Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64766
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Postgraduate Program in Biological Sciences – Biophysics, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro, 2Postgraduate Program in Surgical Sciences, Faculty of Medicine, Federal University of Rio de Janeiro, 3Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.

Abstract

לעצמות יש יכולת התחדשות משמעותית. עם זאת, ריפוי שברים הוא תהליך מורכב, ובהתאם לחומרת הנגעים ולגיל ולמצב הבריאותי הכללי של המטופל, עלולים להתרחש כשלים, המובילים לאיחוד מאוחר או לאי-איחוד. בשל המספר ההולך וגדל של שברים הנובעים מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, יש צורך דחוף בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים. לשם כך, השימוש במודלים אמינים של בעלי חיים הוא חיוני להבנה טובה יותר של המנגנונים התאיים והמולקולריים העיקריים הקובעים את תוצאות הריפוי. מכל הדגמים, העכבר הוא מודל המחקר המועדף מכיוון שהוא מציע מגוון רחב של זנים וריאגנטים טרנסגניים לניתוח ניסיוני. עם זאת, הקמת שברים בעכברים עשויה להיות מאתגרת מבחינה טכנית בשל גודלם הקטן. לכן, מאמר זה נועד להדגים את ההליכים להקמה כירורגית של שבר עצם הירך הדיאפיזיאלי בעכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי ודומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות.

Introduction

השלד הוא איבר חיוני ורב-תכליתי מבחינה תפקודית. עצמות השלד מאפשרות יציבה ותנועה של הגוף, מגינות על האיברים הפנימיים, מייצרות הורמונים המשלבים תגובות פיזיולוגיות, והן אתר של המטופויזה ואחסון מינרלים1. אם נשברים, לעצמות יש יכולת יוצאת דופן להתחדש ולשחזר באופן מלא את צורתן ותפקודן לפני הפציעה. תהליך הריפוי מתחיל בהיווצרות המטומה ותגובה דלקתית, הגורמת להפעלה ועיבוי של תאי גזע/אב שלדיים מהפריאוסטאום, האנדוסטאום ומח העצם והתמיינותם לאחר מכן ליצירת היבלת הסחוסית הרכה. הגישור בין הקצוות השבורים מתרחש בתהליך הדומה להיווצרות עצם אנדוכונדרלית, שבו הפיגום הסחוסי מתרחב ולאחר מכן עובר מינרליזציה, ויוצר את היבלת האוסאוסית הקשה. לבסוף, היבלת הקשה משופצת בהדרגה על ידי אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים כדי לשחזר את מבנה העצם המקורי 2,3.

למרות שתהליך ריפוי השבר הוא חזק למדי, הוא כרוך בסיכום מורכב של אירועים ומושפע באופן משמעותי ממספר גורמים בודדים, כולל מצבו הבריאותי הכללי, גילו ומינו של המטופל, כמו גם גורמי פציעה, כגון אופן הייצוב המכני של העצם השבורה, התרחשות הזיהום וחומרת הפגיעה ברקמות הרכות שמסביב4, 5,6. לכן, כשלים הם נפוצים, מה שמוביל להתפתחות של אי-איחוד, מה שמשפיע מאוד על שיקום המטופל ואיכות החיים שלו 7,8. בשל המספר ההולך וגדל של שברים כתוצאה מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, כמו גם העלויות הגבוהות של הטיפולים, שברים שאינם מאוגדים הפכו לנטל על מערכות הבריאות ברחבי העולם 9,10. עומס הולך וגובר זה מדגיש את הצורך הדחוף באסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם11,12 המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים13,14.

