。
图1：加工过程中不同阶段的绵羊腰椎样品。 （A）新鲜收获的腰椎需要准备和初始沐浴（步骤1-2），而（B）具有最少软组织的样品可以进行后续沐浴（步骤3.2）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：3D打印和尸体骨骼模型之间的定性比较。 （A，B）3D打印模型和（C，D）尸体骨骼模型的比较表明，在更精细的点上会丢失细节，例如横向过程的末端和3D打印模型中相对于骨骼的刻面细节。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用热水浴浸泡处理的羊腰椎。 加工羊腰椎模型在同一步骤加工;然而，（A）左边的样品是用洗涤剂处理的，而（B）右边的样品是没有的。必须注意颜色和质地的差异。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本技术说明旨在描述一种简单、安全且低成本的方法来生成解剖骨骼模型，以有益于兽医和医学教育，并用于解剖学教育和手术计划。
初步测试发现，70°C的浴温提供了最快的处理时间，而不会对样品造成损坏。较高的温度导致骨骼内的胶原蛋白广泛分解，导致具有白垩质地的脆性样品。该实验中的热水浴专门用于处理3D打印样品，并因其方便而使用;但是，其他较便宜的商业选择，例如慢炖锅或真空低温烹调设备，可能更容易获得。
添加洗涤剂是协议中的关键步骤。与不含洗涤剂的样品相比，添加去垢剂将完成时间从168 h减少到96 h。没有洗涤剂的样品没有完全干燥，看起来明显更暗，有油腻的感觉，这可能是由于骨表面的脂质积聚。看起来深色或油腻的成品样品可能表明需要额外的洗涤剂（图3）。在中试测试期间，一旦密封，单独的洗涤剂无法均匀分散在整个样品中，因此需要另外使用水。当在密封前将水和洗涤剂添加到袋子中时，有时难以形成可靠的真空密封，这可以通过事先冷冻液体来避免。本协议中使用的洗涤剂是一种通用餐具洗涤剂，是根据成本和可用性选择的。可以使用任何餐具洗涤剂来执行此方法以获得类似的结果。其他含有2-丁氧基乙醇的多用途家用清洁剂可能有助于更有效地脱脂和软组织分解，因此可能对软骨过多或坚韧的样品（例如椎间盘）有益7。与常规清洁剂相比，主动消化软组织的酶洗涤剂可用于减少浸渍时间，但效果可能是不可预测的，特别是如果用户不熟悉其用途6，10。虽然酶浸渍会带来更高的健康风险，但它有可能将处理时间从几天减少到几个小时5，6.该方法还受益于搅拌以促进与软组织的酶促反应，这可能由于真空密封袋内缺乏流动而受到阻碍。
当添加洗涤剂时，椎骨的脱节明显更容易;此外，在随后的洗涤剂浴之后，椎间盘更柔软，更容易去除，可能是由于一旦脱节，洗涤剂渗透的表面积更高。因此，事先拆解后，样品在更短的时间内完成。同样，如果初始样品包含厚厚的软骨区域，则可能需要在浴之间手动取出以促进洗涤剂渗透。此外，搅拌典型的浸渍浴已被证明可以显着减少所需的时间，但这对于袋装样品10是不可能的。在袋子中加入含有少量水的洗涤剂并尽早使关节脱节可以减少这些限制的影响。
另一个关键步骤是避免在从热水浴中取出后让样品冷却至室温，因为余热允许更容易地从样品中去除软化的软骨。当允许冷却时，该软骨在骨骼上形成坚韧的凝胶状涂层，如果不重新加热样品，很难去除。出于同样的原因，如果使用自来水来帮助去除软组织，建议使用温水。
与3D打印模型相反，这种方法产生骨骼样本以复制真实受试者以进行手术计划。在这种方法中使用温和的洗涤剂可以避免改变骨骼表面的完整性，如使用漂白剂和过氧化氢6等替代产品时所见。随着医学研究3D打印的进一步发展，可以使用皮质厚度等定制参数打印模型，这些参数已被证明可以提供脊柱手术中椎弓根螺钉放置的积极触觉模拟11。然而，这些样品的生产成本可能很高，并且需要特定的软件和设备，以及细致的计划和处理11，12。此外，3D打印模型的质量受到设备的限制，并且可能会丢失骨样本13中保存的更精细的细节。患者专用和3D打印模型具有多种实际应用，而来自骨骼的解剖模型可以以最低的成本和设备提供无与伦比的解剖细节。
这种方法的局限性包括特定于其应用的尸体标本的可用性。所描述的方法从骨骼中完全去除软组织，创建只能用于与骨骼相关的手术计划的模型，并且对于可视化关节，生物力学或周围结构并不实用。由于这种关节丧失，可能需要重建模型。重建方法因骨骼类型而异，可以包括硅胶、电线、扎带或胶水。在近似骨骼的相对位置的同时，这些技术无法复制 体内 力学并减少对外科实践的转化。其他限制包括根据标本的解剖区域从大样本以及软骨和其他软组织（如果存在）中去除多余的软组织所需的时间。
制作简单骨骼模型的能力可以显着影响手术成功。手术计划模型已被证明是有益的，包括减少手术时间、更准确的螺钉和植入物放置以及减少失血等并发症4.这在兽医手术的情况下特别有用，其中解剖结构因物种而异。这种简单的协议有可能从尸体中产生干净的骨骼模型，没有危险化学物质和恒定的气味，并且需要最少的设备和劳动力，特别是与现代3D打印技术相比。
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Disclosures
作者必须披露。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension Elite 3D printer | Stratasys, Eden Prairie, MN, United States | 3D printer for production of surgical bone models based on reconstructed CT scans | |
| Mimics Innovation Suite | Materialise NV, Leuven, Belgium | Suite 24 | Software to create 3D models from imaging scans |
| Nylon cable ties | 4Cabling, Alexandria, NSW, Australia | 011.060.1042/011.060.1039 | Used to maintain connection between vertebral bodies |
| Orthopaedic wire | B Braun, Bella Vista, NSW, Australia | Used to maintain connection between vertebral bodies | |
| Support Cleaning Apparatus | Phoenix Analysis and Design Technologies, Tempe, AZ, United States | SCA-1200 | Hot water bath for immersion of the sealed sample. |
| Ultra Strength Original Dishwashing Liquid | Colgate-Palmolive, New York, NY, United States | Dishwashing liquid added to sealed bag with sample for cleaning of the bone model. | |
| Vacuum bags | Pacfood PTY LTD | Heat safe, sealable plastic bags | |
| Vacuum Food sealer | Tempoo (Aust) PTY LTD | Vacuum food sealer to seal vacuum bags prior to bath immersion |
References
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