Summary
Bu protokol, kırık iyileşme çalışmaları için intramedüller tel ile stabilize edilen farelerin uyluk kemiğinde diyafiz kırığı oluşturulması için cerrahi bir prosedürü açıklar.
Abstract
Kemikler önemli bir rejeneratif kapasiteye sahiptir. Bununla birlikte, kırık iyileşmesi karmaşık bir süreçtir ve lezyonların ciddiyetine ve hastanın yaşına ve genel sağlık durumuna bağlı olarak, gecikmiş kaynama veya kaynamama ile sonuçlanan başarısızlıklar meydana gelebilir. Yüksek enerjili travma ve yaşlanmadan kaynaklanan kırık sayısının artması nedeniyle, iskelet/mezenkimal kök/stromal hücreler ve biyomimetik biyomateryallerin kombinasyonuna dayalı kemik onarımını iyileştirmek için yenilikçi terapötik stratejilerin geliştirilmesine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bu amaçla, güvenilir hayvan modellerinin kullanılması, iyileşme sonuçlarını belirleyen temel hücresel ve moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için esastır. Tüm modeller arasında fare, deneysel analiz için çok çeşitli transgenik suşlar ve reaktifler sunduğu için tercih edilen araştırma modelidir. Bununla birlikte, farelerde kırıkların oluşturulması, küçük boyutları nedeniyle teknik olarak zor olabilir. Bu nedenle, bu makale, farelerde intramedüller tel ile stabilize edilen ve en sık görülen kemik onarım sürecini andıran diyafiz femur kırığının kıkırdaklı kallus oluşumu yoluyla cerrahi olarak oluşturulmasına yönelik prosedürleri göstermeyi amaçlamaktadır.
Introduction
İskelet, hayati ve işlevsel olarak çok yönlü bir organdır. İskeletin kemikleri vücut duruşunu ve hareketini sağlar, iç organları korur, fizyolojik tepkileri bütünleştiren hormonlar üretir ve hematopoez ve mineral depolama alanıdır1. Kırılırsa, kemikler yaralanma öncesi form ve işlevlerini yenilemek ve tamamen eski haline getirmek için dikkate değer bir kapasiteye sahiptir. İyileşme süreci, periost, endosteum ve kemik iliğinden iskelet kökü/progenitör hücrelerinin aktivasyonunu ve yoğunlaşmasını ve ardından yumuşak kıkırdaklı kallusu oluşturmak üzere farklılaşmasını indükleyen bir hematom ve enflamatuar bir yanıt oluşumu ile başlar. Kırık uçların köprülenmesi daha sonra, kıkırdaklı iskelenin genişlediği ve daha sonra mineralleşerek sert kemikli nasırı oluşturduğu endokondral kemik oluşumuna benzeyen bir süreçle gerçekleşir. Son olarak, sert nasır, orijinal kemik yapısını eski haline getirmek için osteoklastlar ve osteoblastlar tarafından kademeli olarak yeniden şekillendirilir 2,3.
Kırık iyileşme süreci oldukça sağlam olmasına rağmen, olayların karmaşık bir özetini içerir ve hastanın genel sağlık durumu, yaşı ve cinsiyeti gibi çeşitli bireysel faktörlerin yanı sıra kırık kemiğin mekanik stabilizasyon modu, enfeksiyon oluşumu ve çevredeki yumuşak doku yaralanmasının ciddiyeti gibi yaralanma faktörlerinden önemli ölçüde etkilenir4, 5,6. Bu nedenle, başarısızlıklar yaygındır ve hasta rehabilitasyonunu ve yaşam kalitesini büyük ölçüde etkileyen kaynamama gelişimine yol açar 7,8. Yüksek enerjili travma ve yaşlanma sonucu artan kırık sayısı ve tedavi maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle kaynamayan kırıklar dünya çapında sağlık sistemleri için bir yük haline gelmiştir 9,10. Bu artan yük, iskelet/mezenkimal kök/stromal hücreler ve biyomimetik biyomateryallerin 13,14 kombinasyonuna dayalı olarak kemik onarımını11,12 iyileştirmek için yenilikçi terapötik stratejilere olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır.
