Summary
Il presente protocollo descrive la macerazione e la pulizia dell'osso cadaverico con una tecnica di immersione in bagno di acqua calda sottovuoto. Questo è un metodo a basso costo, sicuro ed efficace per produrre campioni anatomici per la pianificazione chirurgica e l'educazione medica in alternativa ai modelli stampati tridimensionali (3D).
Abstract
I modelli ossei servono a molti scopi, tra cui migliorare la comprensione anatomica, la pianificazione chirurgica preoperatoria e il riferimento intraoperatorio. Sono state descritte diverse tecniche per la macerazione dei tessuti molli, principalmente per l'analisi forense. Per la ricerca clinica e l'uso medico, questi metodi sono stati sostituiti da modelli stampati tridimensionali (3D), che richiedono attrezzature e competenze sostanziali e sono costosi. Qui, l'osso vertebrale cadaverico della pecora è stato pulito sigillando sottovuoto il campione con detersivo per piatti commerciale, immergendolo in un bagno di acqua calda e successivamente rimuovendo manualmente il tessuto molle. Ciò ha eliminato gli svantaggi dei metodi di macerazione precedentemente esistenti, come l'esistenza di cattivi odori, l'uso di sostanze chimiche pericolose, attrezzature sostanziali e costi elevati. La tecnica descritta ha prodotto campioni puliti e asciutti mantenendo dettagli anatomici e struttura per modellare accuratamente le strutture ossee che possono essere utili per la pianificazione preoperatoria e il riferimento intraoperatorio. Il metodo è semplice, a basso costo ed efficace per la preparazione del modello osseo per l'istruzione e la pianificazione chirurgica in medicina veterinaria e umana.
Introduction
La rimozione dei tessuti molli e la pulizia delle ossa sono necessarie per la ricerca forense, medica e biologica e l'educazione veterinaria e medica. La maggior parte delle tecniche sono state sviluppate per scopi forensi, riducendo al minimo i danni alle ossa per preservare quanti più dettagli possibili. Questo può fornire un modello osseo accurato e tangibile per la pianificazione chirurgica preoperatoria, nonché il processo decisionale intraoperatorio per aiutare a ridurre al minimo le complicanze 1,2,3. Ciò è vantaggioso in chirurgia riducendo i tempi operativi e la perdita di sangue e migliorando la comunicazione tra i chirurghi, rispetto alla pianificazione con immagini 2D4. L'uso di questi modelli può anche ridurre la dipendenza dall'imaging intraoperatorio, come la fluoroscopia, che può ridurre l'esposizione alle radiazioni del personale.
L'osso scheletrico dei cadaveri è stato storicamente utilizzato per questi modelli; tuttavia, i progressi tecnologici hanno spinto verso l'uso di modelli fabbricati e, più recentemente, modelli tridimensionali (3D) stampati. I modelli ossei si basano sulla disponibilità di campioni cadaverici e sull'efficienza dell'elaborazione di questi campioni in modelli utilizzabili. La stampa 3D ha il vantaggio della libertà creativa, consentendo modelli anatomici e specifici del paziente, specialmente quando sono presenti anomalie anatomiche o neoplasie, o se l'hardware deve essere fabbricato o aumentato per adattarsi al paziente1. Questi campioni sono anche in grado di essere sterilizzati e manipolati dai chirurghi durante una procedura. Tuttavia, questa libertà ha un costo, in quanto richiede scansioni di tomografia computerizzata (TC), i materiali e le attrezzature richieste possono essere costosi e l'esperienza è essenziale per creare i modelli nel software richiesto 1,4. Inoltre, questi fattori possono limitare la precisione e la qualità del modello, e quindi la pianificazione chirurgica e il successo1. I modelli stampati in 3D potrebbero non essere la scelta migliore per i casi in cui non è necessaria l'anatomia specifica del paziente e dove vi è un requisito immediato per il modello.