במטרה להשיג מטרה זו, נעשה שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים במחקרים שמטרתם להבין את הביולוגיה הבסיסית של מנגנוני ריפוי שברים ובמחקרים פרה-קליניים להוכחת היתכנות שמטרתם לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקידום תיקון עצם 15,16,17. מודלים של בעלי חיים קטנים, כמו העכבר, מצוינים למחקרי ריפוי שברים בגלל הזמינות הרחבה של זנים וריאגנטים מהונדסים גנטית לניתוחים ניסיוניים ועלויות התחזוקה הנמוכות שלהם. בנוסף, לעכברים יש מסלול זמן ריפוי מהיר, המאפשר ניתוח זמני של כל שלבי תהליך התיקון15. עם זאת, גודלו הקטן של בעל החיים יכול להציב אתגרים לייצור כירורגי של שברים עם מצבי קיבוע דומים לאלה המיושמים בבני אדם. פרוטוקול זה מתאר מודל פשוט וזול של ריפוי שברים בעכברים באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה של עצם הירך המיוצבת באמצעות חוט תוך מדולרי, הדומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות, וניתן להשתמש בו הן בחקירות בסיסיות והן בחקירות תרגומיות בהן נדרשת גישה לאתר השבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו (פרוטוקול מספר 101/21). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי Balb/c זכרים בגיל 10-12 שבועות (25-30 גרם משקל גוף). ההליך הכירורגי אורך כ 15-20 דקות לכל עכבר. לפני כל הליך, המכשירים הנדרשים (המפורטים בטבלת החומרים) חייבים להיות מאורגנים על פני שדה כירורגי סטרילי המכסה את שולחן הניתוחים (איור 1A). כלי הניתוח המתכתיים חייבים להיות אוטומטיים במעטפות אטימה עצמית ב 123 ° C למשך 30 דקות. פריטים חד פעמיים, כגון מחטים ופדים גזה, חייבים להיות נרכשים סטריליים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. מרדימים את העכבר ומבצעים שיכוך כאבים בהתאם למשטר המומלץ על ידי הווטרינריה המאושר על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
    הערה: אם זמין, עדיף לבצע הרדמה בשאיפה. תיאור של פרוטוקול הרדמה באינהלציה ניתן למצוא בדו"ח של Ewald et al.18. עם זאת, אם השבר מיוצר עבור מחקרים אוסטאימונולוגיה, סוג זה של הרדמה חייב להימנע, כמו ראיות מראות כי כמה חומרי הרדמה נדיפים, כולל isoflurane, משפיעים על הפעילות של תאים חיסוניים מולדים ונרכשים19,20.
  2. ברגע שהעכבר אינו נייד, יש לגלח את רגל שמאל ולאחר מכן להעביר אותה לשולחן הניתוחים על כרית חימום חמה (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C המכוסה במדרס כירורגי סטרילי.
  3. בצע שטיפה חיטוי של אזור החתך על ידי שפשוף העור עם ספוג 10% פובידון-יוד. החיטוי צריך להתחיל לאורך קו החתך ולהאריך כלפי חוץ בתבנית מעגלית. יבש את האזור שפשף עם רפידות גזה סטריליות, לשטוף עם 70% אתנול, ולייבש שוב עם פד גזה סטרילי. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
  4. הניחו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צדדית ימנית, ושתקו את כפות הרגליים בעזרת סרט ניתוח (איור 1C).
  5. עטפו את העכבר כך שרק אזור החתך יהיה גלוי לעין (איור 1D).

