Vakuumforseglet nedsænkning i varmtvandsbad til fremstilling af anatomiske og kirurgiske kadaveriske knoglemodeller

Summary

Denne protokol beskriver maceration og rensning af kadaverisk knogle med en vakuumforseglet, varmtvandsbadsænkningsteknik. Dette er en billig, sikker og effektiv metode til fremstilling af anatomiske prøver til kirurgisk planlægning og medicinsk uddannelse som et alternativ til tredimensionelle (3D) trykte modeller.

Abstract

Knoglemodeller tjener mange formål, herunder forbedring af anatomisk forståelse, præoperativ kirurgisk planlægning og intraoperativ reference. Flere teknikker til maceration af blødt væv er blevet beskrevet, hovedsageligt til retsmedicinsk analyse. Til klinisk forskning og medicinsk brug er disse metoder blevet erstattet af tredimensionelle (3D) trykte modeller, som kræver betydeligt udstyr og ekspertise og er dyre. Her blev kadaveriske fårehvirvelben renset ved vakuumforsegling af prøven med kommercielt opvaskemiddel, nedsænkning i et varmt vandbad og efterfølgende manuel fjernelse af blødt væv. Dette eliminerede ulemperne ved de tidligere eksisterende macerationsmetoder, såsom eksistensen af dårlig lugt, brug af farlige kemikalier, betydeligt udstyr og høje omkostninger. Den beskrevne teknik producerede rene, tørre prøver, samtidig med at anatomiske detaljer og struktur opretholdes for nøjagtigt at modellere de osseøse strukturer, der kan være nyttige til præoperativ planlægning og intraoperativ reference. Metoden er enkel, billig og effektiv til knoglemodelforberedelse til uddannelse og kirurgisk planlægning inden for veterinær- og humanmedicin.

Introduction

Fjernelse af blødt væv og rengøring af knogler er påkrævet for retsmedicin, medicinsk og biologisk forskning og veterinær og medicinsk uddannelse. De fleste teknikker er udviklet til retsmedicinske formål, hvilket minimerer skader på knoglen for at bevare så mange detaljer som muligt. Dette kan give en nøjagtig, håndgribelig knoglemodel til præoperativ kirurgisk planlægning samt intraoperativ beslutningstagning for at minimere komplikationer ^1,2,3. Dette er gavnligt i kirurgi ved at reducere operationstider og blodtab og forbedre kommunikationen mellem kirurger sammenlignet med planlægning med 2D-billeder⁴. Brugen af disse modeller kan også reducere afhængigheden af intraoperativ billeddannelse, såsom fluoroskopi, hvilket kan reducere strålingseksponeringen for personale.

Skeletben fra kadavere er historisk blevet brugt til disse modeller; teknologiske fremskridt har imidlertid skubbet mod brugen af fremstillede modeller og for nylig tredimensionelle (3D) trykte modeller. Knoglemodeller er afhængige af tilgængeligheden af kadaverprøver og effektiviteten af behandlingen af disse prøver til brugbare modeller. 3D-udskrivning har fordelen ved kreativ frihed, der giver mulighed for anatomiske og patientspecifikke modeller, især når anatomiske abnormiteter eller neoplasmer er til stede, eller hvis hardwaren skal fremstilles eller forstærkes for at passe til patienten¹. Disse prøver kan også steriliseres og manipuleres af kirurger under en procedure. Denne frihed kommer dog med en pris, da det kræver computertomografi (CT) scanninger, de nødvendige materialer og udstyr kan være dyre, og ekspertise er afgørende for at skabe modellerne i den krævede software ^1,4. Derudover kan disse faktorer begrænse modellens præcision og kvalitet og dermed den kirurgiske planlægning og succes¹. 3D-printede modeller er muligvis ikke det bedste valg i tilfælde, hvor der ikke er behov for patientspecifik anatomi, og hvor der er et umiddelbart behov for modellen.