I metodi comunemente applicati per la rimozione dei tessuti molli dall'osso cadaverico includono la pulizia manuale, la macerazione batterica, la macerazione chimica, la cottura e la macerazione degli insetti 5,6. Il successo di questi metodi si basa generalmente sul costo, il tempo, la manodopera, le attrezzature, la sicurezza e la qualità del prodotto finale 5,7. La pulizia manuale richiede la maggior parte del lavoro e una notevole quantità di tempo, ma comporta attrezzature minime5. La macerazione batterica consiste nel lasciare il campione in un bagno di acqua fredda o calda per lunghi periodi di tempo, spesso fino a 3 settimane, consentendo ai batteri di decomporre il tessuto6. Ciò crea odori sgradevoli, richiede attrezzature aggiuntive per trattare i batteri e crea un pericolo di biosicurezza per l'utente 5,6. L'uso di coleotteri dermestidi è molto efficace con un lavoro minimo, ma richiede l'acquisizione di una colonia e l'allevamento degli animali, e non è considerato un investimento economico se usato raramente 6,7. La macerazione chimica di solito comporta l'uso di enzimi come tripsina, pepsina e papaina o detergenti commerciali contenenti sostanze come tensioattivi ed enzimi 5,8. Sebbene questo metodo fornisca risultati più rapidi, le sostanze chimiche utilizzate, come idrossido di sodio, ammoniaca, candeggina e benzina, possono rappresentare un rischio per la salute e la sicurezza e produrre odori nocivi che richiedono dispositivi di protezione individuale (DPI) e una cappa aspirante 5,7,8,9. Infine, il riscaldamento prolungato fornisce un altro metodo minimamente intensivo, ma può produrre odori che richiedono ventilazione10.
Un metodo semplice, sicuro e a basso costo per la preparazione di modelli ossei anatomici fornirebbe uno strumento utile per chirurghi, studenti, educatori e ricercatori. Questo articolo descrive un nuovo metodo per preparare modelli ossei scheletrici che evita odori sgradevoli e sostanze chimiche nocive e produce un modello chirurgico dettagliato con attrezzature e manodopera minime.
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Protocol
Le spine lombari sono state raccolte da pecore adulte incrociate Merino di 4 anni (Ovis aries) seguendo le linee guida etiche del Comitato etico e di cura degli animali dei laboratori di ricerca chirurgica e ortopedica. Seguendo il metodo istituzionalmente approvato di eutanasia umana, le spine lombari sono state raccolte utilizzando uno strumento di dissezione affilato, prima incidendo attraverso la pelle e i tessuti sottocutanei, seguito da fascia e muscolatura prima della disarticolazione alle giunzioni toracolombare e lombosacrale. Un campione raccolto è mostrato nella Figura 1A.
1. Preparazione per il bagno iniziale
- Rimuovere manualmente i tessuti molli (muscoli, tessuto connettivo, grasso, ecc.) utilizzando uno strumento di dissezione affilato (lama di bisturi numero 22) dal campione osseo prima di elaborare ulteriormente.
NOTA: questo passaggio è facoltativo; Tuttavia, la rimozione di quanto più tessuto molle possibile riduce il tempo necessario al bagno d'acqua per macerare i tessuti. Anche le dimensioni del campione (~20 cm x 10 cm x 8 cm) sono ridotte; Pertanto, più campioni possono essere inseriti nella vasca da bagno. - Sigillare il campione in un sacchetto di plastica sigillabile a prova di calore dopo aver rimosso l'aria. Si consiglia di utilizzare un sacchetto sottovuoto utilizzando un dispositivo di sigillatura sottovuoto commerciale (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Non sono necessari additivi per il bagno iniziale di 24 ore. Se c'è un muscolo significativo che copre tutte le superfici dell'osso e se c'è già un tessuto molle minimo e la maggior parte delle superfici ossee del campione sono esposte, procedere al punto 3.2 (Figura 1B).
2. Procedura per il bagno iniziale
- Immergere completamente il campione sigillato in bagnomaria a 70 °C per 24 ore.
- Dopo 24 ore, rimuovere il sacchetto dal bagno, aprire il sacchetto e lasciare raffreddare il campione fino a quando non è maneggevole.
3. Preparazione per i bagni successivi
- Rimuovere quanto più tessuto molle possibile dall'osso utilizzando un bisturi affilato e acqua corrente, se necessario.
- Disarticolare le articolazioni usando un bisturi affilato per esporre il tessuto cartilagineo.
- Mantenere i pezzi disarticolati in situ utilizzando materiale come filo ortopedico o fascette (vedi Tabella dei materiali) per mantenere la posizione anatomica.
- Sigillare il campione in un sacchetto sottovuoto insieme a 10 ml di detersivo per piatti (vedere Tabella dei materiali) e 10 ml di acqua di rubinetto.
NOTA: Il volume del detergente dipende dalla forza, dalla concentrazione e dalle dimensioni del campione.
4. Procedura per i bagni successivi
- Immergere completamente il campione sigillato in bagnomaria a 70 °C per 24 ore.
- Dopo 24 ore, rimuovere il sacchetto dal bagno, aprire il sacchetto e lasciare raffreddare il campione fino a quando non è maneggevole.
- Evitare di lasciare raffreddare completamente il campione, in quanto ciò consente alla cartilagine ammorbidita di indurirsi e aderire all'osso, diventando più difficile da rimuovere.
NOTA: Il tempo necessario per l'elaborazione del campione può variare in base alle dimensioni e al tipo e la rimozione ripetuta dei bagni successivi potrebbe non essere necessaria. Inoltre, il campione può rimanere nel bagno per lunghi periodi, il che può aiutare nella rimozione provvisoria dei tessuti.
- Evitare di lasciare raffreddare completamente il campione, in quanto ciò consente alla cartilagine ammorbidita di indurirsi e aderire all'osso, diventando più difficile da rimuovere.
- Rimuovere quanto più tessuto molle possibile utilizzando uno strumento di dissezione affilato (lama di bisturi numero 22 su un manico di bisturi dedicato) e acqua corrente.
- Ripetere il passaggio 4 come richiesto fino a quando l'osso è privo di materiale dei tessuti molli. Nella nostra esperienza, questo doveva essere ripetuto solo una volta.
5. Completamento della procedura
- Lavare il campione con detergente liquido e risciacquare abbondantemente con acqua.
NOTA: L'alcol può essere usato per accelerare l'essiccazione. - Lasciare asciugare il campione per circa 48 ore.
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Representative Results
Seguendo questo protocollo, sono stati creati modelli di colonna vertebrale lombare di pecora puliti e asciutti per la pianificazione chirurgica e il riferimento. I campioni costituiti da sette vertebre lombari sono stati elaborati entro 4 giorni utilizzando questo metodo, con un bagno iniziale per rimuovere la maggior parte del muscolo e tre bagni successivi. Il completamento dei bagni è stato indicato dalla facilità con cui la cartilagine e il tessuto connettivo sono stati rimossi dall'osso. Questo variava in base al tipo e alla posizione della cartilagine; Gli strati sottili sono stati facilmente rimossi dopo uno o due bagni, ma il materiale spesso circondato da altri tessuti, come i dischi intervertebrali, ha richiesto tre o quattro bagni. Dopo l'essiccazione per 48 ore, ci si aspettava che le ossa fossero molto più chiare di colore e peso e si sentissero asciutte e non grasse. I modelli ossei prodotti forniscono una rappresentazione accurata dell'anatomia, preservando le sottili strutture ossee e i contorni dell'osso, in particolare le faccette articolari, la placca vertebrale e i processi trasversali, rispetto ai modelli stampati in 3D. Per confronto, una colonna lombare di pecora ovina è stata scansionata TC con uno spessore di 0,5 mm, importata in un software di modellazione 3D (vedi Tabella dei materiali) e segmentata per produrre un modello di una singola vertebra. Questo è stato poi stampato utilizzando il filamento acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) in una stampante 3D. La figura 2 mostra il modello stampato in 3D di una colonna lombare di pecora rispetto al modello anatomico cadaverico prodotto dalle immersioni con bagno di acqua calda sigillate sottovuoto. Le immagini comparative mostrano che il modello stampato in 3D non dettaglia accuratamente i dettagli ossei fini dei campioni cadaveri, con una perdita di dettagli più fini come i contorni dell'osso, specialmente sui processi trasversali.
Figura 1: Campioni di colonna lombare di pecora in diverse fasi durante la lavorazione. (A) La colonna lombare appena raccolta richiede preparazione e un bagno iniziale (fasi 1-2), mentre (B) il campione con tessuto molle minimo può procedere a bagni successivi (fase 3.2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Confronto qualitativo tra modelli ossei stampati in 3D e cadaverici. Un confronto tra (A, B) un modello stampato in 3D e (C, D) un modello osseo cadaverico dimostra la perdita di dettagli nei punti più fini, come le estremità dei processi trasversali e i dettagli delle faccette nel modello stampato in 3D rispetto all'osso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Spine lombari di pecora trattate con bagno di acqua calda ad immersione. Modelli di colonna lombare di pecora lavorati nella stessa fase della lavorazione; tuttavia, il campione sulla (A) sinistra è stato trattato con detergente e il campione sulla (B) destra era senza. La differenza di colore e consistenza deve essere notata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questa nota tecnica ha lo scopo di descrivere un metodo semplice, sicuro e a basso costo per produrre un modello osseo anatomico a beneficio della formazione veterinaria e medica e per l'uso nell'educazione anatomica e nella pianificazione chirurgica.
I test pilota hanno rilevato che una temperatura del bagno di 70 °C forniva il tempo di lavorazione più rapido senza causare danni ai campioni. Le temperature più elevate hanno causato un'ampia rottura del collagene all'interno dell'osso, con conseguente campioni fragili con una consistenza gessosa. Il bagno caldo in questo esperimento era specifico per l'elaborazione di campioni stampati in 3D ed è stato utilizzato per la sua praticità; Tuttavia, altre opzioni commerciali meno costose, come pentole a cottura lenta o dispositivi sous vide, possono essere più accessibili.
L'aggiunta di detergente è stata una fase fondamentale del protocollo. Rispetto ai campioni senza detergente, l'aggiunta di detergente ha ridotto il tempo di completamento da 168 h a 96 h. I campioni senza detergente non si asciugavano completamente e apparivano notevolmente più scuri con una sensazione grassa, entrambi presumibilmente dovuti all'accumulo di lipidi all'interno della superficie ossea. I campioni completati che appaiono scuri o grassi potrebbero indicare la necessità di un detergente aggiuntivo (Figura 3). Durante i test pilota, il detergente da solo non è riuscito a disperdersi uniformemente in tutti i campioni una volta sigillato, rendendo necessario l'uso di acqua in aggiunta. Quando acqua e detergente sono stati aggiunti ai sacchetti prima della sigillatura, a volte c'era difficoltà nel creare una sigillatura sottovuoto affidabile, che può essere evitata congelando i liquidi in anticipo. Il detersivo utilizzato in questo protocollo, un detersivo generico per piatti, è stato scelto in base al costo e alla disponibilità. Questo metodo può essere eseguito utilizzando qualsiasi detersivo per piatti per ottenere risultati simili. Altri detergenti per la casa multiuso contenenti 2-butossietanolo possono aiutare a sgrassare e rompere i tessuti molli in modo più efficace e, pertanto, possono essere utili per campioni con cartilagine eccessiva o dura, come i dischi intervertebrali7. I detergenti enzimatici che digeriscono attivamente i tessuti molli potrebbero essere utilizzati per ridurre il tempo di macerazione rispetto ai normali detergenti per la pulizia, ma gli effetti possono essere imprevedibili, in particolare se l'utente non ha familiarità con il loro uso 6,10. Mentre la macerazione enzimatica rappresenta un rischio maggiore per la salute, ha il potenziale per ridurre il tempo di lavorazione da giorni a ore 5,6. Questo metodo beneficia anche in modo significativo dell'agitazione per promuovere una reazione enzimatica con i tessuti molli, che può essere ostacolata da una mancanza di flusso all'interno del sacchetto sigillato sottovuoto.
