Summary
В данном протоколе описывается хирургическая процедура по установлению диафизарного перелома бедренной кости мышей, которая стабилизируется интрамедуллярной проволокой, для исследований заживления перелома.
Abstract
Кости обладают значительной регенеративной способностью. Однако заживление переломов является сложным процессом, и в зависимости от тяжести поражений, возраста и общего состояния здоровья пациента могут возникать сбои, приводящие к отсроченному сращению или несращению. В связи с растущим числом переломов, возникающих в результате высокоэнергетических травм и старения, срочно необходима разработка инновационных терапевтических стратегий для улучшения восстановления костей, основанных на комбинации скелетных/мезенхимальных стволовых/стромальных клеток и биомиметических биоматериалов. С этой целью использование надежных моделей на животных имеет основополагающее значение для лучшего понимания ключевых клеточных и молекулярных механизмов, определяющих результаты лечения. Из всех моделей мышь является предпочтительной моделью исследования, поскольку она предлагает широкий спектр трансгенных штаммов и реагентов для экспериментального анализа. Тем не менее, установление переломов у мышей может быть технически сложной задачей из-за их небольшого размера. Поэтому целью данной статьи является демонстрация процедур хирургического установления диафизарного перелома бедренной кости у мышей, который стабилизируется интрамедуллярной проволокой и напоминает наиболее распространенный процесс восстановления кости, посредством образования хрящевой мозоли.
Introduction
Скелет является жизненно важным и функционально универсальным органом. Кости скелета обеспечивают осанку и движения тела, защищают внутренние органы, вырабатывают гормоны, которые интегрируют физиологические реакции, и являются местом кроветворенияи накопления минералов. При переломе кости обладают замечательной способностью к регенерации и полному восстановлению своей формы и функции до травмы. Процесс заживления начинается с образования гематомы и воспалительной реакции, которая индуцирует активацию и конденсацию скелетных стволовых/прогениторных клеток из надкостницы, эндостея и костного мозга и их последующую дифференцировку с образованием мягкой хрящевой мозоли. Сращивание сломанных концов происходит с помощью процесса, напоминающего формирование эндохондральной кости, при котором хрящевой каркас расширяется, а затем минерализуется, образуя твердую костную мозоль. Наконец, твердая мозоль постепенно ремоделируется остеокластами и остеобластами для восстановления первоначальной структуры кости 2,3.
Несмотря на то, что процесс заживления перелома является достаточно прочным, он включает в себя сложную совокупность событий и в значительной степени зависит от нескольких индивидуальных факторов, включая общее состояние здоровья, возраст и пол пациента, а также факторы травмы, такие как режим механической стабилизации сломанной кости, возникновение инфекции и тяжесть окружающего повреждения мягких тканей4, 5,6. Таким образом, часто случаются неудачи, приводящие к развитию несращения, что значительно влияет на реабилитацию пациента икачество жизни 7,8. Из-за растущего числа переломов в результате высокоэнергетических травм и старения, а также высокой стоимости лечения, несросшиеся переломы стали бременем для систем здравоохранения во всем мире 9,10. Это растущее бремя подчеркивает настоятельную потребность в инновационных терапевтических стратегиях для улучшения восстановления костной ткани11,12, основанных на комбинации скелетных/мезенхимальных стволовых/стромальных клеток и биомиметических биоматериалов13,14.
Для достижения этой цели животные модели широко использовались в исследованиях, направленных на понимание фундаментальной биологии механизмов заживления переломов, а также в доклинических исследованиях, направленных на разработку новых терапевтических стратегий, способствующих восстановлению костной ткани 15,16,17. Модели мелких животных, таких как мыши, отлично подходят для исследований заживления переломов из-за широкой доступности генетически модифицированных штаммов и реагентов для экспериментального анализа и низких затрат на их обслуживание. Кроме того, у мышей наблюдается быстрый ход заживления, что позволяет проводить временной анализ всех этапов процесса репарации15. Тем не менее, небольшой размер животного может создать проблемы для хирургического получения переломов с режимами фиксации, аналогичными тем, которые применяются у людей. Этот протокол описывает простую и недорогую модель заживления переломов у мышей с использованием открытой остеотомии бедренной кости, стабилизированной интрамедуллярной проволокой, которая напоминает наиболее распространенный процесс восстановления кости путем образования хрящевой мозоли, и может быть использована как в базовых, так и в трансляционных исследованиях, при которых требуется доступ к месту перелома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Центра медицинских наук Федерального университета Рио-де-Жанейро (протокол No 101/21). В исследовании использовали самцов мышей линии Balb/c в возрасте 10-12 недель (масса тела 25-30 г). Хирургическая процедура занимает примерно 15-20 минут на одну мышь. Перед каждой процедурой необходимые инструменты (перечисленные в таблице материалов) должны быть размещены на стерильном операционном поле, покрывающем операционный стол (Рисунок 1А). Металлические хирургические инструменты должны быть автоклавированы в самогерметизирующиеся конверты при температуре 123 °C в течение 30 минут. Одноразовые предметы, такие как иглы и марлевые салфетки, должны быть стерильными.