Almindeligt anvendte metoder til fjernelse af blødt væv fra kadaverisk knogle inkluderer manuel rengøring, bakteriel maceration, kemisk maceration, madlavning og insektmaceration ^5,6. Succesen med disse metoder er generelt baseret på omkostninger, tid, arbejdskraft, udstyr, sikkerhed og kvalitet af slutproduktet ^5,7. Manuel rengøring kræver mest arbejde og en betydelig mængde tid, men involverer minimalt udstyr⁵. Bakteriel maceration består i at efterlade prøven i et koldt eller varmt vandbad i lange perioder, ofte op til 3 uger, hvilket gør det muligt for bakterier at nedbryde vævet⁶. Dette skaber ubehagelige lugte, kræver ekstra udstyr til behandling af bakterierne og skaber en biosikkerhedsrisiko for brugeren ^5,6. Brugen af dermestidbiller er meget effektiv med minimal arbejdskraft, men kræver erhvervelse af en koloni og opdræt af dyrene og betragtes ikke som en økonomisk investering, hvis den sjældent anvendes ^6,7. Kemisk maceration involverer normalt anvendelse af enzymer såsom trypsin, pepsin og papain eller kommercielle rengøringsmidler, der indeholder stoffer som overfladeaktive stoffer og enzymer ^5,8. Selvom denne metode giver hurtigere resultater, kan de anvendte kemikalier, såsom natriumhydroxid, ammoniak, blegemiddel og benzin, udgøre en sundheds- og sikkerhedsrisiko og producere skadelige lugte, der kræver personlige værnemidler (PPE) og en stinkhætte 5,7,8,9. Endelig giver udvidet opvarmning en anden minimalt intensiv metode, men kan producere lugt, der kræver ventilation¹⁰.

En enkel, sikker og billig metode til fremstilling af anatomiske knoglemodeller ville give et nyttigt værktøj til kirurger, studerende, undervisere og forskere. Denne artikel beskriver en ny metode til fremstilling af skeletbenmodeller, der undgår ubehagelige lugte og skadelige kemikalier, og producerer en detaljeret kirurgisk model med minimalt udstyr og arbejdskraft.

Protocol

Lændehvirvelsøjlen blev høstet fra 4-årige Merino krydsvoksne moderfår (Ovis aries) efter de etiske retningslinjer fra Animal Care and Ethics Committee of the Surgical and Orthopaedic Research Laboratories. Efter den institutionelt godkendte metode til human dødshjælp blev lændehvirvelsøjlen høstet ved hjælp af et skarpt dissektionsværktøj, der først snittede gennem huden og subkutant væv, efterfulgt af fascia og muskulatur før disartikulation ved thoracolumbal- og lumbosakralkrydsene. En høstet prøve er vist i figur 1A.

1. Forberedelse til det første bad

1. Fjern blødt væv (muskel, bindevæv, fedt osv.) manuelt ved hjælp af et skarpt dissektionsværktøj (nummer 22 skalpelblad) fra knogleprøven, før du behandler yderligere.
   BEMÆRK: Dette trin er valgfrit; Fjernelse af så meget blødt væv som muligt reducerer dog den tid, vandbadet tager at macerere vævene. Prøvestørrelsen (~ 20 cm x 10 cm x 8 cm) reduceres også; Derfor kan flere prøver monteres i badet.
2. Forsegl prøven i en varmesikker, forseglbar plastpose, når luften er fjernet. Det anbefales at bruge en vakuumpose ved hjælp af en kommerciel vakuumforseglingsanordning (se materialetabel).
   BEMÆRK: Der kræves ingen tilsætningsstoffer til det indledende 24 timers bad. Hvis der er betydelige muskler, der dækker alle overflader af knoglen, og hvis der allerede er minimalt blødt væv, og de fleste af knogleoverfladerne i prøven er eksponerede, fortsættes til trin 3.2 (figur 1B).

2. Procedure for det indledende bad

1. Den forseglede prøve nedsænkes fuldstændigt i et 70 °C vandbad i 24 timer.
2. Efter 24 timer fjernes posen fra badet, åbnes posen, og prøven afkøles, indtil den kan håndteres.