La disarticolazione delle vertebre era notevolmente più facile quando veniva aggiunto il detergente; Inoltre, dopo successivi bagni di detergente, i dischi intervertebrali erano più morbidi e più facili da rimuovere, presumibilmente a causa di una maggiore superficie per la penetrazione del detergente una volta disarticolati. Pertanto, i campioni sono stati completati in un tempo più breve quando disarticolati in anticipo. Allo stesso modo, se i campioni iniziali contenevano spesse aree di cartilagine, può essere necessaria la rimozione manuale tra un bagno e l'altro per promuovere la penetrazione del detergente. Inoltre, è stato dimostrato che l'agitazione di un tipico bagno di macerazione riduce significativamente il tempo richiesto, ma ciò non è possibile con campioni insaccati10. L'aggiunta di detergente con piccole quantità di acqua nel sacchetto e la disarticolazione delle articolazioni il prima possibile possono ridurre l'impatto di queste limitazioni.
Un altro passo fondamentale è stato quello di evitare di lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente dopo la rimozione dal bagno caldo, poiché il calore residuo ha permesso una più facile rimozione della cartilagine ammorbidita dai campioni. Quando lasciata raffreddare, questa cartilagine formava un rivestimento duro e gelatinoso sull'osso che era difficile da rimuovere senza riscaldare nuovamente il campione. Per lo stesso motivo, se si utilizza acqua corrente per aiutare la rimozione dei tessuti molli, si consiglia di utilizzare acqua calda.
A differenza dei modelli stampati in 3D, questo metodo produce campioni ossei per replicare soggetti reali per la pianificazione chirurgica. L'uso di detergenti delicati in questo metodo può evitare cambiamenti nell'integrità della superficie ossea, come si è visto quando si utilizzano prodotti alternativi come candeggina e perossido di idrogeno6. Con ulteriori sviluppi nella stampa 3D per la ricerca medica, i modelli possono essere stampati con parametri personalizzati come lo spessore corticale, che hanno dimostrato di fornire una simulazione tattile positiva del posizionamento della vite peduncolare nella chirurgia spinale11. Tuttavia, questi campioni possono essere costosi da produrre e richiedono software e attrezzature specifici, nonché una pianificazione e un'elaborazione meticolose11,12. Inoltre, la qualità dei modelli stampati in 3D è limitata dall'apparecchiatura e può rischiare la perdita di dettagli più fini che vengono preservati all'interno del campione osseo13. I modelli specifici per il paziente e stampati in 3D hanno diverse applicazioni pratiche, mentre i modelli anatomici provenienti dall'osso possono fornire dettagli anatomici senza rivali con costi e attrezzature minimi.
Le limitazioni di questo metodo includono la disponibilità di campioni cadaverici specifici per la loro applicazione. Il metodo descritto rimuove completamente i tessuti molli dall'osso, creando modelli che possono essere utilizzati solo per la pianificazione chirurgica relativa all'osso e non è così pratico per visualizzare l'articolazione, la biomeccanica o le strutture circostanti. A causa di questa perdita di articolazione, potrebbe essere necessaria la ricostruzione dei modelli. Il metodo di ricostruzione varia con il tipo di osso e può includere silicone, filo, fascette o colla. Pur approssimando le posizioni relative delle ossa, queste tecniche non possono replicare la meccanica in vivo e ridurre la traduzione nella pratica chirurgica. Altre limitazioni includono il tempo necessario per rimuovere i tessuti molli in eccesso da campioni di grandi dimensioni, nonché la cartilagine e altri tessuti molli, se presenti, in base alla regione anatomica del campione.
La capacità di produrre semplici modelli ossei può avere un impatto significativo sul successo chirurgico. I modelli per la pianificazione chirurgica hanno dimostrato vantaggi, tra cui tempi chirurgici ridotti, posizionamento più accurato di viti e impianti e meno complicazioni come la perdita di sangue4. Ciò è particolarmente utile nel caso della chirurgia veterinaria, dove l'anatomia varia notevolmente da specie a specie. Questo semplice protocollo ha il potenziale per produrre modelli di ossa pulite da cadaveri senza sostanze chimiche pericolose e odori costanti e richiede attrezzature e manodopera minime, soprattutto se confrontate con le moderne tecniche di stampa 3D.
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Disclosures
Gli autori devono rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension Elite 3D printer | Stratasys, Eden Prairie, MN, United States | 3D printer for production of surgical bone models based on reconstructed CT scans | |
| Mimics Innovation Suite | Materialise NV, Leuven, Belgium | Suite 24 | Software to create 3D models from imaging scans |
| Nylon cable ties | 4Cabling, Alexandria, NSW, Australia | 011.060.1042/011.060.1039 | Used to maintain connection between vertebral bodies |
| Orthopaedic wire | B Braun, Bella Vista, NSW, Australia | Used to maintain connection between vertebral bodies | |
| Support Cleaning Apparatus | Phoenix Analysis and Design Technologies, Tempe, AZ, United States | SCA-1200 | Hot water bath for immersion of the sealed sample. |
| Ultra Strength Original Dishwashing Liquid | Colgate-Palmolive, New York, NY, United States | Dishwashing liquid added to sealed bag with sample for cleaning of the bone model. | |
| Vacuum bags | Pacfood PTY LTD | Heat safe, sealable plastic bags | |
| Vacuum Food sealer | Tempoo (Aust) PTY LTD | Vacuum food sealer to seal vacuum bags prior to bath immersion |
References
- Leary, O. P., et al. Three-dimensional printed anatomic modeling for surgical planning and real-time operative guidance in complex primary spinal column tumors: single-center experience and case series. World Neurosurgery. 145, 116-126 (2021).
- Tack, P., Victor, J., Gemmel, P., Annemans, L. 3D-printing techniques in a medical setting: a systematic literature review. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 115 (2016).
- Ventola, C. L. Medical applications for 3D printing: current and projected uses. Pharmacy and Therapeutics. 39 (10), 704-711 (2014).
- Wilcox, B., Mobbs, R. J., Wu, A. M., Phan, K. Systematic review of 3D printing in spinal surgery: the current state of play. Journal of Spinal Surgery. 3 (3), 433-443 (2017).
- Mairs, S., Swift, B., Rutty, G. N. Detergent: an alternative approach to traditional bone cleaning methods for forensic practice. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 25 (4), 276-284 (2004).
- Husch, C., Berner, M., Goldammer, H., Lichtscheidl-Schultz, I. Technical note: A novel method for gentle and non-destructive removal of flesh from bones. Forensic Science International. 323, 110778 (2021).
- Couse, T., Connor, M. A comparison of maceration techniques for use in forensic skeletal preparations. Journal of Forensic Investigation. 3, 1-6 (2015).
- Mahon, T. J., Maboke, N., Myburgh, J. The use of different detergents in skeletal preparations. Forensic Science International. 327, 110967 (2021).
- Hussain, M., Hussain, N., Zainab, H., Qaiser, S. Skeletal preservation techniques to enhance veterinary anatomy teaching. IJAVMS. 1, 21-23 (2007).
- Simonsen, K. P., Rasmussen, A. R., Mathisen, P., Petersen, H., Borup, F. A fast preparation of skeletal materials using enzyme maceration. Journal of Forensic Science. 56 (2), 480-484 (2011).
- Burkhard, M., Furnstahl, P., Farshad, M. Three-dimensionally printed vertebrae with different bone densities for surgical training. European Spine Journal. 28 (4), 798-806 (2019).
- Rose, A. S., et al. Multi-material 3D models for temporal bone surgical simulation. The Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 124 (7), 528-536 (2015).
- Werz, S. M., Zeichner, S. J., Berg, B. I., Zeilhofer, H. F., Thieringer, F. 3D printed surgical simulation models as educational tool by maxillofacial surgeons. European Journal of Dental Education. 22 (3), 500-505 (2018).