1. Подготовка животных
- Обезболивайте мышь и выполняйте анальгезию в соответствии с рекомендованным ветеринарами режимом, утвержденным программой по уходу за животными и их использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии необходимости предпочтительно проводить ингаляционную анестезию. Описание протокола ингаляционной анестезии можно найти в отчете Ewald et al.18. Однако, если перелом производится для остеоиммунологических исследований, этого вида анестезии следует избегать, так как данные показывают, что некоторые летучие анестетики, включая изофлуран, влияют на активность как врожденных, так и адаптивных иммунных клеток19,20. - Как только мышь станет неподвижной, побрейте левую ногу, а затем перенесите ее на операционный стол на теплую грелку (см. Таблицу материалов) при температуре 37 °C, накрыв стерильной хирургической простыней.
- Выполнить антисептическое промывание области разреза, протерев кожу 10% повидон-йодной губкой. Дезинфекция должна начинаться вдоль линии разреза и распространяться наружу по кругу. Высушите натертый участок стерильными марлевыми салфетками, вымойте 70% этиловым спиртом и снова высушите стерильной марлевой салфеткой. Повторите эту процедуру три раза.
- Поместите мышь в правостороннее положение пролежней и обездвижьте лапы хирургической лентой (рис. 1C).
- Накиньте мышь так, чтобы была видна только область разреза (рис. 1D).
2. Хирургическое вмешательство
- Во время хирургической процедуры постоянно проверяйте, дышит ли мышь, и закапывайте ей глазные капли, чтобы избежать сухости и предотвратить слепоту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся хирургическая процедура обычно занимает ~15-20 минут, если выполняется квалифицированным хирургом. Поэтому одного применения глазных капель в начале процедуры должно быть достаточно. Если процедура начинает удлиняться, можно проводить дополнительные аппликации, когда будет выявлено, что глаза начинают сохнуть. - Прежде чем приступить к разрезу, оцените глубину анестетика, ущипнув хвост для проверки рефлекса болевой реакции и визуально проверив частоту дыхания (считая количество движений грудной клетки в минуту)21. При оптимальной анестезии мышь не должна реагировать на пощипывание хвоста, а частота дыхания должна составлять около 55-65 вдохов/мин21.
- Сделайте латеральный парапателлярный разрез кожи длиной 1 см лезвием скальпеля (No 11, см. таблицу материалов), начиная с уровня бугристости большеберцовой кости и заканчивая уровнем надколенника, а затем, на равном расстоянии, по направлению к дистальному отделу бедренной кости (рис. 1E).
- Ножницами с тупым концом рассекают подкожную фасцию вокруг линии разреза, чтобы обнажить широчайшую фасцию, латеральный вастус и двуглавую мышцу бедра22.
- Лезвием скальпеля No 11 сделайте еще один разрез в широчайшей фасции, аналогичный тому, который делается на коже, начиная с уровня бугристости большеберцовой кости и проходя вдоль апоневроза двуглавой мышцы бедра до уровня дистального отдела бедренной кости, чтобы открыть суставную капсулу и получить доступ к коленному суставу (рис. 1F, G).
- Выполните медиальный вывих надколенника, поместив под него кончик прямого зубчатого пинцета с прецизионным кончиком (см. Таблицу материалов) и отодвинув его в сторону вместе со связками надколенника и четырехглавой мышцы бедра, обнажив таким образом мыщелки бедренной кости (рис. 1H).
- Придерживая бедренную кость пинцетом с зазубренным наконечником, согните колено под углом 90° и вручную проперфорируйте интрамедуллярный канал бедренной кости через межмыщелковую ямку иглой для подкожных инъекций 26 G (рис. 1I, J).