3. Forberedelse til efterfølgende bade

1. Fjern så meget blødt væv fra knoglen som muligt ved hjælp af en skarp skalpel og rindende vand efter behov.
2. Disartikulere eventuelle led ved hjælp af en skarp skalpel for at udsætte bruskvævet.
   1. Hold de disartikulerede stykker in situ ved hjælp af materiale som ortopædisk ledning eller kabelbindere (se materialetabel) for at opretholde den anatomiske position.
3. Forsegl prøven i en vakuumpose sammen med 10 ml opvaskemiddel (se materialetabellen) og 10 ml postevand.
   BEMÆRK: Mængden af vaskemiddel afhænger af prøvens styrke, koncentration og størrelse.

4. Procedure for efterfølgende bade

1. Den forseglede prøve nedsænkes fuldstændigt i et 70 °C vandbad i 24 timer.
2. Efter 24 timer fjernes posen fra badet, åbnes posen, og prøven afkøles, indtil den kan håndteres.
   1. Undgå at lade prøven køle helt af, da dette gør det muligt for blødgjort brusk at hærde og klæbe til knoglen og blive vanskeligere at fjerne.
      BEMÆRK: Den tid, der kræves til prøvebehandling, kan variere afhængigt af størrelse og type, og gentagen fjernelse af efterfølgende bade kan være unødvendig. Derudover kan prøven forblive i badet i længere perioder, hvilket kan hjælpe med midlertidig fjernelse af væv.
3. Fjern så meget blødt væv som muligt ved hjælp af et skarpt dissektionsværktøj (nummer 22 skalpelblad på et dedikeret skalpelhåndtag) og rindende vand.
4. Gentag trin 4 efter behov, indtil knoglen er fri for blødt vævsmateriale. Efter vores erfaring skulle dette kun gentages én gang.

5. Afslutning af proceduren

1. Vask prøven med flydende vaskemiddel og skyl grundigt med vand.
   BEMÆRK: Alkohol kan bruges til at fremskynde tørringen.
2. Prøven lader tørre i ca. 48 timer.

Representative Results

Efter denne protokol blev rene og tørre fårlændehvirvelsøjlemodeller oprettet til kirurgisk planlægning og reference. Prøver bestående af syv lændehvirvler blev behandlet inden for 4 dage ved hjælp af denne metode, med et indledende bad for at fjerne hovedparten af musklen og tre efterfølgende bade. Afslutningen af badene blev indikeret af den lethed, hvormed brusk og bindevæv blev fjernet fra knoglen. Dette varierede afhængigt af bruskens type og placering; Tynde lag blev let fjernet efter et eller to bade, men tykt materiale omgivet af andet væv, såsom intervertebrale diske, tog tre eller fire bade. Efter tørring i 48 timer forventedes knoglerne at være meget lysere i farve og vægt og føles tørre og ikke-fedtede. De producerede knoglemodeller giver en nøjagtig repræsentation af anatomien og bevarer knoglens fine osseøse strukturer og konturer, specifikt ledfacetter, den vertebrale endeplade og tværgående processer sammenlignet med 3D-printede modeller. Til sammenligning blev en fårerygsøjle CT-scannet med en skivetykkelse på 0,5 mm, importeret til 3D-modelleringssoftware (se materialetabel) og segmenteret for at producere en model af en individuel ryghvirvel. Dette blev derefter udskrevet ved hjælp af acrylonitrilbutadienstyren (ABS) filament i en 3D-printer. Figur 2 viser den 3D-printede model af en lændehvirvelsøjle sammenlignet med den anatomiske kadavermodel fremstillet af de vakuumforseglede varmtvandsbadenedsænkninger. De sammenlignende billeder viser, at den 3D-printede model ikke nøjagtigt beskriver fine osseøse detaljer om de kadaveriske prøver, med tab af finere detaljer såsom konturer af knoglen, især på de tværgående processer.

Figur 1: Prøver af lændehvirvelsøjlen hos får på forskellige stadier under forarbejdningen. (A) Den nyhøstede lændehvirvelsøjle kræver forberedelse og et indledende bad (trin 1-2), mens (B) prøven med minimalt blødt væv kan fortsætte til efterfølgende bade (trin 3.2). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Kvalitativ sammenligning mellem 3D-printede og kadaveriske knoglemodeller. En sammenligning af (A,B) en 3D-printet model og (C,D) en kadaverbensmodel viser tab af detaljer på finere punkter, såsom enderne af tværgående processer og facetdetaljer i den 3D-printede model i forhold til knoglen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Fårs lændehvirvelsøjler behandlet ved nedsænkning i varmtvandsbad. Forarbejdede får lændehvirvelsøjlemodeller på samme trin i behandlingen; prøven på (A) venstre blev dog behandlet med vaskemiddel, og prøven på (B) højre var uden. Forskellen i farve og tekstur skal bemærkes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne tekniske note har til formål at beskrive en enkel, sikker og billig metode til fremstilling af en anatomisk knoglemodel til gavn for veterinær og medicinsk uddannelse og til brug i anatomisk uddannelse og kirurgisk planlægning.