2. הליך כירורגי

  1. במהלך ההליך הכירורגי, בדקו כל הזמן שהעכבר נושם וספקו טיפות עיניים בעיניו כדי למנוע יובש ולמנוע מהעכבר להתעוור.
    הערה: ההליך הכירורגי כולו אורך בדרך כלל ~ 15-20 דקות כאשר הוא מבוצע על ידי מנתח מיומן. לכן, החלת טיפות העיניים פעם אחת בתחילת ההליך צריך להספיק. אם ההליך מתחיל להיות ארוך יותר, יישומים נוספים ניתן לבצע בכל פעם שהוא מזוהה כי העיניים מתחילות להתייבש.
  2. לפני שתמשיך לחתך, הערך את עומק ההרדמה על ידי צביטת הזנב כדי לבדוק את רפלקס תגובת הכאב ובדיקה חזותית של קצב הנשימה (ספירת מספר תנועות החזה לדקה)21. בהרדמה אופטימלית, העכבר לא אמור להגיב לצביטת זנב, וקצב הנשימה חייב להיות סביב 55-65 נשימות לדקה21.
  3. בצעו חתך פרפטלרי עורי רוחבי בקוטר 1 ס"מ עם להב אזמל (מספר 11, ראו טבלת חומרים), החל מרמת הטוברוזיה הטיביאלית ונמשך עד לגובה הפטלה ולאחר מכן, למרחק שווה, לכיוון עצם הירך הדיסטלית (איור 1E).
  4. בעזרת מספריים קהות, מנתחים את הפאשיה התת עורית סביב קו החתך כדי לחשוף את הפאשיה לטה, את הווסטוס הצידי ואת שרירי שרירי שרירי הירך22.
  5. עם להב אזמל מספר 11, בצעו חתך נוסף בפאשיה לאטה דומה לזה שנעשה בעור, החל מרמת הטוברוזיות הטיביאלית ורץ לאורך שריר הירך הדו-ראשי עד לרמת עצם הירך הדיסטלית, כדי לפתוח את הקפסולה המפרקית ולגשת למפרק הברך (איור 1F, G).
  6. בצעו לוקסציה מדיאלית של הפטלה על-ידי הנחת קצה של פינצטה משוננת ישרה ומדויקת (ראו טבלת חומרים) מתחתיה ודחיפתה הצידה יחד עם רצועות הפטלר והארבע ראשי, ובכך חשפו את הקונדילים של עצם הירך (איור 1H).
  7. החזקת עצם הירך עם טוויזר קצה משונן, כופפו את הברך ב-90°, ונקבו ידנית את התעלה התוך-מדולרית של עצם הירך דרך הפוסה הבין-קונדילרית עם מחט היפודרמית 26G (איור 1I, J).
  8. כדי לשמור על כיפוף הברך ב-90°, הכנס קטע של 1.0 ס"מ של מוט נירוסטה בקוטר 0.016 אינץ' (0.40 מ"מ) (איור 1K, הוספה) (ראה טבלת חומרים) דרך הפתח לתוך התעלה המדולרית של עצם הירך לכיוון הטרוכנטר הגדול (איור 1K).
    הערה: שמירה על כיפוף הברך ב-90° חיונית להחדרה נכונה של החוט לתעלה המדולרית. אם לא תעשה זאת, התוצאה תהיה אקסטרווציה של החוט מתוך העצם ונגעים סביב רקמות רכות.
  9. התאימו את הגפיים הדיסטליות הטרום-כפופות של החוט בעזרת פינצטה משוננת ישרה כדי לקבע אותה היטב בקונדיל הצידי (איור 1L). בנוסף לקיבוע החוט במקומו, הגפיים הכפופות יקלו על הסרת החוט לאחר המוות.
  10. הפרידו את שרירי הווסטוס הצידי ואת שרירי שרירי הירך באמצעות דיסקציה קהה באמצעות פינצטה משוננת כדי לגשת לדיאפיזה הדיסטלית של עצם הירך (איור 1M).
  11. הכניסו מספריים מנתחים סביב דיאפיזה של עצם הירך בזווית של כ-90°, ובצעו בעדינות אוסטאוטומיה מלאה של קליפת המוח (איור 1N).
    הערה: עצם הירך של עכברים נחתכת בקלות. הימנעו מהפעלת כוח מופרז במהלך אוסטאוטומיה כדי למנוע כיפוף של החוט התוך מדולרי והצטברות שבר נרחבת.
  12. מקמו מחדש את השרירים ואת הפטלה על ידי דחיפת קצה פינצטה ישרה ומדויקת על אזור הקונדיל.
  13. סגרו את הפאשיה השרירית עם תפר 6-0 הניתן לספיגה ולאחר מכן את העור באמצעות תפר ניילון 6-0 (ראו טבלת חומרים), שניהם בצורה קטועה פשוטה (איור 1O).
  14. העבר את העכבר לכלוב נקי אישי להתאוששות. ברגע שהוא מתעורר, העכבר חייב להיות מסוגל לנוע בחופשיות עם נשיאת משקל בלתי מוגבלת.
  15. בימים שלאחר הניתוח, יש לבצע שיכוך כאבים בהתאם למשטר המומלץ על ידי הווטרינריה שאושר על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

