Summary
Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'instaurazione di una frattura diafisaria nel femore dei topi, che viene stabilizzata con un filo intramidollare, per studi di guarigione delle fratture.
Abstract
Le ossa hanno una notevole capacità rigenerativa. Tuttavia, la guarigione delle fratture è un processo complesso e, a seconda della gravità delle lesioni, dell'età e dello stato di salute generale del paziente, possono verificarsi fallimenti, che portano a un'unione ritardata o alla mancata unione. A causa del crescente numero di fratture derivanti da traumi ad alta energia e dall'invecchiamento, è urgentemente necessario lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative per migliorare la riparazione ossea basate sulla combinazione di cellule staminali scheletriche/mesenchimali/stromali e biomateriali biomimetici. A tal fine, l'uso di modelli animali affidabili è fondamentale per comprendere meglio i principali meccanismi cellulari e molecolari che determinano gli esiti di guarigione. Di tutti i modelli, il topo è il modello di ricerca preferito perché offre un'ampia varietà di ceppi transgenici e reagenti per l'analisi sperimentale. Tuttavia, l'instaurazione di fratture nei topi può essere tecnicamente impegnativa a causa delle loro piccole dimensioni. Pertanto, questo articolo mira a dimostrare le procedure per l'instaurazione chirurgica di una frattura del femore diafisario nei topi, che è stabilizzata con un filo intramidollare e assomiglia al più comune processo di riparazione ossea, attraverso la formazione di callo cartilagineo.
Introduction
Lo scheletro è un organo vitale e funzionalmente versatile. Le ossa dello scheletro consentono la postura e il movimento del corpo, proteggono gli organi interni, producono ormoni che integrano le risposte fisiologiche e sono il sito dell'emopoiesi e dell'accumulo di minerali1. In caso di frattura, le ossa hanno una notevole capacità di rigenerarsi e ripristinare completamente la loro forma e funzione pre-lesione. Il processo di guarigione inizia con la formazione di un ematoma e di una risposta infiammatoria, che induce l'attivazione e la condensazione delle cellule staminali/progenitrici scheletriche dal periostio, dall'endostio e dal midollo osseo e la loro successiva differenziazione per formare il callo cartilagineo molle. Il ponte delle estremità fratturate avviene quindi attraverso un processo che assomiglia alla formazione dell'osso endocondrale, in cui l'impalcatura cartilaginea si espande e poi si mineralizza, formando il callo osseo duro. Infine, il callo duro viene gradualmente rimodellato da osteoclasti e osteoblasti per ripristinare la struttura ossea originale 2,3.
Sebbene il processo di guarigione della frattura sia abbastanza robusto, comporta un'intricata sommatoria di eventi ed è significativamente influenzato da diversi fattori individuali, tra cui lo stato di salute generale, l'età e il sesso del paziente, nonché fattori di lesione, come la modalità di stabilizzazione meccanica dell'osso fratturato, l'insorgenza di infezioni e la gravità della lesione dei tessuti molli circostanti4, 5,6. Pertanto, i fallimenti sono comuni, portando allo sviluppo della non unione, che ha un forte impatto sulla riabilitazione del paziente e sulla qualità della vita 7,8. A causa del crescente numero di fratture a causa di traumi ad alta energia e dell'invecchiamento, nonché degli alti costi dei trattamenti, le fratture non unionali sono diventate un peso per i sistemi sanitari di tutto il mondo 9,10. Questo onere crescente evidenzia l'urgente necessità di strategie terapeutiche innovative per migliorare la riparazione ossea11,12 basate sulla combinazione di cellule staminali scheletriche/mesenchimali/stromali e biomateriali biomimetici13,14.
Nel perseguimento di questo obiettivo, i modelli animali sono stati ampiamente utilizzati in studi volti a comprendere la biologia fondamentale dei meccanismi di guarigione delle fratture e in studi preclinici proof-of-concept volti a ideare nuove strategie terapeutiche per promuovere la riparazione ossea 15,16,17. I modelli di piccoli animali, come il topo, sono eccellenti per gli studi di guarigione delle fratture grazie all'ampia disponibilità di ceppi e reagenti geneticamente modificati per le analisi sperimentali e ai loro bassi costi di manutenzione. Inoltre, i topi hanno un rapido decorso temporale di guarigione, che consente l'analisi temporale di tutte le fasi del processo di riparazione15. Tuttavia, le piccole dimensioni dell'animale possono rappresentare una sfida per la produzione chirurgica di fratture con modalità di fissazione simili a quelle applicate nell'uomo. Questo protocollo descrive un modello semplice e a basso costo di guarigione delle fratture nei topi utilizzando un'osteotomia femorale aperta stabilizzata con un filo intramidollare, che assomiglia al più comune processo di riparazione ossea, attraverso la formazione di callo cartilagineo, e può essere utilizzato sia in indagini di base che traslazionali in cui è richiesto l'accesso al sito di frattura.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per l'Uso e la Cura degli Animali del Centro per le Scienze della Salute dell'Università Federale di Rio de Janeiro (Numero di Protocollo 101/21). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi Balb/c a 10-12 settimane di età (25-30 g di peso corporeo). La procedura chirurgica richiede circa 15-20 minuti per topo. Prima di ogni procedura, gli strumenti necessari (elencati nella Tabella dei materiali) devono essere disposti su un campo chirurgico sterile che copre il tavolo operatorio (Figura 1A). Gli strumenti chirurgici metallici devono essere sterilizzati in autoclave in buste autosigillanti a 123 °C per 30 min. Gli articoli monouso, come aghi e garze, devono essere procurati sterili.
1. Preparazione dell'animale
- Anestetizzare il topo ed eseguire l'analgesia in conformità con il regime raccomandato dal veterinario approvato dal programma istituzionale di cura e utilizzo degli animali.
NOTA: Se disponibile, è preferibile eseguire l'anestesia per inalazione. Una descrizione del protocollo per l'anestesia inalatoria può essere trovata nel rapporto di Ewald et al.18. Tuttavia, se la frattura viene prodotta per studi di osteoimmunologia, questo tipo di anestesia deve essere evitato, poiché l'evidenza mostra che diversi anestetici volatili, tra cui l'isoflurano, influenzano l'attività delle cellule immunitarie sia innate che adattative19,20. - Una volta che il mouse è immobile, radere la gamba sinistra, quindi trasferirla sul tavolo operatorio su un termoforo caldo (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C coperto da un telo chirurgico sterile.
- Eseguire il lavaggio antisettico dell'area dell'incisione strofinando la pelle con una spugna di iodopovidone al 10%. La disinfezione deve iniziare lungo la linea di incisione ed estendersi verso l'esterno in modo circolare. Asciugare l'area strofinata con garze sterili, lavare con etanolo al 70% e asciugare nuovamente con una garza sterile. Ripetere questa procedura tre volte.
- Posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destra e immobilizzare le zampe con del nastro chirurgico (Figura 1C).
- Drappeggiare il topo in modo che sia visibile solo la regione dell'incisione (Figura 1D).
2. Procedura chirurgica
- Durante la procedura chirurgica, controllare costantemente che il topo respiri e fornire colliri negli occhi per evitare la secchezza e impedire che il topo diventi cieco.
NOTA: L'intera procedura chirurgica di solito richiede ~ 15-20 minuti se eseguita da un chirurgo qualificato. Pertanto, l'applicazione del collirio una volta all'inizio della procedura dovrebbe essere sufficiente. Se la procedura inizia a diventare più lunga, è possibile eseguire ulteriori applicazioni ogni volta che viene identificato che gli occhi stanno iniziando a seccarsi. - Prima di procedere all'incisione, valutare la profondità dell'anestetico pizzicando la coda per controllare il riflesso di risposta al dolore e ispezionando visivamente la frequenza respiratoria (contando il numero di movimenti toracici al minuto)21. In anestesia ottimale, il topo non dovrebbe rispondere a un pizzicamento della coda e la frequenza respiratoria deve essere di circa 55-65 respiri/min21.
