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Biology

सिंगल-सेल मल्टीओमिक्स के लिए फ्लैश-जमे हुए यकृत ऊतक से नाभिक का अलगाव

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64792
Automatic Translation
1,4, 1, 2,3, 1,4
1Helmholtz Pioneer Campus (HPC), Helmholtz Munich, 2Institute of Computational Biology, Computational Health Department, Helmholtz Munich, 3Division of Infectious Diseases and Tropical Medicine, Ludwig-Maximillian-Universität Klinikum, 4TUM School of Medicine, Technical University of Munich

Summary

यहां, हम एकल-नाभिक आरएनए-सेक, एटीएसी-सेक और संयुक्त मल्टीओमिक्स (आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) के लिए फ्लैश-जमे हुए, संग्रहीत यकृत ऊतकों से नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

यकृत एक जटिल और विषम ऊतक है जो कई महत्वपूर्ण शारीरिक कार्यों को पूरा करने के लिए जिम्मेदार है, जैसे कि ऊर्जा होमियोस्टेसिस का रखरखाव और ज़ेनोबायोटिक्स का चयापचय, दूसरों के बीच। ये कार्य यकृत पैरेन्काइमल और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं के बीच तंग समन्वय के माध्यम से किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न चयापचय गतिविधियां यकृत लोब्यूल के विशिष्ट क्षेत्रों तक ही सीमित हैं- एक घटना जिसे यकृत ज़ोनेशन कहा जाता है। एकल-कोशिका अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने शोधकर्ताओं को एकल-कोशिका संकल्प पर ऊतक विषमता की जांच करने के लिए सशक्त बनाया है। यकृत सहित कई जटिल ऊतकों में, कठोर एंजाइमैटिक और / या यांत्रिक पृथक्करण प्रोटोकॉल स्वास्थ्य और बीमारी में इस अंग को व्यापक रूप से चिह्नित करने के लिए आवश्यक एकल-कोशिका निलंबन की व्यवहार्यता या गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं।

यह पेपर जमे हुए, संग्रहीत यकृत ऊतकों से नाभिक को अलग करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह विधि उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक उत्पन्न करती है जो डाउनस्ट्रीम, एकल-कोशिका ओमिक्स दृष्टिकोणों के साथ संगत होती है, जिसमें एकल-नाभिक आरएनए-सेक, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख, साथ ही मल्टीमॉडल ओमिक्स (संयुक्त आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) शामिल हैं। इस विधि का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त मानव, माउस और गैर-मानव प्राइमेट जमे हुए यकृत नमूनों से नाभिक के अलगाव के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यह दृष्टिकोण यकृत में सभी प्रमुख सेल प्रकारों के निष्पक्ष अलगाव की अनुमति देता है और इसलिए, एकल-कोशिका संकल्प पर यकृत का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत पद्धति प्रदान करता है।

Introduction

एकल-कोशिका जीनोमिक्स तेजी से यकृत समारोह का अध्ययन करने और स्वास्थ्य औररोग की स्थिति में सेलुलर विषमता के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक आवश्यक पद्धति बन रहा है। सूचना की विभिन्न परतों के एक साथ माप और मजबूत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों के समानांतर विस्तार के लिए "मल्टीओमिक्स" का तेजी से विकास सामान्य और रोगग्रस्त यकृत2 में पहले से अज्ञात सेल प्रकारों और उपप्रकारों की खोज के लिए मार्ग प्रशस्त कर रहा है।

बायोबैंक और संग्रहीत जमे हुए नमूनों की खोज की संभावना ने गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं 3,4,5 की भूमिका को फिर से देखने और खोजने और उम्र बढ़ने के दौरान और पुरानी बीमारियों में पॉलीप्लोइड हेपेटोसाइट्स की भूमिका की जांच करने के अवसरों में काफी वृद्धि की है। . इसलिए, यह पेपर फ्लैश-फ्रोजन (एफएफ) संग्रहीत लिवर के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकल-नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो डाउनस्ट्रीम सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए अनुक्रमण और एटीएसी अनुक्रमण के साथ-साथ मल्टीमॉडल ओमिक्स (संयुक्त आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) के साथ संगत है (चित्रा 1)।