3. הדמיית רנטגן

  1. מרדים את העכבר כמתואר בשלב 1.1.
    הערה: אם הרדיוגרפיה מבוצעת מיד לאחר ההליך הכירורגי והעכבר עדיין נמצא תחת הרדמה אופטימלית (שלב 2.2), אין צורך לבצע שלב זה.
  2. לקבלת מבט צדדי נקי על עצם הירך השבורה, הניחו את העכבר במצב דקוביטוס גבי, ומשכו מעט את הגפה האחורית המנותחת הצידה.
  3. לשתק את הכפות עם סרט כירורגי.
  4. ביצוע הדמיה רדיוגרפית בהתאם לפרוטוקול הציוד הזמין.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בגנרטור רנטגן דנטלי דיגיטלי עם הפרמטרים הבאים: מתח של 70 kVp, זרם של 7 mA וזמן חשיפה של 0.2 שניות.

4. עיבוד היסטולוגיה וצביעת H&E

  1. הרדימו את העכברים במנת יתר תוך צפקית של חומרי הרדמה (אנא עיינו במשטר המומלץ על ידי הווטרינריה שאושר על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים). לאחר בדיקת עומק ההרדמה עם צביטת זנב, בצע נקע צוואר הרחם. לאחר מכן, לאסוף את העצם השבורה, להסיר עודף רקמת שריר סביב23, ולתקן את העצם בתמיסת פורמלין 10% חוצץ (pH 7.4) במשך 3 ימים.
  2. הניחו את דגימות העצם בקלטות היסטולוגיה מסומנות (ראו טבלת חומרים), וטבלו אותן ב-10% EDTA במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.4, למשך 14 יום לצורך הסתיידות. החליפו את תמיסת ההסתיידות פעמיים בשבוע.
  3. יש לייבש את הדגימות בסדרה של תמיסות של הגדלת ריכוזי אתנול (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) למשך שעה כל אחת.
  4. נקה את הדגימות בשתי אמבטיות עוקבות של קסילן למשך 30 דקות כל אחת.
  5. לחדירת שעווה, יש לטבול את הדגימות בשתי אמבטיות פרפין רציפות בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות. לאחר מכן, להטביע את הדגימות לתוך בלוקים עבור חתך24.
    הערה: כדי לראות טוב יותר את היבלת, הטמע את העצם עם הציר הארוך שלה במצב אופקי כדי לאפשר חתכים אורכיים.
  6. חתכו את הרקמה למקטעים בעובי 4 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום (ראו טבלת חומרים).
  7. צפו את הקטעים באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס, והרכיבו את הקטעים על שקופיות היסטולוגיות (ראו טבלת חומרים).
  8. עבור צביעת H&E, יש לפרק את המגלשות בשלוש אמבטיות עוקבות של קסילן למשך 5 דקות, ולהחזיר לחות לרקמה בסדרה של תמיסות של הפחתת ריכוזי אתנול (95%, 80% ו-70%) למשך 5 דקות.
  9. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 30 שניות, הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין האריס (ראו טבלת חומרים) למשך 6 דקות, ושטפו אותן במי ברז למשך 30 שניות נוספות.
  10. לטבול את שקופיות 1% חומצה הידרוכלורית אתנול במשך 30 s ולאחר מכן 70% אתנול במשך 30 s.
  11. יש לצבוע עם אאוסין (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות, ולשטוף במי ברז למשך 30 שניות.
  12. יש לייבש את המגלשות באתנול (70%, 80% ו-95% למשך 5 דקות), ולהבהיר עם שתי אמבטיות קסילן למשך 5 דקות כל אחת.
  13. לצורך הרכבה, טפטפו טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) על כל שקופית, וכסו את השקופית בכיסוי נקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדרך הפשוטה והמיידית ביותר להעריך את הצלחת ההליך הכירורגי בהפקת השבר היא הדמיית רנטגן. ניתן לבצע צילומי רנטגן מיד לאחר הניתוח, כאשר העכבר עדיין תחת הרדמה, ולאחר מכן 7 ימים, 14 ימים ו -21 ימים לאחר השבר כדי להעריך את היווצרות היבלות והתקדמותן. דפוסי שבר מקובלים הם אלה שבהם קליפת המוח נקרעת במלואה, החוטים ממוקמים כראוי בתוך התעלה המדולרית, וקווי השבר הם רוחביים (עם זווית של 90° לציר העצם), אלכסוניים (תבנית מעוקלת או משופעת ללא תזוזה של שבר), או אלכסוניים קצרים (בסביבות 30° ביחס לציר העצם) (איור 2A-D). דפוסים אלה מקובלים מכיוון שכולם יתקדמו לתיקון באמצעות היווצרות עצם אנדוכונדרלית (כלומר, עם היווצרות יבלות) אם שברי העצם מיושרים כראוי (מופחתים), ובכך משיגים את המטרה העיקרית של המודל. לכן, שברים בלתי מתקבלים על הדעת הם רק אלה עם הצטברות נרחבת (שברי עצם קטנים מרובים), עם קיצור של הגפה כתוצאה מיישור לקוי, ועם חוטים שאינם במקומם (איור 3). בעלי חיים עם דפוסי שבר בלתי מקובלים חייבים להיות מחוץ למחקר. עם הזמן, יש להבחין ביבלת חזקה ונראית לעין באתר השבר (איור 4).