- Удерживая колено согнутым под углом 90°, введите отрезок диаметром 1,0 см из стержневой проволоки из нержавеющей стали диаметром 0,016 дюйма (0,40 мм) (см. Таблицу материалов) через отверстие в мозговой канал бедренной кости по направлению к большому вертелу (Рисунок 1К).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание коленного сустава согнутым под углом 90° имеет решающее значение для правильного введения проволоки в медуллярный канал. Если этого не сделать, это приведет к экстравазации проволоки из кости и окружающих поражений мягких тканей. - Отрегулируйте предварительно отогнутый дистальный конец проволоки пинцетом с прямым зазубренным концом, чтобы плотно зафиксировать его в боковом мыщелке (рис. 1L). Помимо фиксации проволоки на месте, согнутый конец облегчит посмертное удаление проволоки.
- Отделите латеральную васту и мышцу двуглавой мышцы бедра путем рассечения тупым концом пинцетом с зазубренным концом, чтобы получить доступ к дистальному диафизу бедренной кости (рис. 1M).
- Вставьте рассекающие ножницы вокруг диафиза бедренной кости под углом примерно 90° и аккуратно выполните полную кортикальную остеотомию (рис. 1N).
ПРИМЕЧАНИЕ: Бедренные кости мышей легко разрезаются. Воздержитесь от приложения чрезмерной силы во время остеотомии, чтобы избежать изгиба интрамедуллярной проволоки и обширного измельчения перелома. - Переместите мышцы и коленную чашечку, надавливая кончиком пинцета с прямым зазубренным кончиком на область мыщелка.
- Закройте мышечную фасцию рассасывающимся шовным материалом 6-0, а затем кожу нейлоновым шовным материалом 6-0 (см. таблицу материалов), оба простым прерывистым способом (рисунок 1O).
- Переложите мышь в индивидуальную чистую клетку для восстановления. После пробуждения мышь должна иметь возможность свободно двигаться с неограниченной нагрузкой.
- В последующие дни после операции проводят обезболивание в соответствии с рекомендованной ветеринарами схемой, утвержденной программой ухода и использования животных в учреждении.
3. Рентгенография
- Обезболивайте мышь, как описано в шаге 1.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если рентгенография проводится сразу после хирургического вмешательства, а мышь все еще находится под оптимальной анестезией (шаг 2.2), нет необходимости выполнять этот этап. - Для четкого бокового обзора сломанной бедренной кости поместите мышь в положение спинного пролежня, а оперированную заднюю конечность слегка отведите в сторону.
- Обездвижьте лапы хирургической лентой.
- Выполняйте рентгенографическую визуализацию в соответствии с имеющимся протоколом оборудования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для данного исследования был использован цифровой генератор стоматологического рентгеновского излучения со следующими параметрами: напряжение 70 кВ, ток 7 мА и время экспозиции 0,2 с.
4. Гистологическая обработка и окрашивание H&E
- Усыпляйте мышей с помощью внутрибрюшинной передозировки анестетиков (см. рекомендованную ветеринарами схему, одобренную программой по уходу за животными и их использованию). Проверив глубину анестезии защемлением хвоста, выполняют вывих шейного отдела. Затем собирают сломанную кость, удаляют излишки окружающей мышечной ткани23 и фиксируют кость в 10% буферном растворе формалина (рН 7,4) в течение 3 дней.
- Поместите образцы костей в маркированные гистологические кассеты (см. таблицу материалов) и погрузите их в 10% ЭДТА в фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4, на 14 дней для декальцинации. Меняйте раствор для удаления накипи два раза в неделю.
- Обезвоживают образцы в серии растворов с возрастающими концентрациями этанола (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) в течение 1 ч каждый.
- Очищают образцы в двух последовательных ваннах с ксилолом по 30 мин каждая.
- Для инфильтрации воска образцы погружают в две последовательные парафиновые ванны при 60 °C на 30 мин. Далее встраиваем образцы в блоки для секционирования24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы лучше рассмотреть мозоль, поместите кость длинной осью в горизонтальное положение, чтобы обеспечить продольные разрезы. - Разрежьте ткань на срезы толщиной 4 мкм микротомом (см. Таблицу материалов).
- Срезы поплавят на водяной бане с температурой 56 °C и смонтируют на гистологических предметных стеклах (см. Таблицу материалов).
- Для окрашивания H&E депарафинизируют предметные стекла в трех последовательных ваннах с ксилолом в течение 5 мин и регидратируют ткань в серии растворов для снижения концентрации этанола (95%, 80% и 70%) в течение 5 мин.
