Summary
该协议描述了一种外科手术，用于在小鼠股骨中建立骨干骨折，该骨折用髓内线稳定，用于骨折愈合研究。
Abstract
骨骼具有显着的再生能力。然而，骨折愈合是一个复杂的过程，根据病变的严重程度以及患者的年龄和整体健康状况，可能会发生失败，导致愈合延迟或不愈合。由于高能创伤和衰老导致的骨折数量不断增加，迫切需要开发基于骨骼/间充质干细胞/基质细胞和仿生生物材料相结合的创新治疗策略来改善骨修复。为此，使用可靠的动物模型对于更好地了解决定愈合结果的关键细胞和分子机制至关重要。在所有模型中，小鼠是首选的研究模型，因为它提供了多种用于实验分析的转基因菌株和试剂。然而，由于小鼠体型小，在小鼠中建立骨折可能在技术上具有挑战性。因此，本文旨在展示通过软骨愈伤组织形成的小鼠骨干股骨骨折的手术建立程序，该骨折由髓内线稳定，类似于最常见的骨修复过程。
Introduction
骨骼是一个重要且功能多样的器官。骨骼的骨骼使身体姿势和运动成为可能，保护内脏器官，产生整合生理反应的激素，并且是造血和矿物质储存的场所1.如果骨折，骨骼具有非凡的再生能力，可以完全恢复其受伤前的形态和功能。愈合过程始于血肿和炎症反应的形成，这诱导骨膜、骨内膜和骨髓的骨骼干/祖细胞的活化和凝聚，以及随后的分化形成软骨愈伤组织。然后，断裂末端的桥接通过类似于软骨内骨形成的过程发生，其中软骨支架膨胀然后矿化，形成坚硬的骨性愈伤组织。最后，硬愈伤组织逐渐由破骨细胞和成骨细胞重塑，以恢复原始骨骼结构 2,3。
尽管骨折愈合过程相当稳健，但它涉及一系列错综复杂的事件，并受到几个个体因素的显着影响，包括患者的一般健康状况、年龄和性别，以及损伤因素，例如骨折的机械稳定方式、感染的发生以及周围软组织损伤的严重程度4，5,6.因此，失败很常见，导致骨不连的发展，这极大地影响了患者的康复和生活质量 7,8。由于高能量创伤和衰老导致的骨折数量增加，以及治疗费用高昂，不愈合骨折已成为全世界卫生系统的负担 9,10。这种日益增加的负担凸显了对创新治疗策略的迫切需要，以基于骨骼/间充质干细胞/基质细胞和仿生生物材料的组合来改善骨修复11,12 13,14。
为了实现这一目标，动物模型已被广泛用于旨在了解骨折愈合机制基础生物学的研究，以及旨在设计新的治疗策略以促进骨修复的概念验证临床前研究15,16,17。小动物模型，如小鼠，非常适合骨折愈合研究，因为转基因菌株和试剂可用于实验分析，而且维护成本低。此外，小鼠具有快速的愈合时间过程，这允许对修复过程的所有阶段进行时间分析15。然而，动物的小体型可能会给骨折的手术产生带来挑战，其固定模式类似于人类的固定模式。该协议描述了一种简单且低成本的小鼠骨折愈合模型，使用用髓内线稳定的开放式股骨截骨术，类似于最常见的骨修复过程，通过软骨痂的形成，并且可用于需要进入骨折部位的基础和转化研究。
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Protocol
所有实验均已获得里约热内卢联邦大学健康科学中心动物使用和护理委员会的批准（协议编号101/21）。本研究使用10-12周龄（25-30g体重）的雄性Balb/c小鼠。每只小鼠的手术过程大约需要 15-20 分钟。在每次手术之前，所需的器械（列在 材料表中）必须组织在覆盖手术台的无菌手术区域（图1A）。金属手术器械必须在123°C的自密封信封中高压灭菌30分钟。一次性物品，如针头和纱布垫，必须采购无菌。
1. 动物准备
- 麻醉小鼠并按照机构动物护理和使用计划批准的兽医推荐方案进行镇痛。
注意：如果可用，最好进行吸入麻醉。吸入麻醉方案的描述可以在 Ewald 等人的报告中找到 18.然而，如果骨折是为骨免疫学研究而产生的，则必须避免这种类型的麻醉，因为有证据表明，包括异氟烷在内的几种挥发性麻醉剂会影响先天性和适应性免疫细胞的活性19,20。 - 一旦鼠标不动，剃掉左腿，然后将其转移到37°C的温暖加热垫（见 材料表）上的手术台上，上面覆盖着无菌手术单。
- 用 10% 聚维酮碘海绵擦拭皮肤，对切口区域进行消毒清洗。消毒应沿切口线开始，并以圆形向外延伸。用无菌纱布垫擦干摩擦区域，用70%乙醇清洗，然后用无菌纱布垫再次干燥。重复此过程三次。
- 将鼠标置于右侧卧位，并用手术胶带固定爪子（图1C）。
- 悬垂鼠标，使仅可见切口区域（图1D）。
2. 外科手术
- 在手术过程中，不断检查鼠标是否在呼吸，并在其眼睛中滴眼药水，以避免干燥并防止鼠标失明。
注意：当由训练有素的外科医生执行时，整个外科手术通常需要 ~15-20 分钟。因此，在手术开始时使用一次眼药水就足够了。如果手术开始变长，只要发现眼睛开始干燥，就可以进行额外的应用。 - 在进行切口之前，通过捏住尾巴以检查疼痛反应反射并目视检查呼吸频率（计算每分钟的胸腔运动次数）21 来评估麻醉深度。在最佳麻醉下，小鼠不应对夹尾做出反应，呼吸频率必须在 55-65 次/分钟左右21.
- 用手术刀刀片做一个1厘米的皮肤外侧髌旁切口（编号11，见 材料表），从胫骨结节的水平开始，延伸到髌骨的水平，然后，以相等的距离，朝向股骨远端（图1E）。
- 用钝头剪刀解剖切口线周围的皮下筋膜，露出阔筋膜、股外侧肌和股二头肌22。
- 使用11号手术刀刀片，在阔筋膜上做另一个类似于皮肤上的切口，从胫骨粗隆水平开始，沿着股二头肌腱膜延伸，直到股骨远端水平，以打开关节囊并进入膝关节（图1F，G）。
- 通过将直锯齿状精密尖端镊子的尖端（见 材料表）的尖端放在髌骨下方并将其与髌骨和股四头肌韧带一起推到一边，从而暴露股骨的髁突（图1H）。
- 用锯齿状尖端镊子握住股骨，将膝盖弯曲 90°，并用 26 G 皮下注射针通过髁间窝手动穿孔股骨髓内管（图 1I，J）。
- 保持膝关节弯曲 90°，将一段 1.0 厘米的 0.016 英寸（0.40 毫米）不锈钢棒线（图 1K，插入）（见 材料表）通过开口插入股骨髓管朝向大转子（图 1K）。
注意： 保持膝关节弯曲 90° 对于将金属丝正确插入髓管至关重要。否则会导致金属丝从骨骼和周围的软组织病变中外渗。 - 用直锯齿状尖端镊子调整金属丝的预弯曲远端，将其紧紧地固定在外侧髁中（图1L）。除了将电线固定到位外，弯曲的肢体还有助于死后移除电线。
- 用锯齿状尖端镊子通过钝端解剖分离股外侧股骨和股二头肌，以进入股骨远端骨干（图1M）。
- 在股骨骨干周围以大约90°的角度插入解剖剪刀，并轻轻地进行完整的皮质截骨术（图1N）。
注意：小鼠股骨很容易切割。截骨术时不要用力过大，以免髓内钢丝弯曲和大面积骨折粉碎。 - 通过将直锯齿状精密尖端镊子的尖端推到髁突区域来重新定位肌肉和髌骨。
- 用6-0可吸收缝合线关闭肌肉筋膜，然后使用6-0尼龙缝合线（见 材料表）关闭皮肤，两者都以简单的中断方式（图1O）。
- 将鼠标转移到单独的干净笼子中进行恢复。一旦醒来，鼠标必须能够在不受限制的负重下自由移动。
- 在手术后的接下来几天内，按照机构动物护理和使用计划批准的兽医推荐方案进行镇痛。
3. X射线成像
- 按照步骤1.1中的说明麻醉小鼠。
注意：如果在外科手术后立即进行射线照相，并且小鼠仍处于最佳麻醉状态（步骤2.2），则无需执行此步骤。 - 为了获得骨折股骨的干净侧视图，将鼠标置于背侧褥号，并将手术后肢稍微拉向一侧。
- 用手术胶带固定爪子。
- 根据可用的设备协议进行射线照相成像。
注意：在这项研究中，使用具有以下参数的数字牙科 X 射线发生器：70 kVp 电压、7 mA 电流和 0.2 秒曝光时间。
4. 组织学处理和H&E染色
- 用腹膜内过量的麻醉剂对小鼠实施安乐死（请参阅机构动物护理和使用计划批准的兽医推荐方案）。用尾巴捏住麻醉深度后，进行颈椎脱位。接下来，收集骨折的骨头，去除多余的周围肌肉组织23，并将骨头固定在10%缓冲福尔马林溶液（pH 7.4）中3天。
- 将骨样品放入标记的组织学盒中（参见 材料表），并将其浸入10%EDTA磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH 7.4,14天进行脱钙。每周更换两次脱钙液。
- 在一系列增加乙醇浓度（70%，80%，90%，100%，100%）的溶液中将样品脱水1小时。
- 在两个连续的二甲苯浴中清除样品，每次30分钟。
- 对于蜡浸润，将样品浸入60°C的两个连续石蜡浴中30分钟。接下来，将样品嵌入块中以进行切片24。
注意：为了更好地观察愈伤组织，请将骨骼及其长轴嵌入水平位置，以允许纵向切割。 - 用切片机将组织切成4μm厚的切片（参见 材料表）。
- 将切片漂浮在56°C水浴中，并将切片安装在组织学载玻片上（参见 材料表）。
- 对于H&E染色，在三个连续的二甲苯浴中脱蜡载玻片5分钟，并在一系列乙醇浓度降低（95%，80%和70%）的溶液中将组织再水化5分钟。
- 用自来水冲洗载玻片30秒，用Harris苏木精（参见 材料表）染色载玻片6分钟，然后在自来水中再冲洗30秒。
- 将载玻片浸入乙醇中的1%盐酸中30秒，然后浸入70%乙醇中30秒。
- 用伊红染色（见 材料表）2分钟，用自来水洗涤30秒。
- 用乙醇（70%、80%和95%）脱水载玻片5分钟，并用两个二甲苯浴澄清，每次5分钟。
- 安装时，将一到两滴安装介质（参见 材料表）滴到每个载玻片上，并用干净的盖玻片盖住载玻片。
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Representative Results
评估外科手术在骨折方面是否成功的最简单和最直接的方法是 X 射线成像。可以在手术后立即进行 X 光片，小鼠仍处于麻醉状态，随后在骨折后 7 天、14 天和 21 天进行 X 光检查，以评估愈伤组织形成和进展。可接受的骨折模式是皮质完全破裂，钢丝正确放置在髓管内，并且骨折线是横向的（与骨轴成 90° 角）、斜的（弯曲或倾斜的模式，没有碎片位移）或短斜（相对于骨轴约 30°）（图 2A-D).这些模式是可以接受的，因为如果骨碎片正确排列（减少），它们都将通过软骨内骨形成（即愈伤组织形成）进行修复，从而实现模型的主要目标。因此，不可接受的骨折仅是那些具有广泛粉碎（多个小骨碎片）、由于对齐不良导致肢体缩短以及导线错位的骨折（图 3）。必须将具有不可接受的骨折模式的动物排除在研究之外。随着时间的流逝，应在骨折部位观察到坚固且可见的愈伤组织（图4）。
此外，可以在骨折后 7 天、14 天和 21 天进行组织学检查，以评估骨折区域内的组织新形成。由于用髓内线固定允许骨碎片有一定程度的运动，因此再生过程遵循骨化的软骨内机制，其中在第 7 天在骨折线周围可以看到坚固的透明软骨区域（图 5A，B）。在第 14 天，在软骨区域周围观察到骨化前沿，形成小梁骨和充满重建骨髓的空腔（图 5C，D）。最后，在第 21 天，软骨区域几乎完全被小梁骨取代，表明骨桥接成功（图 5E，F）和骨折愈合研究模型的有效性。
图 1：显微照片显示了用髓内线固定在小鼠中产生骨干股骨骨折的外科手术步骤。 （A） 手术台上无菌手术器械的组织。（B） 腹腔注射麻醉剂。（C）将小鼠定位在侧卧位并固定爪子。（D） 鼠标悬垂，仅露出将要手术的区域。（E） 皮肤外侧髌旁切口。（女，克）阔筋膜切口的视图。（H） 髌骨内侧脱位，暴露股骨髁区域。（I） 针头在髁间窝的位置。（J） 股骨髓管穿孔。（K） 通过股骨开口插入髓内钢丝。（L） 调整外侧髁中钢丝的弯曲末端。（M） 周围肌肉的钝端分离。（N） 全皮质股骨截骨术。（O） 软组织闭合。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：可接受骨折模式的代表性 X 线照片。 （A，B） 横向骨干骨折（骨折线与骨轴成 90° 角）。（C）短斜骨折（骨折线相对于骨轴小于30°）。（D）可复位的碎片性骨折（很少看到小的骨头碎片，但骨头的解剖学排列仍然存在）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：错误放置的电线的代表性 X 光片。 （A） 在这只小鼠中，导线不在股骨近端碎片的髓管内，从而导致骨折骨的不正确固定。（B）在这种情况下，钢丝没有穿过任何骨头碎片，骨折的骨头完全没有对齐。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：骨折部位可见愈伤组织。 术后 （A） 第 14 天和 （B） 第 21 天骨折愈伤组织的代表性 X 光片，显示模型的再生过程遵循间接（软骨内）途径。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：骨折愈伤组织的分析。手术后（A，B）第7天，（C，D）第14天和（E，F）第21天骨折的代表性图像，用H&E染色。 注意愈伤组织的演变;愈伤组织最初在骨折线周围呈现出大面积的透明软骨区域（在 A 中插入，在 B 中放大），然后这些区域作为形成小梁骨的模板（在 C 中插入，在 D 中放大），该过程最终导致软骨被骨完全替换，从而建立骨桥（插入 E， 以 F 为单位放大）。比例尺：（A，C，D）500μm;（B，D，F）100微米。 请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
随着全球骨折数量的增加 9,10,25，愈合不愈合的创新治疗方法变得越来越紧迫。由于骨折愈合涉及对在很长一段时间内发生的事件的复杂而紧密的总结3，因此使用有效的动物模型对于提高我们对决定骨修复成功与否的机制的理解以及选择有效的药物和治疗方案至关重要16,17。
在小鼠中，股骨和胫骨都可用于长骨折愈合研究。在这个模型中，选择了股骨而不是胫骨，因为它是直径更大、软组织覆盖率更好的直骨。另一方面，小鼠胫骨的骨干是弯曲的，其口径沿远端逐渐减小，这使得髓内固定装置26的插入变得复杂。因此，股骨的特性使其成为髓内固定模型的理想选择。关于性别，使用了雄性小鼠，因为有证据表明，与雌性相比，雄性表现出更快的骨折愈合和更突出的软骨愈伤组织形成27。然而，如有必要，该技术可以很容易地适应女性，只需调整髓内线的大小以适应女性股骨稍小的长度。
与使用断头台28 的三点弯曲机构的闭合性骨折模型相比，这里描述的开放式手术模型也具有优势，因为它暴露了骨折部位，这使研究人员能够直观地看到正在产生的骨折。这种可视化有助于避免导致以下不可接受的骨折模式的技术错误：严重的碎片移位，不允许骨骼的解剖学重新对齐（不可复位的骨折）;骨头广泛碎裂成几块小块（粉碎），这种情况可能会损害修复过程;和/或固定装置的错位。由于该模型中的骨折是由温和的截骨术引起的，因此通常不会观察到广泛的碎片移位和/或粉碎。
然而，该技术受到限制，因为它比其他方法需要更多的技术手术技能和小鼠解剖学知识。此外，与大鼠或大型动物模型相比，小鼠的小尺寸使操作更加棘手。一旦通过训练克服了这些限制，产生可接受骨折的成功率接近 100%，从而减少了研究中移除动物的数量。
此外，开放手术骨折模型允许局部应用治疗剂，例如干细胞/祖细胞、生物材料和/或药物，而这些药物不可能使用经皮或全身给药26。最后，与钢板和外部装置相比，髓内装置的固定更容易、更便宜、更可定制，并且模仿了治疗长骨骨折最常用的临床策略29。因此，这里描述的模型代表了一种在基础和转化环境中研究骨折愈合的低成本模型，这意味着这项研究不仅有助于增加骨折愈合生物学的知识，还有助于开发新的骨修复治疗策略。
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Disclosures
提交人没有相互冲突的经济利益。
Acknowledgments
这项工作由里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（FAPERJ）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
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