בנוסף, בדיקה היסטולוגית יכולה להתבצע ב 7 ימים, 14 ימים, ו 21 ימים לאחר השבר כדי להעריך neoformation רקמות בתוך האזור שבור. מכיוון שקיבוע עם חוטים תוך-מדולריים מאפשר מידה מסוימת של תנועה של שברי העצם, תהליך ההתחדשות עוקב אחר מנגנון אנדוכונדרלי של אוסיפיקציה, שבו אזורים חזקים של סחוס היאלין נראים סביב קו השבר ביום 7 (איור 5A,B). ביום ה-14 נצפות חזיתות אוסיפיקציה סביב אזור הסחוס, היוצרות עצם טרבקולרית וחללים מלאים במח עצם משוחזר (איור 5C,D). לבסוף, ביום ה-21, אזורי הסחוס מוחלפים כמעט לחלוטין בעצם טרבקולרית, מה שמעיד על גישור גרמי מוצלח (איור 5E,F) ועל תקפות המודל למחקרי ריפוי שברים.

Figure 1
איור 1: פוטומיקרוגרפים הממחישים את שלבי ההליך הכירורגי ליצירת שברים דיאפיסיאליים בעצם הירך המקובעים באמצעות חוט תוך-מדולרי בעכבר. (א) ארגון מכשירי הניתוח הסטריליים על שולחן הניתוחים. (B) הזרקה תוך צפקית של חומרי ההרדמה. (C) מיקום העכבר בתנוחת הדקוביטוס הצידית והשתקה של הכפות. (D) גרירה של העכבר, השארת חשוף רק את האזור שבו ינותח. (E) החתך הפרפטלרי הצידי העורי. (ו,ז) תצוגות של חתך הפאשיה לטה. (H) לוקסציה מדיאלית של הפטלה, החושפת את אזור קונדיל הירך. (I) מיקום המחט בפוסה הבין-קונדילרית. (י) ניקוב תעלת הירך המדולרית. (K) החדרת החוט התוך-מדולרי דרך פתח עצם הירך. (L) התאמת הגפיים הכפופות של החוט בקונדיל הצידי. (M) הפרדה קהה של השרירים הסובבים. (N) אוסטאוטומיה מלאה של עצם הירך בקליפת המוח. (O) סגירת הרקמות הרכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צילומי רנטגן מייצגים של דפוסי שבר מקובלים. (A,B) שברים דיאפיסיאליים רוחביים (קווי השבר נמצאים בזווית של 90° לציר העצם). (C) שבר אלכסוני קצר (קו השבר קטן מ-30° ביחס לציר העצם). (D) שבר מקוטע רדוקטיבי (מעט שברי עצם קטנים נראים, אך היישור האנטומי של העצם נשאר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צילומי רנטגן מייצגים של חוטים שהונחו באופן שגוי. (A) בעכבר זה, החוט אינו נמצא בתוך התעלה המדולרית של שבר עצם הירך הפרוקסימלי, ולכן נוצר קיבוע שגוי של העצם השבורה. (B) במקרה זה, החוט לא עבר דרך שום שבר עצם, והעצם השבורה אינה מיושרת כלל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: יבלות גלויות באתר השבר. צילומי רנטגן מייצגים של יבלות שבר ביום (A) 14 ו-(B) ביום 21 לאחר הניתוח, המראים כי תהליך ההתחדשות של המודל עוקב אחר המסלול העקיף (אנדוכונדרלי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח היסטולוגי של יבלות השבר. תמונות מייצגות של עצמות שבורות ביום (A,B) יום 7, (C,D) יום 14, וביום (E,F) 21 לאחר ניתוח מוכתמות ב- H & E. שימו לב להתפתחות היבלות; היבלת מציגה בתחילה אזורים נרחבים של סחוס היאלין סביב קו השבר (מוכנס ב-A, מוגדל ב-B), אזורים אלה משמשים לאחר מכן כתבניות להיווצרות עצם טרבקולרית (מוכנס ב-C, מוגדל ב-D), והתהליך מגיע לשיאו בהחלפה מלאה של הסחוס בעצם ובכך בגישור עצם (הכנס ב-E, מוגדל ב-F). פסי קנה מידה: (A,C,D) 500 מיקרומטר; (B,D,F) 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ככל שמספר השברים גדל ברחבי העולם 9,10,25, טיפולים חדשניים לאי-איחוד הופכים דחופים יותר ויותר. מכיוון שריפוי שברים כרוך בסיכום מורכב ומתוזמר היטב של אירועים המתרחשים על פני סקאלת זמן ארוכה3, השימוש במודלים תקפים של בעלי חיים הוא מרכזי לשיפור הבנתנו את המנגנונים הקובעים את הצלחת תיקון העצם ולבחירת תרופות יעילות ופרוטוקולים טיפוליים16,17.

בעכבר, הן עצם הירך והן השוקה יכולות לשמש למחקרים ארוכים לריפוי שברים בעצם. במודל זה, עצם הירך נבחרה במקום השוקה מכיוון שמדובר בעצם ישרה בעלת קוטר גדול יותר וכיסוי טוב יותר של רקמות רכות. מצד שני, הדיאפיזה של טיביה העכבר מעוקלת, וקליבר שלה יורד בהדרגה לאורך הקצה הדיסטלי, מה שמסבך את החדרת התקני קיבוע intramedullary26. לכן, המאפיינים של עצם הירך לעשות את זה אידיאלי עבור מודלים שבהם קיבוע intramedullary מיועד. לגבי המין, עכברים זכרים שימשו, שכן יש ראיות כי זכרים מראים ריפוי שברים מהיר יותר עם היווצרות יבלות סחוס בולטות יותר בהשוואה לנקבות27. עם זאת, במידת הצורך, ניתן להתאים את הטכניקה בקלות לנקבות פשוט על ידי התאמת גודל החוט התוך מדולרי כך שיתאים לאורך הקטן מעט יותר של עצם הירך הנשית.

בהשוואה למודלים של שבר סגור המשתמשים במנגנון הכיפוף התלת-נקודתי עם הגיליוטינה28, מודל הניתוח הפתוח המתואר כאן הוא גם יתרון משום שהוא חושף את אתר השבר, המאפשר לחוקר לראות חזותית את השבר שנוצר. הדמיה זו מסייעת למנוע שגיאות טכניות הגורמות לדפוסי השבר הבלתי מקובלים הבאים: עקירה חמורה של שבר, שאינה מאפשרת יישור אנטומי מחדש של העצם (שברים שאינם ניתנים לצמצום); פיצול נרחב של העצם למספר חתיכות קטנות (comminution), מצב שעלול לפגוע בתהליך התיקון; ו/או מיקום שגוי של מכשירי הקיבוע. מכיוון שהשבר נגרם על ידי אוסטאוטומיה עדינה במודל זה, בדרך כלל לא נצפים תזוזה נרחבת של שברים ו / או קומבינציה.