- Praticare un'incisione pararotulea laterale cutanea di 1 cm con una lama di bisturi (numero 11, vedi tabella dei materiali), iniziando a livello della tuberosità tibiale e estendendosi fino al livello della rotula e poi, per una distanza uguale, verso il femore distale (Figura 1E).
- Con le forbici smussate, sezionare la fascia sottocutanea attorno alla linea di incisione per esporre la fascia lata, il vasto laterale e i muscoli bicipiti femorali22.
- Con la lama del bisturi numero 11, praticare un'altra incisione nella fascia lata simile a quella praticata nella pelle, iniziando a livello della tuberosità tibiale e percorrendo l'aponeurosi del bicipite femorale fino al livello del femore distale, per aprire la capsula articolare e accedere all'articolazione del ginocchio (Figura 1F, G).
- Eseguire una lussazione mediale della rotula posizionando la punta di una pinzetta di precisione a punta seghettata diritta (vedi Tabella dei materiali) sotto di essa e spingendola di lato insieme ai legamenti rotuleo e quadricipite, esponendo così i condili del femore (Figura 1H).
- Tenendo il femore con una pinzetta a punta seghettata, flettere il ginocchio a 90° e perforare manualmente il canale intramidollare del femore attraverso la fossa intercondilare con un ago ipodermico da 26 G (Figura 1I, J).
- Mantenendo il ginocchio flesso a 90°, inserire un segmento di 1,0 cm di un filo di acciaio inossidabile da 0,016 pollici (0,40 mm) (Figura 1K, inserto) (vedere la tabella dei materiali) attraverso l'apertura nel canale midollare del femore verso il grande trocantere (Figura 1K).
NOTA: Mantenere il ginocchio flesso a 90° è fondamentale per il corretto inserimento del filo nel canale midollare. In caso contrario, il filo fuoriesce dall'osso e le lesioni dei tessuti molli circostanti. - Regolare l'estremità distale pre-piegata del filo con una pinzetta a punta seghettata diritta per fissarlo saldamente nel condilo laterale (Figura 1L). Oltre a fissare il filo in posizione, l'estremità piegata faciliterà la rimozione post-mortem del filo.
- Separare i muscoli del vasto laterale e del bicipite femorale attraverso la dissezione dell'estremità smussata con una pinzetta a punta seghettata per accedere alla diafisi distale del femore (Figura 1M).
- Inserire una forbice da dissezione attorno alla diafisi del femore con un angolo di circa 90° ed eseguire delicatamente un'osteotomia corticale completa (Figura 1N).
NOTA: I femori dei topi sono facilmente tagliabili. Astenersi dall'applicare una forza eccessiva durante l'osteotomia per evitare la flessione del filo intramidollare e l'estesa sminuzzatura della frattura. - Riposizionare i muscoli e la rotula spingendo la punta di una pinzetta di precisione dritta e seghettata sopra la regione del condilo.
- Chiudere la fascia muscolare con una sutura riassorbibile 6-0 e poi la pelle utilizzando una sutura di nylon 6-0 (vedi Tabella dei materiali), entrambe in modo semplice interrotto (Figura 1O).
- Trasferisci il mouse in una gabbia pulita individuale per il recupero. Una volta sveglio, il mouse deve essere in grado di muoversi liberamente con un carico illimitato.
- Nei giorni successivi all'intervento, eseguire l'analgesia secondo il regime raccomandato dal veterinario approvato dal programma istituzionale di cura e utilizzo degli animali.
3. Imaging a raggi X
- Anestetizzare il topo come descritto al punto 1.1.
NOTA: Se la radiografia viene eseguita subito dopo la procedura chirurgica e il topo è ancora in anestesia ottimale (passaggio 2.2), non è necessario eseguire questo passaggio. - Per una visione laterale pulita del femore fratturato, posizionare il topo in posizione di decubito dorsale e tirare leggermente di lato l'arto posteriore operato.
- Immobilizzare le zampe con del nastro chirurgico.
- Eseguire l'imaging radiografico secondo il protocollo dell'apparecchiatura disponibile.
NOTA: Per questo studio, è stato utilizzato un generatore di raggi X dentale digitale con i seguenti parametri: tensione di 70 kVp, corrente di 7 mA e tempo di esposizione di 0,2 s.
4. Elaborazione istologica e colorazione H&E
- Eutanasiare i topi con un sovradosaggio intraperitoneale di anestetici (fare riferimento al regime raccomandato dal veterinario approvato dal programma istituzionale per la cura e l'uso degli animali). Dopo aver controllato la profondità dell'anestesia con un pizzico di coda, eseguire la lussazione cervicale. Successivamente, raccogliere l'osso fratturato, rimuovere il tessuto muscolare circostantein eccesso 23 e fissare l'osso in una soluzione di formalina tamponata al 10% (pH 7,4) per 3 giorni.
- Collocare i campioni ossei in cassette istologiche etichettate (vedere la tabella dei materiali) e immergerli in EDTA al 10% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, per 14 giorni per la decalcificazione. Cambiare la soluzione decalcificante due volte a settimana.
- Disidratare i campioni in una serie di soluzioni di concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) per 1 ora ciascuna.
- Pulire i campioni in due bagni sequenziali di xilene per 30 minuti ciascuno.
- Per l'infiltrazione della cera, immergere i campioni in due bagni di paraffina sequenziali a 60 °C per 30 minuti. Successivamente, incorporare i campioni nei blocchi per il sezionamento24.
NOTA: Per visualizzare meglio il callo, incorporare l'osso con il suo asse lungo in posizione orizzontale per consentire i tagli longitudinali. - Tagliare il tessuto in sezioni spesse 4 μm con un microtomo (vedi Tabella dei materiali).
- Far galleggiare le sezioni in un bagnomaria a 56 °C e montare le sezioni su vetrini istologici (vedi Tabella dei materiali).
- Per la colorazione H&E, deparaffinare i vetrini in tre bagni sequenziali di xilene per 5 minuti e reidratare il tessuto in una serie di soluzioni di concentrazioni di etanolo decrescenti (95%, 80% e 70%) per 5 minuti.
- Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto per 30 secondi, colorare i vetrini con ematossilina Harris (vedere la tabella dei materiali) per 6 minuti e sciacquarli in acqua di rubinetto per altri 30 secondi.
- Immergere i vetrini in etanolo all'1% di acido cloridrico per 30 secondi e poi in etanolo al 70% per 30 secondi.
- Colorare con eosina (vedi Tabella dei materiali) per 2 minuti e lavare con acqua di rubinetto per 30 secondi.
- Disidratare i vetrini con etanolo (70%, 80% e 95% per 5 minuti) e chiarificare con due bagni di xilene per 5 minuti ciascuno.
- Per il montaggio, gocciolare una o due gocce di mezzo di montaggio (vedere la Tabella dei materiali) su ciascun vetrino e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti pulito.
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Representative Results
Il modo più semplice e immediato per valutare il successo dell'intervento chirurgico nel produrre la frattura è la radiografia. Le radiografie possono essere eseguite immediatamente dopo l'intervento, con il topo ancora sotto anestesia, e successivamente 7, 14 giorni e 21 giorni dopo la frattura per valutare la formazione e la progressione del callo. I modelli di frattura accettabili sono quelli in cui le cortecce sono completamente rotte, i fili sono posizionati correttamente all'interno del canale midollare e le linee di frattura sono trasversali (con un angolo di 90° rispetto all'asse dell'osso), oblique (curve o inclinate senza spostamento del frammento) o oblique corte (circa 30° rispetto all'asse dell'osso) (Figura 2A-D). Questi modelli sono accettabili perché tutti progrediranno verso la riparazione attraverso la formazione di osso endocondrale (cioè con la formazione di calli) se i frammenti ossei sono correttamente allineati (ridotti), raggiungendo così l'obiettivo principale del modello. Pertanto, le fratture inaccettabili sono solo quelle con sminuzzatura estesa (più piccoli frammenti ossei), con accorciamento dell'arto come conseguenza di un cattivo allineamento e con fili fuori posto (Figura 3). Gli animali con fratture inaccettabili devono essere esclusi dallo studio. Con il tempo, si dovrebbe osservare un callo robusto e visibile nel sito della frattura (Figura 4).
Inoltre, un esame istologico può essere eseguito a 7 giorni, 14 giorni e 21 giorni dopo la frattura per valutare la neoformazione tissutale all'interno dell'area fratturata. Poiché la fissazione con fili intramidollari consente un certo grado di movimento dei frammenti ossei, il processo rigenerativo segue il meccanismo endocondrale di ossificazione, in cui si osservano aree robuste di cartilagine ialina intorno alla linea di frattura il giorno 7 (Figura 5A,B). Il giorno 14, si osservano fronti di ossificazione intorno all'area della cartilagine, formando osso trabecolare e cavità piene di midollo osseo ricostituito (Figura 5C,D). Infine, il giorno 21, le aree cartilaginee sono quasi completamente sostituite dall'osso trabecolare, indicando il successo del ponte osseo (Figura 5E,F) e la validità del modello per gli studi di guarigione delle fratture.
Figura 1: Fotomicrografie che illustrano le fasi della procedura chirurgica per produrre fratture diafisarie del femore fissate con un filo intramidollare nel topo. (A) Organizzazione degli strumenti chirurgici sterili sul tavolo operatorio. (B) Iniezione intraperitoneale degli anestetici. (C) Posizionamento del topo in posizione di decubito laterale e immobilizzazione delle zampe. (D) Drappeggiare il mouse, lasciando esposta solo l'area su cui verrà operata. (E) L'incisione pararotulea laterale cutanea. (F,G) Vedute dell'incisione della fascia lata. (H) Lussazione mediale della rotula, che espone la regione del condilo femorale. (I) Posizionamento dell'ago nella fossa intercondilare. (J) Perforazione del canale midollare femorale. (K) Inserimento del filo intramidollare attraverso l'apertura femorale. (L) Regolazione dell'estremità piegata del filo nel condilo laterale. (M) Separazione dei muscoli circostanti con estremità smussate. (N) Osteotomia femorale corticale completa. (O) Chiusura dei tessuti molli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Radiografie rappresentative di modelli di frattura accettabili. (A,B) Fratture diafisarie trasversali (le linee di frattura sono ad un angolo di 90° rispetto all'asse dell'osso). (C) Breve frattura obliqua (la linea di frattura è inferiore a 30° rispetto all'asse dell'osso). (D) Frattura frammentaria riducibile (si vedono pochi piccoli frammenti di osso, ma rimane l'allineamento anatomico dell'osso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Radiografie rappresentative di fili posizionati in modo errato. (A) In questo topo, il filo non si trova all'interno del canale midollare del frammento prossimale del femore, con conseguente fissazione errata dell'osso fratturato. (B) In questo caso, il filo non è passato attraverso alcun frammento osseo e l'osso fratturato è completamente disallineato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Callo visibile nel sito della frattura. Radiografie rappresentative dei calli di frattura il giorno (A) 14 e (B) il giorno 21 dopo l'intervento chirurgico, che mostrano che il processo rigenerativo del modello segue la via indiretta (endocondrale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi istologica dei calli di frattura. Immagini rappresentative delle ossa fratturate il giorno 7, il giorno 14 e il giorno 21 dopo l'intervento chirurgico colorato con H ed E. Notare l'evoluzione del callo; il callo si presenta inizialmente con estese aree di cartilagine ialina attorno alla linea di frattura (inserto in A, ingrandito in B), queste aree servono poi come modelli per la formazione dell'osso trabecolare (inserto in C, ingrandito in D), e il processo culmina nella completa sostituzione della cartilagine con osso e, quindi, ponte osseo (inserto in E, ingrandito in F). Barre di scala: (A,C,D) 500 μm; (B,D,F) 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Con l'aumento del numero di fratture in tutto il mondo 9,10,25, i trattamenti innovativi per la mancata unione stanno diventando sempre più urgenti. Poiché la guarigione delle fratture comporta una somma complessa e strettamente orchestrata di eventi che si verificano su un lungo arco temporale3, l'uso di modelli animali validi è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi che determinano il successo della riparazione ossea e per selezionare farmaci e protocolli terapeutici efficaci16,17.
Nel topo, sia il femore che la tibia possono essere utilizzati per studi di guarigione delle fratture delle ossa lunghe. In questo modello è stato scelto il femore al posto della tibia perché è un osso dritto con un diametro maggiore e una migliore copertura dei tessuti molli. D'altra parte, la diafisi della tibia del topo è curva e il suo calibro diminuisce progressivamente lungo l'estremità distale, il che complica l'inserimento di dispositivi di fissazione intramidollare26. Pertanto, le caratteristiche del femore lo rendono ideale per i modelli in cui è prevista la fissazione intramidollare. Per quanto riguarda il sesso, sono stati utilizzati topi maschi, poiché ci sono prove che i maschi mostrano una guarigione più rapida delle fratture con una formazione di calli cartilaginei più prominenti rispetto alle femmine27. Tuttavia, se necessario, la tecnica può essere facilmente adattata alle femmine semplicemente regolando la dimensione del filo intramidollare per adattarla alla lunghezza leggermente inferiore del femore femminile.
Rispetto ai modelli di frattura chiusa che utilizzano il meccanismo di flessione a tre punti con la ghigliottina28, il modello di chirurgia a cielo aperto qui descritto è vantaggioso anche perché espone il sito di frattura, il che consente al ricercatore di vedere visivamente la frattura prodotta. Questa visualizzazione aiuta ad evitare errori tecnici che si traducono nei seguenti modelli di frattura inaccettabili: grave spostamento del frammento, che non consente il riallineamento anatomico dell'osso (fratture non riducibili); estesa frammentazione dell'osso in diversi piccoli pezzi (sminuzzatura), una condizione che può compromettere il processo di riparazione; e/o il posizionamento errato dei dispositivi di fissaggio. Poiché in questo modello la frattura è causata da un'osteotomia delicata, in genere non si osserva un esteso spostamento e/o sminuzzamento del frammento.
Tuttavia, la tecnica è limitata nel senso che richiede maggiori competenze tecniche chirurgiche e conoscenza dell'anatomia del topo rispetto ad altri metodi. Inoltre, le piccole dimensioni del topo rendono la manipolazione più complicata rispetto ai ratti o ai modelli animali di grandi dimensioni. Una volta superate queste limitazioni con l'addestramento, il tasso di successo nella produzione di fratture accettabili è quasi del 100%, riducendo il numero di rimozioni di animali dallo studio.
Inoltre, il modello di frattura chirurgica aperta consente l'applicazione locale di agenti terapeutici, come cellule staminali/progenitrici, biomateriali e/o farmaci, che non sarebbe possibile applicare utilizzando la somministrazione percutanea o sistemica26. Infine, la fissazione con dispositivi intramidollari è più semplice, più economica e più personalizzabile rispetto a quella con placca e dispositivi esterni e imita la strategia clinica più comunemente utilizzata per il trattamento delle fratture delle ossa lunghe29. Pertanto, il modello qui descritto rappresenta un modello a basso costo per lo studio della guarigione delle fratture, sia in contesti di base che traslazionali, il che significa che questo studio contribuisce non solo ad aumentare la conoscenza della biologia della guarigione delle fratture, ma anche allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la riparazione ossea.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari contrastanti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il sostegno alla ricerca dello Stato di Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
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