Bu amaç doğrultusunda, kırık iyileşme mekanizmalarının temel biyolojisini anlamayı amaçlayan çalışmalarda ve kemik onarımını desteklemek için yeni terapötik stratejiler geliştirmeyi amaçlayan kavram kanıtı klinik öncesi çalışmalarda hayvan modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır 15,16,17. Fare gibi küçük hayvan modelleri, deneysel analizler için genetiği değiştirilmiş suşların ve reaktiflerin geniş mevcudiyeti ve düşük bakım maliyetleri nedeniyle kırık iyileştirme çalışmaları için mükemmeldir. Ek olarak, fareler, onarım sürecinin tüm aşamalarının zamansal analizine izin veren hızlı bir iyileşme süresi seyrine sahiptir15. Bununla birlikte, hayvanın küçük boyutu, insanlarda uygulananlara benzer fiksasyon modlarına sahip kırıkların cerrahi üretimi için zorluklar oluşturabilir. Bu protokol, kıkırdaklı kallus oluşumu yoluyla en yaygın kemik onarım sürecine benzeyen intramedüller tel ile stabilize edilmiş açık bir femoral osteotomi kullanan farelerde basit ve düşük maliyetli bir kırık iyileşmesi modelini tanımlar ve kırık bölgesine erişimin gerekli olduğu hem temel hem de translasyonel araştırmalarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nin Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı (Protokol Numarası 101/21). Bu çalışmada 10-12 haftalıkken (25-30 g vücut ağırlığı) erkek Balb/c fareler kullanıldı. Cerrahi işlem fare başına yaklaşık 15-20 dakika sürer. Her prosedürden önce, gerekli aletler ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) ameliyat masasını kaplayan steril bir cerrahi alan üzerinde düzenlenmelidir (Şekil 1A). Metalik cerrahi aletler, kendinden sızdırmaz zarflar içinde 123 °C'de 30 dakika otoklavlanmalıdır. İğneler ve gazlı bezler gibi tek kullanımlık ürünler steril olarak temin edilmelidir.
1. Hayvan hazırlama
- Fareyi uyuşturun ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım programı tarafından onaylanan veteriner tarafından önerilen rejime uygun olarak analjezi yapın.
NOT: Varsa, inhalasyon anestezisi tercihen yapılmalıdır. İnhalasyon anestezisi protokolünün bir açıklaması Ewald ve ark.18 tarafından hazırlanan raporda bulunabilir. Bununla birlikte, kırık osteoimmünoloji çalışmaları için üretilirse, kanıtlar izofluran da dahil olmak üzere çeşitli uçucu anesteziklerin hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık hücrelerinin aktivitesini etkilediğini gösterdiğinden, bu tip anesteziden kaçınılmalıdır19,20. - Fare hareketsiz hale geldiğinde, sol bacağını tıraş edin ve ardından steril bir cerrahi örtü ile kaplı 37 °C'de ılık bir ısıtma yastığı ( Malzeme Tablosuna bakın) üzerinde ameliyat masasına aktarın.
- Cildi% 10 povidon-iyot süngeri ile ovalayarak kesi bölgesinin antiseptik yıkamasını gerçekleştirin. Dezenfeksiyon insizyon hattı boyunca başlamalı ve dairesel bir düzende dışa doğru uzanmalıdır. Ovuşturulan bölgeyi steril gazlı bezle kurulayın,% 70 etanol ile yıkayın ve steril bir gazlı bezle tekrar kurulayın. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
- Fareyi sağ lateral dekübit pozisyonuna getirin ve pençeleri cerrahi bantla hareketsiz hale getirin (Şekil 1C).
- Fareyi sadece kesi bölgesi görünecek şekilde örtün (Şekil 1D).
2. Cerrahi prosedür
- Cerrahi işlem sırasında, farenin nefes alıp almadığını sürekli kontrol edin ve kuruluğu önlemek ve farenin kör olmasını önlemek için gözlerine göz damlası verin.
NOT: Tüm cerrahi prosedür, eğitimli bir cerrah tarafından gerçekleştirildiğinde genellikle ~ 15-20 dakika sürer. Bu nedenle işlemin başında göz damlalarının bir kez uygulanması yeterli olacaktır. İşlem uzamaya başlarsa, gözlerin kurumaya başladığı tespit edildiğinde ek uygulamalar yapılabilir. - İnsizyona geçmeden önce, ağrı tepkisi refleksini kontrol etmek için kuyruğu sıkıştırarak ve solunum hızını görsel olarak inceleyerek (dakikadaki torasik hareketlerin sayısını sayarak) anestezik derinliği değerlendirin21. Optimal anestezi altında, fare kuyruk tutamına cevap vermemeli ve solunum hızı 55-65 nefes/dk21 civarında olmalıdır.
- Tibial tüberozite seviyesinden başlayıp patella seviyesine kadar uzanan ve daha sonra eşit bir mesafe için distal femura doğru bir neşter bıçağı ile 1 cm'lik bir kutanal lateral parapatellar insizyon yapın (Numara 11, bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1E).
- Künt uçlu makasla, fasya lata, lateral vastus ve femoral biseps kaslarını ortaya çıkarmak için deri altı fasyayı insizyon hattının etrafında inceleyin22.
- 11 numaralı neşter bıçağı ile, eklem kapsülünü açmak ve diz eklemine erişmek için tibial tüberozite seviyesinden başlayarak ve biseps femoris aponevroz boyunca distal femur seviyesine kadar uzanarak fasya latada deride yapılana benzer başka bir kesi yapın (Şekil 1F, G).
- Düz tırtıklı hassas uçlu bir cımbızın ucunu (Malzeme Tablosuna bakınız) altına yerleştirerek ve patella ve kuadriseps bağları ile birlikte yana doğru iterek patellanın medial luksasyonunu gerçekleştirin, böylece femurun kondillerini açığa çıkarın (Şekil 1H).
- Femuru tırtıklı uçlu cımbızla tutarak dizi 90° esnetin ve femurun intramedüller kanalını 26 G hipodermik iğne ile interkondiler fossadan manuel olarak delin (Şekil 1I, J).
- Dizi 90°'de bükülmüş halde tutarak, 1.0 cm'lik bir 0.016 inç (0.40 mm) paslanmaz çelik çubuk telin (Şekil 1K, insert) (bkz. Malzeme Tablosu) açıklıktan femurun medüller kanalına büyük trokantere doğru (Şekil 1K) sokun.
NOT: Telin medüller kanala düzgün bir şekilde yerleştirilmesi için dizin 90° bükülmüş halde tutulması çok önemlidir. Bunu yapmamak, telin kemikten ve çevresindeki yumuşak doku lezyonlarından ekstravazasyonuna neden olacaktır. - Lateral kondile sıkıca sabitlemek için telin önceden bükülmüş distal ekstremitesini düz tırtıklı uçlu bir cımbızla ayarlayın (Şekil 1L). Telin yerine sabitlenmesine ek olarak, bükülmüş ekstremite, telin ölüm sonrası çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.
- Femurun distal diyafizine erişmek için tırtıklı uçlu bir cımbızla künt uç diseksiyonu yoluyla lateral vastus ve femoral biseps kaslarını ayırın (Şekil 1M).
- Femur diyafizinin etrafına yaklaşık 90°'lik bir açıyla diseksiyon makası yerleştirin ve nazikçe tam bir kortikal osteotomi uygulayın (Şekil 1N).
NOT: Farelerin uyluk kemiği kolayca kesilir. İntramedüller telin bükülmesini ve geniş kırık ufalanmasını önlemek için osteotomi sırasında aşırı kuvvet uygulamaktan kaçının. - Düz tırtıklı, hassas uçlu bir cımbızın ucunu kondil bölgesi üzerinde iterek kasları ve patellayı yeniden konumlandırın.
- Kas fasyasını 6-0 emilebilir bir sütürle ve ardından cildi 6-0 naylon sütür kullanarak kapatın (bkz. Malzeme Tablosu), her ikisi de basit bir şekilde kesilmiş bir şekilde (Şekil 1O).
- Kurtarma için fareyi ayrı bir temiz kafese aktarın. Uyandıktan sonra, fare sınırsız ağırlık taşıyarak serbestçe hareket edebilmelidir.
- Ameliyattan sonraki günlerde, kurumsal hayvan bakım ve kullanım programı tarafından onaylanan veteriner hekim tarafından önerilen rejime uygun olarak analjezi uygulayın.
3. X-ışını görüntüleme
- Fareyi adım 1.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.
NOT: Radyografi cerrahi işlemden hemen sonra yapıldıysa ve fare hala optimal anestezi altındaysa (adım 2.2), bu adımın gerçekleştirilmesi gerekli değildir. - Kırık femurun temiz bir yanal görünümü için, fareyi dorsal dekübit pozisyonuna getirin ve ameliyat edilen arka ayağı hafifçe yana doğru çekin.
- Pençeleri cerrahi bantla hareketsiz hale getirin.
- Mevcut ekipman protokolüne göre radyografik görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: Bu çalışma için, aşağıdaki parametrelerle bir dijital diş röntgeni jeneratörü kullanılmıştır: 70 kVp voltaj, 7 mA akım ve 0,2 s maruz kalma süresi.
4. Histoloji işleme ve H&E boyama
- Fareleri intraperitoneal aşırı dozda anestezik ile ötenazi yapın (lütfen kurumsal hayvan bakımı ve kullanım programı tarafından onaylanan veteriner tarafından önerilen rejime bakın). Anestezi derinliğini bir kuyruk tutamıyla kontrol ettikten sonra servikal çıkık yapın. Daha sonra, kırık kemiği toplayın, çevredeki fazla kas dokusunu23 çıkarın ve kemiği 3 gün boyunca% 10 tamponlu formalin çözeltisinde (pH 7.4) sabitleyin.
- Kemik örneklerini etiketli histoloji kasetlerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve dekalsifikasyon için 14 gün boyunca fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde% 10 EDTA'ya daldırın. Dekalsifikasyon solüsyonunu haftada iki kez değiştirin.
- Numuneleri, her biri 1 saat boyunca artan etanol konsantrasyonlarına (%70, %80, %90, %100, %100) sahip bir dizi çözelti içinde kurutun.
- Numuneleri her biri 30 dakika boyunca iki ardışık ksilen banyosunda temizleyin.
- Balmumu sızması için, numuneleri 30 dakika boyunca 60 ° C'de iki ardışık parafin banyosuna daldırın. Ardından,24'ü bölmek için örnekleri bloklara gömün.
NOT: Nasırı daha iyi görebilmek için, uzunlamasına kesimlere izin vermek için kemiği uzun ekseni yatay konumda olacak şekilde gömün. - Dokuyu bir mikrotom ile 4 μm kalınlığında bölümler halinde kesin (bkz.
- Bölümleri 56 ° C'lik bir su banyosunda yüzdürün ve bölümleri histolojik slaytlara monte edin (bkz.
- H & E boyama için, slaytları 5 dakika boyunca üç ardışık ksilen banyosunda deparafinize edin ve dokuyu 5 dakika boyunca etanol konsantrasyonlarını (% 95,% 80 ve% 70) azaltan bir dizi çözelti içinde yeniden sulandırın.
- Slaytları musluk suyunda 30 saniye durulayın, slaytları Harris hematoksilen ile 6 dakika boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve musluk suyunda 30 saniye daha durulayın.
- Slaytları 30 saniye boyunca etanol içinde %1 hidroklorik asit içine ve ardından 30 saniye boyunca %70 etanole daldırın.
- Eozin ile 2 dakika boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 30 saniye musluk suyuyla yıkayın.
- Slaytları etanol ile kurutun (%70, %80 ve %95 5 dakika) ve her biri 5 dakika boyunca iki banyo ksilen ile netleştirin.
- Montaj için, her bir kızağın üzerine bir ila iki damla montaj ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın) damlatın ve sürgüyü temiz bir lamel ile örtün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cerrahi prosedürün kırığı üretmedeki başarısını değerlendirmenin en basit ve hızlı yolu X-ışını görüntülemedir. Radyografiler ameliyattan hemen sonra, fare hala anestezi altındayken ve ardından nasır oluşumunu ve ilerlemesini değerlendirmek için kırıktan 7 gün, 14 gün ve 21 gün sonra yapılabilir. Kabul edilebilir kırık paternleri, kortekslerin tamamen yırtıldığı, tellerin medüller kanal içine doğru yerleştirildiği ve kırık hatlarının enine (kemiğin eksenine 90°'lik bir açıyla), eğik (parça yer değiştirmesi olmayan kavisli veya eğimli desen) veya kısa eğik (kemiğin eksenine göre yaklaşık 30°) olduğu kırıklardır (Şekil 2A-D). Bu modeller kabul edilebilir, çünkü kemik parçaları uygun şekilde hizalanırsa (küçültülürse) hepsi endokondral kemik oluşumu (yani kallus oluşumu ile) yoluyla onarıma ilerleyecek ve böylece modelin ana hedefine ulaşacaktır. Bu nedenle, kabul edilemez kırıklar sadece geniş ufalanma (çok sayıda küçük kemik parçası), zayıf hizalama sonucu ekstremitenin kısalması ve yanlış yerleştirilmiş teller ile olanlardır (Şekil 3). Kabul edilemez kırık paternlerine sahip hayvanlar çalışmadan çıkarılmalıdır. Zamanla, kırık bölgesinde sağlam ve görünür bir kallus gözlenmelidir (Şekil 4).
Ek olarak, kırık bölgedeki doku neoformasyonunu değerlendirmek için kırıktan 7 gün, 14 gün ve 21 gün sonra histolojik inceleme yapılabilir. İntramedüller tellerle fiksasyon, kemik parçalarının belirli bir derecede hareketine izin verdiğinden, rejeneratif süreç, 7. günde kırık hattı çevresinde sağlam hiyalin kıkırdak alanlarının görüldüğü endokondral kemikleşme mekanizmasını takip eder (Şekil 5A, B). 14. günde, kıkırdak alanı çevresinde trabeküler kemik ve sulandırılmış kemik iliği ile dolu boşluklar oluşturan kemikleşme cepheleri gözlenir (Şekil 5C,D). Son olarak, 21. günde, kıkırdak alanları neredeyse tamamen trabeküler kemik ile değiştirilir, bu da başarılı kemik köprülemeyi (Şekil 5E, F) ve kırık iyileşme çalışmaları için modelin geçerliliğini gösterir.
Şekil 1: Farede intramedüller tel ile sabitlenmiş diyafiz femur kırıkları üretmek için cerrahi prosedürün adımlarını gösteren fotomikrograflar. (A) Ameliyat masasındaki steril cerrahi aletlerin organizasyonu. (B) Anesteziklerin intraperitoneal enjeksiyonu. (C) Farenin lateral dekübit pozisyonunda konumlandırılması ve pençelerin hareketsiz hale getirilmesi. (D) Farenin örtülmesi, sadece ameliyat edilecek alanın açıkta bırakılması. (E) Kutanöz lateral parapatellar insizyon. (F,G) Fasya lata insizyonunun görünümleri. (H) Femoral kondil bölgesini açığa çıkaran patellanın medial luksasyonu. (I) İğnenin interkondiler fossaya yerleştirilmesi. (J) Femoral medüller kanalın delinmesi. (K) İntramedüller telin femoral açıklıktan sokulması. (L) Yanal kondildeki telin bükülmüş ucunun ayarlanması. (M) Çevreleyen kasların künt uçlu ayrılması. (N) Tam kortikal femoral osteotomi. (O) Yumuşak dokuların kapatılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kabul edilebilir kırık paternlerinin temsili radyografileri. (A,B) Transvers diyafiz kırıkları (kırık çizgileri kemiğin eksenine 90° açı yapar). (C) Kısa eğik kırık (kırık çizgisi kemiğin eksenine göre 30°'den azdır). (D) İndirgenebilir parçalı kırık (birkaç küçük kemik parçası görülür, ancak kemiğin anatomik dizilimi kalır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yanlış yerleştirilmiş tellerin temsili radyografileri. (A) Bu farede, tel proksimal femur fragmanının medüller kanalının içinde değildir, bu nedenle kırık kemiğin yanlış sabitlenmesine neden olur. (B) Bu durumda, tel herhangi bir kemik parçasından geçmemiştir ve kırık kemik tamamen hizalanmamıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kırık bölgesinde görünür nasır. Ameliyattan sonraki (A) 14. günde ve (B) 21. günde kırık nasırlarının temsili radyografileri, modelin rejeneratif sürecinin dolaylı (endokondral) yolu izlediğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kırık nasırlarının histolojik analizi. Ameliyattan sonra (A, B) 7. günde, (C, D) 14. günde ve (E, F) 21. günde H & E ile boyanmış kırık kemiklerin temsili görüntüleri. Nasırın evrimine dikkat edin; kallus başlangıçta kırık hattının etrafında geniş hiyalin kıkırdak alanları ile ortaya çıkar (A'da ek, B'de büyütülmüş), bu alanlar daha sonra trabeküler kemik oluşumu için şablon görevi görür (C'de ekleyin, D'de büyütülmüş) ve süreç, kıkırdağın kemikle tamamen değiştirilmesi ve dolayısıyla kemik köprülemesi (E'de ekleyin, F'de büyütülür). Ölçek çubukları: (A,C,D) 500 μm; (B,D,F) 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dünya çapında kırık sayısıarttıkça 9,10,25, kaynamama için yenilikçi tedaviler giderek daha acil hale gelmektedir. Kırık iyileşmesi, uzun bir zaman ölçeğindemeydana gelen olayların karmaşık ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir toplamını içerdiğinden3, geçerli hayvan modellerinin kullanılması, kemik onarımının başarısını belirleyen mekanizmaları anlamamızı ve etkili ilaçları ve terapötik protokolleri seçmeyi çok önemlidir16,17.
Farede, hem femur hem de tibia, uzun kemik kırığı iyileşme çalışmaları için kullanılabilir. Bu modelde tibia yerine femur seçilmiştir çünkü daha büyük çaplı ve daha iyi yumuşak doku kaplamasına sahip düz bir kemiktir. Öte yandan, fare tibiasının diyafizi kavislidir ve kalibresi distal uç boyunca giderek azalır, bu da intramedüller fiksasyon cihazlarınınyerleştirilmesini zorlaştırır 26. Bu nedenle, femurun özellikleri, intramedüller fiksasyonun amaçlandığı modeller için idealdir. Cinsiyetle ilgili olarak, erkeklerin kadınlara kıyasla daha belirgin kıkırdaklı kallus oluşumu ile daha hızlı kırık iyileşmesi gösterdiğine dair kanıtlar olduğundan, erkek fareler kullanılmıştır27. Bununla birlikte, gerekirse, intramedüller telin boyutu, kadın uyluk kemiğinin biraz daha küçük uzunluğuna uyacak şekilde ayarlanarak teknik kadınlara kolayca uyarlanabilir.
Giyotin28 ile üç noktalı bükme mekanizmasını kullanan kapalı kırık modelleriyle karşılaştırıldığında, burada açıklanan açık cerrahi modeli, araştırmacının üretilen kırığı görsel olarak görmesini sağlayan kırık bölgesini ortaya çıkardığı için de avantajlıdır. Bu görselleştirme, aşağıdaki kabul edilemez kırılma modelleriyle sonuçlanan teknik hataların önlenmesine yardımcı olur: kemiğin anatomik olarak yeniden hizalanmasına izin vermeyen ciddi parça yer değiştirmesi (indirgenemeyen kırıklar); kemiğin birkaç küçük parçaya geniş bir şekilde parçalanması (ufalama), onarım sürecini bozabilecek bir durum; ve/veya sabitleme cihazlarının yanlış yerleştirilmesi. Bu modelde kırık hafif osteotomiden kaynaklandığından, genellikle geniş parça yer değiştirmesi ve/veya ufalanması gözlenmez.
Bununla birlikte, teknik, diğer yöntemlerden daha fazla teknik cerrahi beceri ve fare anatomisi bilgisi gerektirmesi bakımından sınırlıdır. Ek olarak, farenin küçük boyutu, sıçanlara veya büyük hayvan modellerine kıyasla manipülasyonu daha zor hale getirir. Bu sınırlamalar eğitimle aşıldığında, kabul edilebilir kırıkların üretimindeki başarı oranı yaklaşık% 100'dür ve çalışmadan hayvan çıkarma sayısını azaltır.
Ayrıca, açık cerrahi kırık modeli, perkütan veya sistemik uygulama kullanılarak uygulanması mümkün olmayan kök/progenitör hücreler, biyomateryaller ve/veya farmasötik ilaçlar gibi terapötik ajanların lokal olarak uygulanmasına izin verir26. Son olarak, intramedüller cihazlarla fiksasyon, plak ve harici cihazlara göre daha kolay, daha ucuz ve daha özelleştirilebilir ve uzun kemik kırıklarının tedavisi için en sık kullanılan klinik stratejiyi taklit eder29. Bu nedenle, burada açıklanan model, hem temel hem de translasyonel ortamlarda kırık iyileşmesini incelemek için düşük maliyetli bir modeli temsil etmektedir, yani bu çalışma sadece kırık iyileşme biyolojisi bilgisinin artmasına değil, aynı zamanda kemik onarımı için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine de katkıda bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çatışan mali çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Rio de Janeiro Eyaleti Araştırma Desteği için Carlos Chagas Filho Vakfı (FAPERJ) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al.
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T.
- Calori, G. M., et al.
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R.
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).