Pilottest viste, at en badetemperatur på 70 °C gav den hurtigste behandlingstid uden at beskadige prøverne. Højere temperaturer forårsagede en omfattende nedbrydning af kollagen i knoglen, hvilket resulterede i sprøde prøver med en kalkholdig tekstur. Det varme bad i dette eksperiment var specifikt til behandling af 3D-printede prøver og blev brugt på grund af dets bekvemmelighed; Andre billigere kommercielle muligheder, såsom slow cookers eller sous vide-enheder, kan dog være mere tilgængelige.

Tilsætningen af vaskemiddel var et kritisk skridt i protokollen. Sammenlignet med prøver uden vaskemiddel reducerede tilsætning af vaskemiddel færdiggørelsestiden fra 168 timer til 96 timer. Prøver uden vaskemiddel tørrede ikke helt og fremstod mærkbart mørkere med en fedtet fornemmelse, begge formodentlig på grund af lipidakkumulering i knogleoverfladen. Udfyldte prøver, der ser mørke eller fedtede ud, kan indikere et behov for yderligere vaskemiddel (figur 3). Under pilottest kunne vaskemidlet alene ikke spredes jævnt i prøverne, når de var forseglet, hvilket nødvendiggjorde brug af vand derudover. Når vand og vaskemiddel blev tilsat poserne før forsegling, var der lejlighedsvis vanskeligheder med at skabe en pålidelig vakuumforsegling, som kan undgås ved at fryse væsker på forhånd. Det vaskemiddel, der anvendes i denne protokol, et generelt opvaskemiddel, blev valgt ud fra omkostninger og tilgængelighed. Denne metode kan udføres ved hjælp af ethvert opvaskemiddel for at opnå lignende resultater. Andre multifunktionelle husholdningsrengøringsmidler, der indeholder 2-butoxyethanol, kan hjælpe med affedtning og nedbrydning af blødt væv mere effektivt og kan derfor være gavnlige for prøver med overdreven eller hård brusk, såsom intervertebrale skiver⁷. Enzymatiske rengøringsmidler, der aktivt fordøjer blødt væv, kan bruges til at reducere macerationstiden sammenlignet med almindelige rengøringsmidler, men virkningerne kan være uforudsigelige, især hvis brugeren ikke er bekendt med deres brug ^6,10. Mens enzymatisk maceration udgør en højere sundhedsrisiko, har det potentialet til at reducere behandlingstiden fra dage til timer ^5,6. Denne metode drager også betydelig fordel af omrøring for at fremme en enzymatisk reaktion med blødt væv, som kan hindres af manglende flow i den vakuumforseglede pose.

Disartikulationen af ryghvirvler var især lettere, når vaskemiddel blev tilsat; Efter efterfølgende vaskemiddelbade var de intervertebrale diske blødere og lettere at fjerne, formodentlig på grund af et højere overfladeareal for vaskemiddelindtrængning, når de først var disartikuleret. Derfor blev prøverne afsluttet på kortere tid, når de var disartikuleret på forhånd. Tilsvarende, hvis de indledende prøver indeholdt tykke bruskområder, kan manuel fjernelse være nødvendig mellem badene for at fremme vaskemiddelindtrængning. Derudover har omrøring af et typisk macerationsbad vist sig at reducere den krævede tid betydeligt, men dette er ikke muligt med prøver i poser¹⁰. Tilsætning af vaskemiddel med små mængder vand i posen og disartikulerende samlinger så tidligt som muligt kan reducere virkningen af disse begrænsninger.

Et andet kritisk skridt var at undgå at lade prøverne afkøle til stuetemperatur efter fjernelse fra det varme bad, da restvarme tillod lettere fjernelse af den blødgjorte brusk fra prøverne. Når den fik lov til at afkøle, dannede denne brusk en hård, gelatinøs belægning på knoglen, der var vanskelig at fjerne uden at genopvarme prøven. Af samme grund, hvis rindende vand bruges til at hjælpe fjernelse af blødt væv, anbefales det at bruge varmt vand.

I modsætning til 3D-printede modeller producerer denne metode knogleprøver for at replikere virkelige emner til kirurgisk planlægning. Brug af skånsomme rengøringsmidler i denne metode kan forhindre ændringer i knogleoverfladens integritet, som det ses ved brug af alternative produkter såsom blegemiddel og hydrogenperoxid⁶. Med yderligere udvikling inden for 3D-udskrivning til medicinsk forskning kan modeller udskrives med tilpassede parametre såsom kortikal tykkelse, som har vist sig at give en positiv haptisk simulering af pedikelskrueplacering i rygkirurgi¹¹. Disse prøver kan dog være dyre at producere og kræve specifik software og udstyr samt omhyggelig planlægning og behandling^11,12. Derudover er kvaliteten af 3D-printede modeller begrænset af udstyret og kan risikere tab af finere detaljer, der bevares i knogleprøven¹³. Patientspecifikke og 3D-printede modeller har flere praktiske anvendelser, mens anatomiske modeller hentet fra knogler kan give uovertruffen anatomisk detalje med minimale omkostninger og udstyr.

Begrænsninger ved denne metode omfatter tilgængeligheden af kadaveriske prøver, der er specifikke for deres anvendelse. Den beskrevne metode fjerner fuldstændigt blødt væv fra knoglen og skaber modeller, der kun kan bruges til kirurgisk planlægning relateret til knogler, og er ikke så praktisk til visualisering af artikulation, biomekanik eller omgivende strukturer. På grund af dette tab af artikulation kan rekonstruktion af modeller være påkrævet. Rekonstruktionsmetoden varierer med knogletypen og kan omfatte silikone, ledning, kabelbindere eller lim. Mens de tilnærmer de relative placeringer af knoglerne, kan disse teknikker ikke replikere in vivo-mekanik og reducere oversættelse til kirurgisk praksis. Andre begrænsninger omfatter den tid, det tager at fjerne overskydende blødt væv fra store prøver samt brusk og andet blødt væv, hvis det er til stede, baseret på prøvens anatomiske region.

Evnen til at producere enkle knoglemodeller kan påvirke kirurgisk succes betydeligt. Modeller til kirurgisk planlægning har dokumenterede fordele, herunder reduceret kirurgisk tid, mere præcis skrue- og implantatplacering og færre komplikationer såsom blodtab⁴. Dette er især nyttigt i tilfælde af veterinærkirurgi, hvor anatomi varierer meget efter art. Denne enkle protokol har potentialet til at producere rene knoglemodeller fra kadavere uden farlige kemikalier og konstant lugt og kræver minimalt udstyr og arbejdskraft, især sammenlignet med moderne 3D-printteknikker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimension Elite 3D printer	Stratasys, Eden Prairie, MN, United States		3D printer for production of surgical bone models based on reconstructed CT scans
Mimics Innovation Suite	Materialise NV, Leuven, Belgium	Suite 24	Software to create 3D models from imaging scans
Nylon cable ties	4Cabling, Alexandria, NSW, Australia	011.060.1042/011.060.1039	Used to maintain connection between vertebral bodies
Orthopaedic wire	B Braun, Bella Vista, NSW, Australia		Used to maintain connection between vertebral bodies
Support Cleaning Apparatus	Phoenix Analysis and Design Technologies, Tempe, AZ, United States	SCA-1200	Hot water bath for immersion of the sealed sample.
Ultra Strength Original Dishwashing Liquid	Colgate-Palmolive, New York, NY, United States		Dishwashing liquid added to sealed bag with sample for cleaning of the bone model.
Vacuum bags	Pacfood PTY LTD		Heat safe, sealable plastic bags
Vacuum Food sealer	Tempoo (Aust) PTY LTD		Vacuum food sealer to seal vacuum bags prior to bath immersion