Summary
Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para o estabelecimento de uma fratura diafisária no fêmur de camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular, para estudos de consolidação da fratura.
Abstract
Os ossos têm uma capacidade regenerativa significativa. No entanto, a consolidação da fratura é um processo complexo e, dependendo da gravidade das lesões e da idade e estado geral de saúde do paciente, falhas podem ocorrer, levando ao retardo da consolidação ou não união. Devido ao crescente número de fraturas resultantes do trauma de alta energia e do envelhecimento, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar o reparo ósseo baseado na combinação de células-tronco esqueléticas/mesenquimais/estromas e biomateriais biomiméticos é urgentemente necessário. Para tanto, o uso de modelos animais confiáveis é fundamental para o melhor entendimento dos principais mecanismos celulares e moleculares que determinam os desfechos da cicatrização. De todos os modelos, o camundongo é o modelo de pesquisa preferido porque oferece uma grande variedade de cepas transgênicas e reagentes para análise experimental. No entanto, o estabelecimento de fraturas em camundongos pode ser tecnicamente desafiador devido ao seu pequeno tamanho. Portanto, este artigo tem como objetivo demonstrar os procedimentos para o estabelecimento cirúrgico de uma fratura de fêmur diafisária em camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular e se assemelha ao processo de reparo ósseo mais comum, através da formação de calo cartilaginoso.
Introduction
O esqueleto é um órgão vital e funcionalmente versátil. Os ossos do esqueleto possibilitam a postura e o movimento corporal, protegem os órgãos internos, produzem hormônios que integram as respostas fisiológicas e são o local de hematopoese e armazenamento de minerais1. Se fraturados, os ossos têm uma notável capacidade de se regenerar e restaurar totalmente sua forma e função pré-lesão. O processo cicatricial inicia-se com a formação de um hematoma e uma resposta inflamatória, que induz a ativação e condensação de células-tronco esqueléticas/progenitoras do periósteo, endósteo e medula óssea e sua posterior diferenciação para formar o calo cartilaginoso mole. A ponte das extremidades fraturadas ocorre, então, por um processo que se assemelha à formação óssea endocondral, na qual o arcabouço cartilaginoso se expande e depois mineraliza, formando o calo ósseo duro. Finalmente, o calo duro é gradualmente remodelado por osteoclastos e osteoblastos para restaurar a estrutura ósseaoriginal2,3.
Embora o processo de consolidação da fratura seja bastante robusto, envolve um intrincado somatório de eventos e é significativamente influenciado por vários fatores individuais, incluindo o estado geral de saúde, idade e sexo do paciente, bem como fatores de lesão, como o modo de estabilização mecânica do osso fraturado, a ocorrência de infecção e a gravidade da lesão de tecidos moles circundante4, 5.6. Portanto, falhas são comuns, levando ao desenvolvimento da pseudoartrose, o que impacta sobremaneira a reabilitação e a qualidade de vida dospacientes7,8. Devido ao crescente número de fraturas como resultado do trauma de alta energia e do envelhecimento, bem como aos altos custos dos tratamentos, as fraturas de pseudoartrose tornaram-se um fardo para os sistemas de saúde em todo omundo9,10. Essa carga crescente destaca a necessidade urgente de estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar o reparoósseo11,12 baseadas na combinação de células-tronco esqueléticas/mesenquimais/estromas e biomateriais biomiméticos13,14.
Em busca desse objetivo, modelos animais têm sido amplamente utilizados em estudos visando compreender a biologia fundamental dos mecanismos de consolidação de fraturas e em estudos pré-clínicos de prova de conceito com o objetivo de elaborar novas estratégias terapêuticas para promover o reparo ósseo15,16,17. Modelos de pequenos animais, como o camundongo, são excelentes para estudos de consolidação de fraturas devido à ampla disponibilidade de cepas e reagentes geneticamente modificados para análises experimentais e seus baixos custos de manutenção. Além disso, os camundongos apresentam um rápido curso de cicatrização, o que permite a análise temporal de todas as etapas do processo de reparo15. Entretanto, o pequeno tamanho do animal pode representar desafios para a produção cirúrgica de fraturas com modos de fixação semelhantes aos aplicados em humanos. Este protocolo descreve um modelo simples e de baixo custo de consolidação de fraturas em camundongos utilizando osteotomia femoral aberta estabilizada com fio intramedular, que se assemelha ao processo de reparo ósseo mais comum, através da formação de calo cartilaginoso, e pode ser utilizado tanto em investigações básicas quanto translacionais em que o acesso ao local da fratura é necessário.
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Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Protocolo nº 101/21). Camundongos Balb/c machos com 10-12 semanas de idade (25-30 g de peso corporal) foram usados neste estudo. O procedimento cirúrgico leva aproximadamente 15-20 min por rato. Antes de cada procedimento, os instrumentais necessários (listados na Tabela de Materiais) devem ser organizados sobre um campo cirúrgico estéril cobrindo a mesa cirúrgica (Figura 1A). Os instrumentos cirúrgicos metálicos devem ser autoclavados em envelopes autoselantes a 123 °C por 30 min. Itens descartáveis, como agulhas e compressas de gaze, devem ser adquiridos estéreis.
1. Preparo dos animais
- Anestesiar o camundongo e realizar analgesia de acordo com o regime veterinário recomendado pelo programa institucional de cuidados e uso de animais.
NOTA: Se disponível, a anestesia inalatória deve ser realizada preferencialmente. A descrição do protocolo de anestesia inalatória encontra-se no relato de Ewald et al.18. No entanto, se a fratura for produzida para estudos osteoimunológicos, esse tipo de anestesia deve ser evitado, pois evidências mostram que vários anestésicos voláteis, incluindo o isoflurano, afetam a atividade tanto das células imunes inatas quanto adaptativas19,20. - Quando o rato estiver imóvel, raspe a perna esquerda e, em seguida, transfira-a para a mesa cirúrgica numa almofada de aquecimento aquecida (ver Tabela de Materiais) a 37 °C coberta com um campo cirúrgico estéril.
- Realizar lavagem antisséptica da área da incisão esfregando a pele com uma esponja de iodopovidona a 10%. A desinfecção deve começar ao longo da linha de incisão e se estender para fora em um padrão circular. Secar a área esfregada com compressas de gaze estéril, lavar com etanol 70% e secar novamente com gaze estéril. Repita este procedimento três vezes.
- Posicionar o camundongo em decúbito lateral direito e imobilizar as patas com fita adesiva cirúrgica (Figura 1C).
- Escorra o mouse para que apenas a região da incisão fique visível (Figura 1D).
2. Procedimento cirúrgico
- Durante o procedimento cirúrgico, verifique constantemente se o rato está respirando e forneça colírios em seus olhos para evitar o ressecamento e evitar que o rato fique cego.
NOTA: Todo o procedimento cirúrgico geralmente leva ~15-20 min quando realizado por um cirurgião treinado. Portanto, aplicar o colírio uma vez no início do procedimento deve ser suficiente. Se o procedimento começar a ficar mais longo, aplicações adicionais podem ser realizadas sempre que for identificado que os olhos estão começando a secar. - Antes de proceder à incisão, avalie a profundidade anestésica pinçando a cauda para verificar o reflexo de resposta à dor e inspecionando visualmente a frequência respiratória (contando o número de movimentos torácicos por minuto)21. Sob anestesia ideal, o camundongo não deve responder a um beliscão na cauda, e a taxa de respiração deve ser em torno de 55-65 ciclos/min21.
- Realizar incisão parapatelar cutânea lateral de 1 cm com lâmina de bisturi (Figura 11, ver Tabela de Materiais), iniciando-se ao nível da tuberosidade tibial e estendendo-se até o nível da patela e depois, por igual distância, em direção ao fêmur distal (Figura 1E).
- Com tesoura romba, dissecar a fáscia subcutânea ao redor da linha de incisão para expor a fáscia lata, o vasto lateral e os músculos bíceps femoral22.
- Com a lâmina de bisturi número 11, realizar outra incisão na fáscia lata semelhante à realizada na pele, iniciando-se ao nível da tuberosidade tibial e percorrendo ao longo da aponeurose do bíceps femoral até o nível do fêmur distal, para abrir a cápsula articular e acessar a articulação do joelho (Figura 1F, G).
- Realizar uma luxação medial da patela colocando a ponta de uma pinça reta de precisão serrilhada (ver Tabela de Materiais) sob ela e empurrando-a para o lado juntamente com os ligamentos patelar e quadríceps, expondo assim os côndilos do fêmur (Figura 1H).
- Segurar o fêmur com uma ponta serrilhada tweezer, flexionar o joelho a 90° e perfurar manualmente o canal intramedular do fêmur através da fossa intercondilar com uma agulha hipodérmica 26G (Figura 1I, J).
- Mantendo o joelho fletido a 90°, inserir um segmento de 1,0 cm de um fio de haste de aço inoxidável 0,016 pol (0,40 mm) (Figura 1K, inserção) (ver Tabela de Materiais) através da abertura para o canal medular do fêmur em direção ao grande trocanter (Figura 1K).
OBS: Manter o joelho fletido a 90° é fundamental para a inserção adequada do fio no canal medular. Não fazê-lo resultará no extravasamento do fio para fora do osso e lesões de tecidos moles circundantes. - Ajustar a extremidade distal pré-dobrada do fio com uma pinça reta de ponta serrilhada para fixá-lo firmemente no côndilo lateral (Figura 1L). Além de fixar o fio no lugar, a extremidade dobrada facilitará a remoção post-mortem do fio.
- Separar os músculos vasto lateral e bíceps femoral através de dissecção romba com pinça de ponta serrilhada para acessar a diáfise distal do fêmur (Figura 1M).
- Inserir tesoura dissecante ao redor da diáfise do fêmur em um ângulo de aproximadamente 90° e, suavemente, realizar uma osteotomia cortical completa (Figura 1N).
NOTA: Os fêmures dos ratos são facilmente cortados. Abster-se de aplicar força excessiva durante a osteotomia para evitar a flexão do fio intramedular e a cominuição extensa da fratura. - Reposicione os músculos e a patela empurrando a ponta de uma pinça reta de precisão serrilhada sobre a região do côndilo.
- Fechar a fáscia muscular com sutura reabsorvível 6-0 e, em seguida, a pele com fio de náilon 6-0 (ver Tabela de Materiais), ambos de forma simples e interrompida (Figura 1O).
- Transfira o mouse para uma gaiola limpa individual para recuperação. Uma vez acordado, o rato deve ser capaz de se mover livremente com suporte de peso irrestrito.
- Nos dias seguintes após a cirurgia, realizar analgesia de acordo com o regime veterinário recomendado pelo programa institucional de cuidados e uso de animais.
3. Imagem por raios X
- Anestesiar o rato conforme descrito no passo 1.1.
NOTA: Se a radiografia for realizada logo após o procedimento cirúrgico e o mouse ainda estiver sob anestesia ideal (passo 2.2), não é necessário realizar esta etapa. - Para uma visão lateral limpa do fêmur fraturado, coloque o camundongo em decúbito dorsal e puxe levemente o membro posterior operado para o lado.
- Imobilizar as patas com fita adesiva cirúrgica.
- Realizar imagens radiográficas de acordo com o protocolo do equipamento disponível.
OBS: Para este estudo, foi utilizado um gerador de raios X odontológico digital com os seguintes parâmetros: tensão de 70 kVp, corrente de 7 mA e tempo de exposição de 0,2 s.
4. Processamento histológico e coloração de H&E
- Eutanásia dos camundongos com uma overdose intraperitoneal de anestésicos (consulte o regime recomendado para veterinários aprovado pelo programa institucional de cuidados e uso de animais). Após verificar a profundidade da anestesia com uma pinça na cauda, realizar a luxação cervical. Em seguida, coletar o osso fraturado, remover o excesso de tecido muscular circundante23 e fixar o osso em solução tamponada de formalina a 10% (pH 7,4) por 3 dias.
- Colocar as amostras ósseas em histológicas marcadas (ver Tabela de Materiais) e mergulhá-las em EDTA a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, por 14 dias para descalcificação. Troque a solução de descalcificação duas vezes por semana.
- Desidratar as amostras em uma série de soluções de concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) por 1 h cada.
- Limpar as amostras em dois banhos sequenciais de xileno por 30 min cada.
- Para infiltração de cera, imergir as amostras em dois banhos sequenciais de parafina a 60 °C por 30 min. Em seguida, incorpore as amostras em blocos para a secção24.
OBS: Para melhor visualização do calo, incorpore o osso com seu longo eixo na posição horizontal para permitir cortes longitudinais. - Cortar o tecido em secções de 4 μm de espessura com um micrótomo (ver Tabela de Materiais).
- Flutuar as secções num banho-maria a 56 °C e montar as secções em lâminas histológicas (ver Tabela de Materiais).
- Para a coloração H&E, desparafinizar as lâminas em três banhos sequenciais de xileno por 5 min e reidratar o tecido em uma série de soluções de concentrações decrescentes de etanol (95%, 80% e 70%) por 5 min.
- Enxaguar as lâminas em água corrente por 30 s, corar as lâminas com hematoxilina de Harris (ver Tabela de Materiais) por 6 min e enxaguar em água da torneira por mais 30 s.
- Imergir as lâminas em ácido clorídrico a 1% em etanol por 30 s e depois em etanol 70% por 30 s.
- Manchar com eosina (ver Tabela de Materiais) por 2 min, e lavar com água da torneira por 30 s.
- Desidratar as lâminas com etanol (70%, 80% e 95% por 5 min) e esclarecer com dois banhos de xileno por 5 min cada.
- Para montagem, pinge uma a duas gotas de meio de montagem (consulte Tabela de Materiais) em cada lâmina e cubra a lâmina com uma tampa limpa.
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Representative Results
A maneira mais simples e imediata de avaliar o sucesso do procedimento cirúrgico na produção da fratura é a radiografia. As radiografias podem ser realizadas imediatamente após a cirurgia, com o camundongo ainda sob anestesia, e posteriormente 7 dias, 14 dias e 21 dias após a fratura para avaliar a formação e progressão do calo. Os padrões de fratura aceitáveis são aqueles em que os córtices estão totalmente rompidos, os fios estão corretamente colocados dentro do canal medular e as linhas de fratura são transversais (com ângulo de 90° em relação ao eixo do osso), oblíquas (padrão curvo ou inclinado sem deslocamento do fragmento) ou oblíquas curtas (em torno de 30° em relação ao eixo do osso) (Figura 2A-D). Esses padrões são aceitáveis, pois todos eles progredirão para o reparo através da formação óssea endocondral (ou seja, com formação de calos) se os fragmentos ósseos estiverem devidamente alinhados (reduzidos), atingindo assim o objetivo principal do modelo. Portanto, são aceitáveis as fraturas apenas aquelas com cominuição extensa (múltiplos pequenos fragmentos ósseos), com encurtamento do membro em consequência do mau alinhamento e com fios mal posicionados (Figura 3). Animais com padrões de fratura inaceitáveis devem ser excluídos do estudo. Com o tempo, um calo robusto e visível deve ser observado no local da fratura (Figura 4).
Além disso, um exame histológico pode ser realizado aos 7 dias, 14 dias e 21 dias após a fratura para avaliar a neoformação tecidual dentro da área fraturada. Como a fixação com fios intramedulares permite certo grau de movimentação dos fragmentos ósseos, o processo regenerativo segue o mecanismo endocondral de ossificação, no qual áreas robustas de cartilagem hialina são vistas ao redor do traço de fratura no 7º dia (Figura 5A,B). No 14º dia, observam-se frentes de ossificação ao redor da área da cartilagem, formando osso trabecular e cavidades preenchidas por medula óssea reconstituída (Figura 5C,D). Finalmente, no 21º dia, as áreas de cartilagem são quase completamente substituídas por osso trabecular, indicando sucesso na ponte óssea (Figura 5E,F) e validade do modelo para estudos de consolidação de fraturas.
Figura 1: Fotomicrografias ilustrando os passos do procedimento cirúrgico para a produção de fraturas diafisárias do fêmur fixadas com um fio intramedular no camundongo. (A) Organização dos instrumentos cirúrgicos estéreis na mesa cirúrgica. (B) Injeção intraperitoneal dos anestésicos. (C) Posicionamento do camundongo em decúbito lateral e imobilização das patas. (D) Drapeamento do mouse, deixando exposta apenas a área que será operada. (E) A incisão parapatelar lateral cutânea. (F,G) Incisão da fáscia lata. (H) Luxação medial da patela, expondo a região do côndilo femoral. (I) Posicionamento da agulha na fossa intercondilar. (J) Perfuração do canal medular femoral. (K) Inserção do fio intramedular através da abertura femoral. (L) Ajuste da extremidade dobrada do fio no côndilo lateral. (M) Separação romba dos músculos circundantes. (N) Osteotomia cortical total do fêmur. (O) Fechamento dos tecidos moles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Radiografias representativas dos padrões aceitáveis de fratura. (A,B) Fraturas diafisárias transversais (as linhas de fratura estão em um ângulo de 90° em relação ao eixo do osso). (C) Fratura oblíqua curta (a linha de fratura é menor que 30° em relação ao eixo do osso). (D) Fratura fragmentária redutível (poucos pequenos fragmentos ósseos são vistos, mas o alinhamento anatômico do osso permanece). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Radiografias representativas dos fios colocados incorretamente. (A) Neste camundongo, o fio não está dentro do canal medular do fragmento proximal do fêmur, resultando em fixação incorreta do osso fraturado. (B) Neste caso, o fio não atravessou nenhum fragmento ósseo, e o osso fraturado está completamente desalinhado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Calo visível no local da fratura. Radiografias representativas dos calos de fratura no (A) dia 14 e (B) dia 21 após a cirurgia, mostrando que o processo regenerativo do modelo segue a via indireta (endocondral). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise histológica dos calos da fratura. Imagens representativas dos ossos fraturados no (A,B) dia 7, (C,D) dia 14 e (E,F) dia 21 após a cirurgia corados com H & E. Observe a evolução do calo; o calo apresenta-se inicialmente com extensas áreas de cartilagem hialina ao redor da linha de fratura (inserção em A, ampliada em B), essas áreas servem então de molde para a formação de osso trabecular (inserção em C, ampliada em D), e o processo culmina na substituição completa da cartilagem por osso e, assim, ponte óssea (inserção em E, ampliado em F). Barras de escala: (A,C,D) 500 μm; (B,D,F) 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
À medida que o número de fraturas aumenta em todo o mundo9,10,25, tratamentos inovadores para a pseudoartrose estão se tornando cada vez mais urgentes. Como a consolidação de fraturas envolve uma soma complexa e fortemente orquestrada de eventos que ocorrem em uma longa escala detempo3, o uso de modelos animais válidos é fundamental para melhorar nossa compreensão dos mecanismos que determinam o sucesso do reparo ósseo e para selecionar drogas e protocolos terapêuticoseficazes16,17.
No camundongo, tanto o fêmur quanto a tíbia podem ser usados para estudos de cicatrização de fraturas de ossos longos. Neste modelo, optou-se pelo fêmur em detrimento da tíbia por ser um osso reto, de maior diâmetro e melhor cobertura de partes moles. Por outro lado, a diáfise da tíbia de camundongos é curva e seu calibre diminui progressivamente ao longo da extremidade distal, o que dificulta a inserção de dispositivos de fixação intramedular26. Portanto, as características do fêmur o tornam ideal para modelos nos quais se pretende fixação intramedular. Em relação ao sexo, camundongos machos foram utilizados, pois há evidências de que os machos apresentam cicatrização mais rápida da fratura com formação de calo cartilaginoso mais proeminente em comparação com asfêmeas27. No entanto, se necessário, a técnica pode ser facilmente adaptada às fêmeas simplesmente ajustando o tamanho do fio intramedular para se ajustar ao comprimento ligeiramente menor do fêmur feminino.
Comparado aos modelos fechados de fratura que utilizam o mecanismo de flexão de três pontos com a guilhotina28, o modelo de cirurgia aberta aqui descrito também é vantajoso, pois expõe o local da fratura, o que permite ao pesquisador visualizar visualmente a fratura que está sendo produzida. Essa visualização ajuda a evitar erros técnicos que resultam nos seguintes padrões de fratura inaceitáveis: deslocamento grave do fragmento, que não permite o realinhamento anatômico do osso (fraturas não redutíveis); fragmentação extensa do osso em vários pequenos pedaços (cominuição), condição que pode prejudicar o processo de reparo; e/ou o extravio dos dispositivos de fixação. Como a fratura é causada por osteotomia suave neste modelo, geralmente não se observa deslocamento e/ou cominuição de fragmentos extensos.
No entanto, a técnica é limitada no sentido de que requer maior habilidade técnica cirúrgica e conhecimento da anatomia do camundongo do que outros métodos. Além disso, o pequeno tamanho do rato torna a manipulação mais complicada em comparação com ratos ou modelos de animais grandes. Uma vez que essas limitações são superadas com o treinamento, a taxa de sucesso na produção de fraturas aceitáveis é de quase 100%, reduzindo o número de remoções de animais do estudo.
Além disso, o modelo de fratura em cirurgia exposta permite a aplicação local de agentes terapêuticos, como células-tronco/progenitoras, biomateriais e/ou fármacos, que não seriam possíveis de serem aplicados por via percutânea ousistêmica26. Finalmente, a fixação com dispositivos intramedulares é mais fácil, barata e personalizável do que com placa e dispositivos externos e mimetiza a estratégia clínica mais comumente utilizada para o tratamento de fraturas de ossos longos29. Portanto, o modelo aqui descrito representa um modelo de baixo custo para o estudo da consolidação de fraturas, tanto em contexto básico quanto translacional, o que significa que este estudo contribui não apenas para o aumento do conhecimento da biologia da consolidação da fratura, mas também para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o reparo ósseo.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros conflitantes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al.
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T.
- Calori, G. M., et al.
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R.
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).