- Промыть предметные стекла в водопроводной воде в течение 30 с, окрасить предметные стекла гематоксилином Harris (см. таблицу материалов) в течение 6 мин и промыть их в водопроводной воде еще 30 с.
- Погружают предметные стекла в 1%-ную соляную кислоту в этаноле на 30 с, а затем в 70%-ный этанол на 30 с.
- Окрашивать эозином (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин и смывать водопроводной водой в течение 30 с.
- Обезвоживайте предметные стекла этанолом (70%, 80% и 95% в течение 5 минут) и осветляйте двумя ваннами с ксилолом по 5 минут каждая.
- Для монтажа капните одну-две капли монтажного носителя (см. Таблицу материалов) на каждое предметное стекло и накройте затвор чистым покровным стеклом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Самым простым и непосредственным способом оценить успешность хирургического вмешательства в получении перелома является рентгенография. Рентгенограммы могут быть выполнены сразу после операции, когда мышь все еще находится под наркозом, а затем через 7, 14 и 21 день после перелома для оценки образования и прогрессирования костной мозоли. Приемлемыми моделями переломов являются те, при которых кора коры полностью разорвана, спицы правильно расположены в медуллярном канале, а линии перелома являются поперечными (под углом 90° к оси кости), косыми (изогнутые или наклонные без смещения фрагментов) или короткими косыми (около 30° относительно оси кости) (рис. 2A-D). Эти паттерны приемлемы, потому что все они будут прогрессировать до восстановления через эндохондральное формирование кости (т.е. с образованием костной мозоли), если костные фрагменты правильно выровнены (редуцированы), тем самым достигая основной цели модели. Поэтому недопустимыми переломами считаются только переломы с обширным измельчением (множественные мелкие костные фрагменты), с укорочением конечности вследствие плохого выравнивания и с неправильно расположенными спицами (рис. 3). Животные с неприемлемыми характерами переломов должны быть исключены из исследования. Со временем на месте перелома должна появиться прочная и видимая мозоль (рис. 4).
Кроме того, гистологическое исследование может быть проведено через 7, 14 и 21 день после перелома для оценки новообразования тканей в области перелома. Поскольку фиксация интрамедуллярными проволоками обеспечивает определенную степень подвижности костных отломков, регенеративный процесс следует эндохондральному механизму оссификации, при котором на 7-й день вокруг линии перелома видны прочные участки гиалинового хряща (рис. 5A, B). На 14-е сутки вокруг хрящевой области наблюдаются фронты окостенения, образующие трабекулярную кость и полости, заполненные восстановленным костным мозгом (рис. 5C, D). Наконец, на 21-й день участки хряща почти полностью заменяются трабекулярной костью, что указывает на успешное сращивание костного моста (рис. 5E, F) и валидность модели для исследований заживления переломов.
Рисунок 1: Микрофотографии, иллюстрирующие этапы хирургической процедуры по получению диафизарных переломов бедренной кости, зафиксированных интрамедуллярной проволокой у мыши. (А) Организация стерильных хирургических инструментов на операционном столе. (Б) Внутрибрюшинное введение анестетиков. (В) Постановка мыши в положение бокового пролежня и обездвиживание лап. (D) Драпировка мыши, оставляя открытой только ту область, на которой будет проводиться операция. (E) Кожный боковой парапателлярный разрез. (Ж,Ж) Виды разреза широчайшей фасции. (H) Медиальный вывих надколенника, обнажающий область мыщелка бедренной кости. (I) Позиционирование иглы в межмыщелковой ямке. (J) Перфорация бедренного мозгового канала. (K) Введение интрамедуллярной проволоки через бедренное отверстие. (L) Регулировка изогнутого конца проволоки в боковом мыщелке. (М) Отделение окружающих мышц тупым концом. (N) Полная кортикальная остеотомия бедренной кости. (О) Закрытие мягких тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные рентгенограммы приемлемых картин переломов. (А,Б) Поперечные диафизарные переломы (линии перелома расположены под углом 90° к оси кости). (C) Короткий косой перелом (линия перелома находится под углом менее 30° по отношению к оси кости). (D) Вправимый фрагментарный перелом (видны небольшие фрагменты кости, но анатомическое расположение кости остается). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные рентгенограммы неправильно расположенных спиц. (А) У этой мыши проволока не находится внутри медуллярного канала проксимального фрагмента бедренной кости, что приводит к неправильной фиксации сломанной кости. (Б) В этом случае проволока не прошла через какой-либо фрагмент кости, и сломанная кость полностью не выровнена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Видимая мозоль в месте перелома. Репрезентативные рентгенограммы мозолей переломов на 14-й и 21-й день (Б) после операции, показывающие, что регенеративный процесс модели идет по непрямому (эндохондральному) пути. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистологический анализ мозолей перелома. Репрезентативные изображения переломов костей на 7-й день (A, B), 14-й день (C, D) и 21-й день (E, F) после операции, окрашенные H&E. Обратите внимание на эволюцию мозоли; мозоль первоначально представляет собой обширные участки гиалинового хряща вокруг линии перелома (вставка в А, увеличенная в В), затем эти области служат шаблонами для формирования трабекулярной кости (вставка в С, увеличенная в D), и процесс завершается полной заменой хряща костью и, таким образом, костным мостом (вставка в Е, увеличено в F). Масштабные линейки: (A,C,D) 500 мкм; (B,D,F) 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По мере того, как количество переломов во всем мире увеличивается 9,10,25, инновационные методы лечения несращений становятся все более актуальными. Поскольку заживление переломов включает в себя сложную и строго организованную суммациюсобытий, происходящих в течение длительного периода времени3, использование валидных животных моделей имеет центральное значение для улучшения нашего понимания механизмов, определяющих успех восстановления кости, и для выбора эффективных препаратов и терапевтических протоколов16,17.
У мышей и бедренная, и большеберцовая кости могут быть использованы для исследований заживления длинных переломов костей. В этой модели бедренная кость была выбрана вместо большеберцовой, потому что это прямая кость с большим диаметром и лучшим покрытием мягких тканей. С другой стороны, диафиз большеберцовой кости мыши искривлен, и его калибр прогрессивно уменьшается по дистальному концу, что затрудняет введение интрамедуллярных фиксирующих устройств26. Поэтому характеристики бедренной кости делают ее идеальной для моделей, в которых предполагается интрамедуллярная фиксация. Что касается пола, то использовались самцы мышей, так как есть доказательства того, что самцы демонстрируют более быстрое заживление переломов с более выраженным образованием хрящевой мозоли по сравнению с самками27. Однако, при необходимости, техника может быть легко адаптирована к женщинам, просто отрегулировав размер интрамедуллярной проволоки, чтобы она соответствовала немного меньшей длине женской бедренной кости.
По сравнению с моделями закрытых переломов, в которых используется механизм трехточечного изгиба с гильотиной28, описанная здесь модель открытой хирургии также выгодна, поскольку она обнажает место перелома, что позволяет исследователю визуально увидеть образующийся перелом. Такая визуализация помогает избежать технических ошибок, которые приводят к следующим недопустимым схемам переломов: сильное смещение отломков, не позволяющее анатомически выровнять кость (невправимые переломы); обширное дробление кости на несколько мелких кусочков (измельчение), состояние, которое может нарушить процесс восстановления; и/или неправильное размещение фиксирующих устройств. Поскольку перелом вызван щадящей остеотомией в этой модели, обширного смещения и/или измельчения фрагментов, как правило, не наблюдается.
Однако методика ограничена в том смысле, что требует больших технических хирургических навыков и знания анатомии мыши, чем другие методы. Кроме того, небольшой размер мыши делает манипуляции более сложными по сравнению с крысами или крупными животными. Как только эти ограничения будут преодолены с помощью дрессировки, уровень успеха в получении приемлемых переломов составляет почти 100%, что снижает количество изъятий животных из исследования.
Кроме того, модель открытого хирургического перелома позволяет локально применять терапевтические агенты, такие как стволовые/прогениторные клетки, биоматериалы и/или фармацевтические препараты, которые невозможно применить при чрескожном или системном введении26. Наконец, фиксация интрамедуллярными устройствами проще, дешевле и более индивидуальна, чем пластинчатыми и внешними устройствами, и имитирует наиболее часто используемую клиническую стратегию лечения переломов длинных костей29. Таким образом, описанная здесь модель представляет собой недорогую модель для изучения заживления переломов, как в базовых, так и в трансляционных условиях, что означает, что это исследование способствует не только расширению знаний о биологии заживления переломов, но и разработке новых терапевтических стратегий для восстановления кости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт финансовых интересов у авторов отсутствует.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Фондом поддержки научных исследований штата Рио-де-Жанейро имени Карлоса Шагаса Фильо (FAPERJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al.
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T.
- Calori, G. M., et al.
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R.
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).