עם זאת, הטכניקה מוגבלת במובן זה שהיא דורשת מיומנויות כירורגיות טכניות גדולות יותר וידע באנטומיה של העכבר מאשר שיטות אחרות. בנוסף, גודלו הקטן של העכבר הופך את המניפולציה למסובכת יותר בהשוואה לחולדות או מודלים של בעלי חיים גדולים. ברגע שמתגברים על מגבלות אלה באמצעות אילוף, שיעור ההצלחה בייצור שברים מקובלים הוא כמעט 100%, מה שמקטין את מספר הרחקות בעלי החיים מהמחקר.

יתר על כן, מודל השבר הניתוחי הפתוח מאפשר יישום מקומי של חומרים טיפוליים, כגון תאי גזע/אב, ביו-חומרים ו/או תרופות פרמצבטיות, שלא ניתן יהיה ליישם באמצעות העברה מלעורית או מערכתית26. לבסוף, קיבוע עם מכשירים תוך מדולריים הוא קל יותר, זול יותר וניתן להתאמה אישית יותר מאשר עם פלטות והתקנים חיצוניים ומחקה את האסטרטגיה הקלינית הנפוצה ביותר לטיפול בשברים ארוכים בעצם29. לכן, המודל המתואר כאן מייצג מודל בעלות נמוכה לחקר ריפוי שברים, הן במסגרת בסיסית והן במסגרת תרגומית, כלומר מחקר זה תורם לא רק להגברת הידע בביולוגיה של ריפוי שברים אלא גם לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לתיקון עצם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מנוגדים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי קרן קרלוס צ'אגס פיליו לתמיכה במחקר של מדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol 70º Merck 109-56-8 Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium) Merck C1795 Or any general available supplier
Cefazoline ABL Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip Merck CSL284525 Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator Focus - Sold by Instrumentarium Dental Inc. 
DEPC water Merck W4502 Or any general available supplier
Dissecting Scissor ABC Instrumentos 0327 Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA Vetec 60REAVET014340 Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution Laborclin EA-65 Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A Vetec 60REAVET012053 Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads Cremer Not applicable Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution Laborclin 620503 Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad Tonkey Electrical Technology E114273 Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides Merck CSL294875X25 Or any general available supplier
Histology cassettes Merck H0542-1CS Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37% Merck 258148 Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe BD 324918 Or any general available supplier
Iodopovidone sponge Rioquímica 372106 Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride Ceva Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium Cristalia Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome Leica 149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer ABC Instrumentos 0164 Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G BD 2239 Or any general available supplier
Needle Holder  Golgran 135-18 Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 Atramat C1546-NT Or any general available supplier
Paraffin Exodo 8002 - 74 - 2 Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x  Lonza  BE17-516F Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6 Atramat C1596-45B Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016" Orthometric 56.50.2016
Scalpel nº 11 Descarpak 15782 Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer Quinelato QC.404.12 Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver Phillips Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape 3M 2734 Or any general available supplier
Surgical tnt field Polarfix 6153 Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride Teuto  Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology Leica HI1210
Xylazine hydrochloride Ceva Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene Dinamica 60READIN001105 Similar brands of the item may be used according to local availability

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
  2. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
  3. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  4. Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
  5. Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
  6. Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
  7. Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
  8. Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
  9. Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
  10. Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
  11. Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
  12. Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
  13. Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
  14. Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
  15. Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
  16. Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
  17. Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
  18. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  19. Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
  20. Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
  21. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  22. Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
  23. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  24. An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
  25. Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
  26. Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
  27. Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
  28. Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
  29. Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).

Tags

שבר דיאפיזי בעצם הירך מודל עכברים התחדשות עצם ריפוי שברים אסטרטגיות טיפוליות תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה ביו-חומרים ביומימטיים מודלים של בעלי חיים מודל מחקר עכברים זנים טרנסגניים אנליזה ניסיונית הליך כירורגי חוט תוך מדולרי היווצרות יבלות סחוס
ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braga Frade, B., Dias da Cunha… More

Braga Frade, B., Dias da Cunha Muller, L., Bonfim, D. C. Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice. J. Vis. Exp. (190), e64766, doi:10.3791/64766 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter