Summary
Dit protocol beschrijft een chirurgische ingreep voor het vaststellen van een diafysaire fractuur in het dijbeen van muizen, die wordt gestabiliseerd met een intramedullaire draad, voor onderzoeken naar fractuurgenezing.
Abstract
Botten hebben een aanzienlijk regeneratief vermogen. Fractuurgenezing is echter een complex proces en afhankelijk van de ernst van de laesies en de leeftijd en algehele gezondheidstoestand van de patiënt, kunnen storingen optreden, wat leidt tot vertraagde vereniging of non-union. Vanwege het toenemende aantal fracturen als gevolg van hoogenergetisch trauma en veroudering, is de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën om botherstel te verbeteren op basis van de combinatie van skelet-/mesenchymale stam-/stromale cellen en biomimetische biomaterialen dringend nodig. Daartoe is het gebruik van betrouwbare diermodellen van fundamenteel belang voor een beter begrip van de belangrijkste cellulaire en moleculaire mechanismen die de genezingsresultaten bepalen. Van alle modellen is de muis het geprefereerde onderzoeksmodel omdat het een breed scala aan transgene stammen en reagentia biedt voor experimentele analyse. Het vaststellen van fracturen bij muizen kan echter technisch uitdagend zijn vanwege hun kleine formaat. Daarom heeft dit artikel tot doel de procedures te demonstreren voor de chirurgische vaststelling van een diafysaire dijbeenfractuur bij muizen, die wordt gestabiliseerd met een intramedullaire draad en lijkt op het meest voorkomende botherstelproces, door middel van kraakbeenachtige eeltvorming.
Introduction
Het skelet is een vitaal en functioneel veelzijdig orgaan. De botten van het skelet maken lichaamshouding en beweging mogelijk, beschermen de inwendige organen, produceren hormonen die fysiologische reacties integreren en zijn de plaats van hematopoëse en opslag vanmineralen1. Als botten worden gebroken, hebben ze een opmerkelijk vermogen om te regenereren en hun vorm en functie van vóór de verwonding volledig te herstellen. Het genezingsproces begint met de vorming van een hematoom en een ontstekingsreactie, die de activering en condensatie van skeletstam-/voorlopercellen uit het periosteum, endosteum en beenmerg induceert en hun daaropvolgende differentiatie om de zachte kraakbeenachtige callus te vormen. Het overbruggen van de gebroken uiteinden vindt dan plaats door een proces dat lijkt op endochondrale botvorming, waarbij de kraakbeensteiger uitzet en vervolgens mineraliseert, waardoor de harde botachtige callus wordt gevormd. Ten slotte wordt het harde eelt geleidelijk gemodelleerd door osteoclasten en osteoblasten om de oorspronkelijke botstructuur te herstellen 2,3.
Hoewel het genezingsproces van de fractuur redelijk robuust is, omvat het een ingewikkelde optelling van gebeurtenissen en wordt het aanzienlijk beïnvloed door verschillende individuele factoren, waaronder de algemene gezondheidstoestand, leeftijd en geslacht van de patiënt, evenals letselfactoren, zoals de wijze van mechanische stabilisatie van het gebroken bot, het optreden van infectie en de ernst van het omringende letsel aan zacht weefsel4, 5,6. Daarom komen mislukkingen vaak voor, wat leidt tot de ontwikkeling van non-union, wat grote gevolgen heeft voor de revalidatie van de patiënt en de kwaliteit van leven7,8. Door het toenemende aantal fracturen als gevolg van hoogenergetisch trauma en veroudering, evenals de hoge kosten van behandelingen, zijn non-unionfracturen een last geworden voor gezondheidsstelsels wereldwijd 9,10. Deze toenemende belasting benadrukt de dringende behoefte aan innovatieve therapeutische strategieën om botherstel te verbeteren11,12 op basis van de combinatie van skelet-/mesenchymale stam-/stromale cellen en biomimetische biomaterialen13,14.
Bij het nastreven van dit doel zijn diermodellen op grote schaal gebruikt in studies die gericht zijn op het begrijpen van de fundamentele biologie van fractuurgenezingsmechanismen en in proof-of-concept preklinische studies die gericht zijn op het bedenken van nieuwe therapeutische strategieën om botherstel te bevorderen 15,16,17. Modellen van kleine dieren, zoals de muis, zijn uitstekend geschikt voor onderzoek naar de genezing van breuken vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen en reagentia voor experimentele analyses en hun lage onderhoudskosten. Bovendien hebben muizen een snel genezingsverloop, waardoor alle stadia van het herstelproces in de tijd kunnen worden geanalyseerd15. De kleine omvang van het dier kan echter een uitdaging vormen voor de chirurgische productie van fracturen met fixatiemodi die vergelijkbaar zijn met die bij mensen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en goedkoop model van fractuurgenezing bij muizen met behulp van een open femorale osteotomie gestabiliseerd met een intramedullaire draad, die lijkt op het meest voorkomende botherstelproces, door kraakbeenachtige callusvorming, en kan worden gebruikt in zowel basis- als translationeel onderzoek waarbij toegang tot de fractuurplaats vereist is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door het Animal Use and Care Committee van het Centrum voor Gezondheidswetenschappen van de Federale Universiteit van Rio de Janeiro (protocolnummer 101/21). Mannelijke Balb/c-muizen op een leeftijd van 10-12 weken (25-30 g lichaamsgewicht) werden in dit onderzoek gebruikt. De chirurgische ingreep duurt ongeveer 15-20 minuten per muis. Vóór elke ingreep moeten de vereiste instrumenten (vermeld in de materiaaltabel) worden opgesteld over een steriel operatieveld dat de operatietafel bedekt (figuur 1A). De metalen chirurgische instrumenten moeten gedurende 30 minuten worden geautoclaveerd in zelfsluitende enveloppen bij 123 °C. Wegwerpartikelen, zoals naalden en gaasjes, moeten steriel worden aangeschaft.
1. Voorbereiding van dieren
- Verdoof de muis en voer analgesie uit in overeenstemming met het door dierenartsen aanbevolen regime dat is goedgekeurd door het institutionele programma voor dierenverzorging en -gebruik.
OPMERKING: Indien beschikbaar, moet bij voorkeur inhalatie-anesthesie worden uitgevoerd. Een beschrijving van het protocol voor inhalatieanesthesie is te vinden in het rapport van Ewald et al.18. Als de fractuur echter wordt geproduceerd voor osteoimmunologische onderzoeken, moet dit type anesthesie worden vermeden, aangezien er bewijs is dat verschillende vluchtige anesthetica, waaronder isofluraan, de activiteit van zowel aangeboren als adaptieve immuuncellen beïnvloeden19,20. - Zodra de muis onbeweeglijk is, scheert u het linkerbeen en legt u het op de operatietafel op een warm verwarmingskussen (zie Materiaaltabel) bij 37 °C, bedekt met een steriel chirurgisch laken.
- Voer antiseptisch wassen van het incisiegebied uit door over de huid te wrijven met een spons van 10% povidonjodium. De desinfectie moet beginnen langs de incisielijn en zich naar buiten uitstrekken in een cirkelvormig patroon. Droog het gewreven gebied af met steriele gaasjes, was met 70% ethanol en droog opnieuw af met een steriel gaasje. Herhaal deze procedure drie keer.
- Plaats de muis in de rechter laterale decubituspositie en immobiliseer de poten met chirurgische tape (Figuur 1C).
- Drapeer de muis zo dat alleen het incisiegebied zichtbaar is (Figuur 1D).
2. Chirurgische ingreep
- Controleer tijdens de chirurgische ingreep voortdurend of de muis ademt en geef oogdruppels in zijn ogen om uitdroging te voorkomen en te voorkomen dat de muis blind wordt.
OPMERKING: De hele chirurgische ingreep duurt meestal ~ 15-20 minuten wanneer deze wordt uitgevoerd door een getrainde chirurg. Daarom zou het voldoende moeten zijn om de oogdruppels eenmaal aan het begin van de procedure aan te brengen. Als de procedure langer begint te duren, kunnen extra toepassingen worden uitgevoerd wanneer wordt vastgesteld dat de ogen beginnen te drogen. - Voordat u doorgaat met de incisie, evalueert u de anesthesiediepte door in de staart te knijpen om de pijnresponsreflex te controleren en de ademhalingssnelheid visueel te inspecteren (het aantal thoracale bewegingen per minuut te tellen)21. Onder optimale anesthesie mag de muis niet reageren op een staartknijp en moet de ademhalingssnelheid rond de 55-65 ademhalingen/min liggen21.
- Maak een cutane laterale parapatellaire incisie van 1 cm met een scalpelmesje (nummer 11, zie materiaaltabel), beginnend ter hoogte van de tuberositas tibialis en zich uitstrekkend tot het niveau van de patella en vervolgens, over een gelijke afstand, in de richting van het distale dijbeen (figuur 1E).
- Ontleed met een stompe schaar de onderhuidse fascia rond de incisielijn om de fascia lata, de laterale vastus en de femurbicepsspieren bloot te leggen22.
- Maak met het scalpelmesje nummer 11 nog een incisie in de fascia lata, vergelijkbaar met die in de huid, beginnend ter hoogte van de tibiale tuberositas en lopend langs de biceps femoris aponeurose tot het niveau van het distale dijbeen, om het gewrichtskapsel te openen en toegang te krijgen tot het kniegewricht (Figuur 1F, G).
- Voer een mediale luxatie van de patella uit door de punt van een recht gekarteld precisiepincet (zie Materiaaltabel) eronder te plaatsen en deze samen met de patella- en quadricepsligamenten opzij te duwen, waardoor de condylen van het dijbeen bloot komen te liggen (Figuur 1H).
- Houd het dijbeen vast met een pincet met gekartelde punt, buig de knie in een hoek van 90° en perforeer handmatig het intramedullaire kanaal van het dijbeen door de intercondylaire fossa met een injectienaald van 26 G (Figuur 1I, J).
- Houd de knie 90° gebogen en steek een segment van 1.0 cm van een 0.016 inch (0.40 mm) roestvrijstalen staafdraad (Figuur 1K, invoegen) (zie Materiaaltabel) door de opening in het medullaire kanaal van het dijbeen in de richting van de grote trochanter (Figuur 1K).
NOTITIE: Het houden van de knie in een hoek van 90° is cruciaal voor het correct inbrengen van de draad in het medullaire kanaal. Als u dit niet doet, zal dit resulteren in de extravasatie van de draad uit het bot en de omliggende laesies van zacht weefsel. - Pas het voorgebogen distale uiteinde van de draad aan met een pincet met rechte gekartelde punt om het stevig in de laterale condylus te bevestigen (Figuur 1L). Naast het op zijn plaats fixeren van de draad, zal het gebogen uiteinde de postmortale verwijdering van de draad vergemakkelijken.
- Scheid de laterale vastus- en femurbicepsspieren door middel van stompe dissectie met een pincet met gekartelde punt om toegang te krijgen tot de distale diafyse van het dijbeen (Figuur 1M).
- Plaats een ontleedschaar rond de dijbeendiafyse onder een hoek van ongeveer 90° en voer voorzichtig een volledige corticale osteotomie uit (Figuur 1N).
OPMERKING: De dijbenen van muizen kunnen gemakkelijk worden gesneden. Oefen geen overmatige kracht uit tijdens osteotomie om het buigen van de intramedullaire draad en uitgebreide breukvermaling te voorkomen. - Herpositioneer de spieren en de knieschijf door de punt van een recht gekarteld precisiepincet over het condylusgebied te duwen.
- Sluit de spierfascia met een 6-0 resorbeerbare hechtdraad en vervolgens de huid met een 6-0 nylon hechting (zie Tabel met materialen), beide op een eenvoudige onderbroken manier (Figuur 1O).
- Breng de muis over naar een individuele schone kooi voor herstel. Eenmaal wakker, moet de muis vrij kunnen bewegen met onbeperkte gewichtsbelasting.
- Voer in de volgende dagen na de operatie analgesie uit in overeenstemming met het door dierenartsen aanbevolen regime dat is goedgekeurd door het institutionele programma voor dierenverzorging en -gebruik.
3. Röntgenbeeldvorming
- Verdoof de muis zoals beschreven in stap 1.1.
OPMERKING: Als de radiografie direct na de chirurgische ingreep wordt uitgevoerd en de muis nog steeds onder optimale anesthesie is (stap 2.2), is het niet nodig om deze stap uit te voeren. - Voor een schoon zijaanzicht van het gebroken dijbeen, plaatst u de muis in de dorsale decubituspositie en trekt u de geopereerde achterpoot lichtjes opzij.
- Immobiliseer de poten met chirurgische tape.
- Voer radiografische beeldvorming uit volgens het beschikbare apparatuurprotocol.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een digitale tandheelkundige röntgengenerator gebruikt met de volgende parameters: 70 kVp-spanning, 7 mA-stroom en 0,2 s belichtingstijd.
4. Histologieverwerking en H&E-kleuring
- Euthanaseer de muizen met een intraperitoneale overdosis anesthetica (raadpleeg het door dierenartsen aanbevolen regime dat is goedgekeurd door het institutionele programma voor dierenverzorging en -gebruik). Nadat u de diepte van de anesthesie met een staartknijp hebt gecontroleerd, voert u cervicale dislocatie uit. Verzamel vervolgens het gebroken bot, verwijder overtollig omringend spierweefsel23 en fixeer het bot gedurende 3 dagen in 10% gebufferde formaline-oplossing (pH 7,4).
- Plaats de botmonsters in gelabelde histologiecassettes (zie Materiaaltabel) en dompel ze gedurende 14 dagen onder in 10% EDTA in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, voor ontkalking. Ververs de ontkalkingsoplossing twee keer per week.
- Dehydrateer de monsters in een reeks oplossingen met toenemende ethanolconcentraties (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) gedurende elk 1 uur.
- Verwijder de monsters in twee opeenvolgende baden met xyleen gedurende elk 30 minuten.
- Voor wasinfiltratie dompelt u de monsters gedurende 30 minuten onder in twee opeenvolgende paraffinebaden bij 60 °C. Sluit vervolgens de monsters in blokken in voor secties24.
OPMERKING: Om het eelt beter te kunnen zien, plaatst u het bot met zijn lange as in de horizontale positie om longitudinale sneden mogelijk te maken. - Snijd het weefsel met een microtoom in secties van 4 μm dik (zie Tabel met materialen).
- Laat de secties drijven in een waterbad van 56 °C en monteer de secties op histologische objectglaasjes (zie Materiaaltabel).
- Voor H&E-kleuring deparaffiniseert u de objectglaasjes in drie opeenvolgende baden met xyleen gedurende 5 minuten en hydrateert u het weefsel in een reeks oplossingen met afnemende ethanolconcentraties (95%, 80% en 70%) gedurende 5 minuten.
- Spoel de objectglaasjes 30 seconden af in kraanwater, bekleur de objectglaasjes gedurende 6 minuten met Harris hematoxyline (zie Materiaaltabel) en spoel ze nog eens 30 seconden af in kraanwater.
- Dompel de objectglaasjes 30 s onder in 1% zoutzuur in ethanol en vervolgens gedurende 30 s in 70% ethanol.
- Beits gedurende 2 minuten met eosine (zie Materiaaltabel) en was gedurende 30 s met kraanwater.
- Dehydrateer de objectglaasjes met ethanol (70%, 80% en 95% gedurende 5 minuten) en klaring met twee baden xyleen gedurende elk 5 minuten.
- Druppel voor de montage één tot twee druppels montagemedium (zie Materiaaltabel) op elk glaasje en dek het glaasje af met een schoon dekglaasje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De meest eenvoudige en directe manier om het succes van de chirurgische ingreep bij het produceren van de fractuur te evalueren, is röntgenbeeldvorming. Röntgenfoto's kunnen onmiddellijk na de operatie worden uitgevoerd, terwijl de muis nog steeds onder narcose is, en vervolgens 7 dagen, 14 dagen en 21 dagen na de fractuur om de eeltvorming en progressie te evalueren. Aanvaardbare breukpatronen zijn die waarbij de cortex volledig is gescheurd, de draden correct in het medullaire kanaal zijn geplaatst en de breuklijnen transversaal zijn (met een hoek van 90° ten opzichte van de as van het bot), schuin (gebogen of hellend patroon zonder fragmentverplaatsing) of kort schuin (ongeveer 30° ten opzichte van de as van het bot) (Figuur 2A-D). Deze patronen zijn acceptabel omdat ze allemaal zullen herstellen door middel van endochondrale botvorming (d.w.z. met eeltvorming) als de botfragmenten goed zijn uitgelijnd (gereduceerd), waardoor het hoofddoel van het model wordt bereikt. Daarom zijn onaanvaardbare fracturen alleen die met uitgebreide vermaling (meerdere kleine botfragmenten), met verkorting van de ledemaat als gevolg van slechte uitlijning, en met misplaatste draden (Figuur 3). Dieren met onaanvaardbare breukpatronen moeten van het onderzoek worden uitgesloten. Na verloop van tijd moet een robuuste en zichtbare callus worden waargenomen op de plaats van de breuk (Figuur 4).
Bovendien kan 7 dagen, 14 dagen en 21 dagen na de fractuur een histologisch onderzoek worden uitgevoerd om weefselneovorming in het gebroken gebied te beoordelen. Aangezien fixatie met intramedullaire draden een zekere mate van beweging van de botfragmenten mogelijk maakt, volgt het regeneratieve proces het endochondrale mechanisme van ossificatie, waarbij robuuste gebieden van hyalien kraakbeen rond de breuklijn op dag 7 worden gezien (Figuur 5A,B). Op dag 14 worden ossificatiefronten waargenomen rond het kraakbeengebied, waarbij trabeculair bot en holtes gevuld met gereconstitueerd beenmerg worden gevormd (Figuur 5C,D). Ten slotte worden op dag 21 de kraakbeengebieden bijna volledig vervangen door trabeculair bot, wat wijst op een succesvolle benige overbrugging (Figuur 5E,F) en de validiteit van het model voor onderzoeken naar fractuurgenezing.
Figuur 1: Microfoto's die de stappen van de chirurgische ingreep illustreren om diafysaire dijbeenfracturen te produceren die met een intramedullaire draad in de muis zijn bevestigd. (A) Organisatie van de steriele chirurgische instrumenten op de operatietafel. (B) Intraperitoneale injectie van de anesthetica. (C) Positionering van de muis in de laterale decubituspositie en immobilisatie van de poten. (D) Draperen van de muis, waarbij alleen het gebied dat geopereerd zal worden zichtbaar blijft. (E) De cutane laterale parapatellaire incisie. (F,G) Uitzicht op de fascia lata-incisie. (H) Mediale luxatie van de patella, waardoor het gebied van de femurcondylus bloot komt te liggen. (I) Positionering van de naald in de intercondylaire fossa. (J) Perforatie van het femorale medullaire kanaal. (K) Inbrengen van de intramedullaire draad door de femuropening. (L) Afstelling van het gebogen uiteinde van de draad in de laterale condylus. (M) Stompe scheiding van de omringende spieren. (N) Volledige corticale femorale osteotomie. (O) Sluiting van de zachte weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve röntgenfoto's van aanvaardbare breukpatronen. (A,B) Transversale diafysaire fracturen (de breuklijnen staan in een hoek van 90° ten opzichte van de as van het bot). (C) Korte schuine fractuur (de breuklijn is minder dan 30° ten opzichte van de as van het bot). (D) Reduceerbare fragmentarische fractuur (er worden enkele kleine botfragmenten gezien, maar de anatomische uitlijning van het bot blijft). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve röntgenfoto's van verkeerd geplaatste draden. (A) Bij deze muis bevindt de draad zich niet in het medullaire kanaal van het proximale dijbeenfragment, wat resulteert in een onjuiste fixatie van het gebroken bot. (B) In dit geval is de draad niet door een botfragment gegaan en is het gebroken bot volledig niet uitgelijnd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Zichtbaar eelt op de plaats van de breuk. Representatieve röntgenfoto's van fractuureelt op (A) dag 14 en (B) dag 21 na de operatie, waaruit blijkt dat het regeneratieve proces van het model de indirecte (endochondrale) route volgt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histologische analyse van het fractuureelt. Representatieve beelden van gebroken botten op (A,B) dag 7, (C,D) dag 14 en (E,F) dag 21 na de operatie gekleurd met H & E. Let op de evolutie van het eelt; het eelt presenteert zich aanvankelijk met uitgebreide gebieden van hyalien kraakbeen rond de breuklijn (insert in A, vergroot in B), deze gebieden dienen vervolgens als sjablonen voor de vorming van trabeculair bot (insert in C, vergroot in D), en het proces culmineert in de volledige vervanging van het kraakbeen door bot en dus botoverbrugging (insert in E, vergroot in F). Schaalbalken: (A,C,D) 500 μm; (B,D,F) 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naarmate het aantal fracturen wereldwijd toeneemt 9,10,25, worden innovatieve behandelingen voor non-union steeds urgenter. Aangezien fractuurgenezing een complexe en strak georkestreerde opsomming is van gebeurtenissen die zich over een lange tijdschaal voordoen3, is het gebruik van geldige diermodellen van cruciaal belang voor het verbeteren van ons begrip van de mechanismen die het succes van botherstel bepalen en voor het selecteren van effectieve geneesmiddelen en therapeutische protocollen16,17.
Bij de muis kunnen zowel het dijbeen als het scheenbeen worden gebruikt voor genezingsonderzoeken naar lange botbreuken. In dit model werd gekozen voor het dijbeen in plaats van het scheenbeen omdat het een recht bot is met een grotere diameter en een betere dekking van zacht weefsel. Aan de andere kant is de diafyse van het scheenbeen van de muis gebogen en neemt het kaliber geleidelijk af langs het distale uiteinde, wat het inbrengen van intramedullaire fixatieapparaten bemoeilijkt26. Daarom maken de kenmerken van het dijbeen het ideaal voor modellen waarin intramedullaire fixatie wordt beoogd. Wat het geslacht betreft, werden mannelijke muizen gebruikt, omdat er aanwijzingen zijn dat mannetjes een snellere genezing van fracturen vertonen met een prominentere kraakbeenachtige eeltvorming in vergelijking met vrouwtjes27. Indien nodig kan de techniek echter gemakkelijk worden aangepast aan vrouwen door simpelweg de grootte van de intramedullaire draad aan te passen aan de iets kleinere lengte van het vrouwelijke dijbeen.
In vergelijking met gesloten fractuurmodellen die gebruik maken van het driepuntsbuigmechanisme met de guillotine28, is het hier beschreven open chirurgiemodel ook voordelig omdat het de fractuurplaats blootlegt, waardoor de onderzoeker de fractuur visueel kan zien die wordt geproduceerd. Deze visualisatie helpt technische fouten te voorkomen die resulteren in de volgende onaanvaardbare fractuurpatronen: ernstige verplaatsing van fragmenten, waardoor de anatomische herschikking van het bot niet mogelijk is (niet-reduceerbare fracturen); uitgebreide fragmentatie van het bot in verschillende kleine stukjes (vermaling), een aandoening die het herstelproces kan belemmeren; en/of de verkeerde plaatsing van de bevestigingsmiddelen. Aangezien de fractuur in dit model wordt veroorzaakt door een zachte osteotomie, wordt over het algemeen geen uitgebreide fragmentverplaatsing en/of vermaling waargenomen.
De techniek is echter beperkt in die zin dat het meer technische chirurgische vaardigheden en kennis van de anatomie van de muis vereist dan andere methoden. Bovendien maakt het kleine formaat van de muis manipulatie lastiger in vergelijking met ratten of grote diermodellen. Zodra deze beperkingen zijn overwonnen met training, is het slagingspercentage bij het produceren van acceptabele fracturen bijna 100%, waardoor het aantal dierverwijderingen uit het onderzoek wordt verminderd.
Bovendien maakt het fractuurmodel voor open chirurgie de lokale toepassing mogelijk van therapeutische middelen, zoals stam-/voorlopercellen, biomaterialen en/of farmaceutische geneesmiddelen, die niet mogelijk zouden zijn om toe te passen met behulp van percutane of systemische toediening26. Ten slotte is fixatie met intramedullaire apparaten eenvoudiger, goedkoper en meer aanpasbaar dan met plaat- en externe apparaten en bootst het de meest gebruikte klinische strategie na voor de behandeling van lange botbreuken29. Daarom vertegenwoordigt het hier beschreven model een goedkoop model voor het bestuderen van fractuurgenezing, zowel in basis- als translationele omgevingen, wat betekent dat deze studie niet alleen bijdraagt aan een grotere kennis van de biologie van fractuurgenezing, maar ook aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor botherstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support van de staat Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al.
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T.
- Calori, G. M., et al.
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R.
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).