यह वर्कफ़्लो एंजाइमेटिक पृथक्करण प्रोटोकॉल में सेल के आकार या नाजुकता से स्वतंत्र, यकृत में सभी सेल प्रकारों के ट्रांसस्क्रिप्टम और क्रोमैटिन पहुंच की जांच की अनुमति देता है। यह कीमती मानव नमूनों या ट्रांसजेनिक चूहों से छोटे ऊतक वर्गों (15-30 मिलीग्राम या 5-10 मिमी3) के साथ किया जा सकता है। नाभिक अलगाव की उच्च शुद्धता का निर्धारण करने में परमाणु आकार की मात्रा और माप शामिल है, जो बढ़े हुए सेल आकार और सेनेसेंस10,11 के साथ सहसंबंधित हो सकता है, और यह शुद्धता हेपेटोसाइट प्लोइडी 12 और सेल आकार-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र 11,13,14,15 दोनों के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक है। . इसके अतिरिक्त, जमे हुए यकृत से अलग नाभिक यकृत ज़ोनेशन के बारे में मूल्यवान जानकारी बनाए रखते हैं। वर्कफ़्लो और ऊतक संग्रह एकल-कोशिका जीनोमिक्स डेटा या आगे पूरक विश्लेषण, जैसे कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या एक ही ऊतक और एक ही व्यक्ति से स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के सत्यापन की अनुमति देते हैं। इसलिए, इस दृष्टिकोण को कई यकृत रोग स्थितियों पर लागू किया जा सकता है और जीवों को व्यवस्थित और मज़बूती से मॉडल किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोग जर्मन पशु कल्याण कानून और ऊपरी बवेरिया सरकार के नियमों के अनुपालन में किए गए थे। पशु आवास को जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के §11 के अनुसार अनुमोदित किया गया था और निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. ऊतक तैयारी

  1. सर्वाइकल डिस्लोकेशन द्वारा 3 महीने से 22 महीने के पुरुष C57BL/6J माउस की बलि दें। जानवर को विच्छेदन बोर्ड पर रखें, छोरों को पिन के साथ सुरक्षित करें, और पेट को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
  2. ट्रेउटिंग एट अल.16 द्वारा अनुशंसित नेक्रोपसी करें।
    1. पेट को रिबकेज तक खोलें, यकृत की कल्पना करें, और लोब्यूल्स को छेदे बिना यकृत को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए बल का उपयोग करें।
    2. डायाफ्राम को बल के साथ पकड़कर और कैंची के साथ कनेक्टिंग ऊतक को हटाकर बरकरार यकृत निकालें।
  3. अंग को ठंडे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में धोएं, इसे एक साफ पेपर तौलिया पर सूखा दें, और विभिन्न उद्देश्यों के लिए यकृत लोब्यूल्स को कई टुकड़ों में काट लें: एकल-नाभिक अलगाव और मल्टीओमिक्स के लिए एफएफ; पैराफिन एम्बेडिंग के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड (10% पीएफए); और / या आगे के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 1 ए) के लिए इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में एम्बेडेड।
  4. लिवर के टुकड़ों को क्रायोवियल्स या 5 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूबों में मिलाएं, और तरल नाइट्रोजन में तुरंत फ्लैश-फ्रीज करें। डाउनस्ट्रीम सिंगल-न्यूक्लियस मल्टीओमिक्स प्रयोगों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए यकृत के नमूने स्टोर करें (चित्रा 1 बी, सी)।
    नोट: क्रायोप्रिजर्व्ड ऊतक को कई वर्षों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग से पहले हमेशा -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ पर ले जाया जाना चाहिए।

2. नाभिक अलगाव

  1. बेंचटॉप सफाई और बफर और उपभोग्य सामग्रियों की तैयारी
    1. 70% इथेनॉल और आरएनएस परिशोधन समाधान के साथ काम करने वाले बेंचटॉप और पिपेट को साफ करें, या समर्पित आरएनएस-मुक्त बेंचटॉप और सामग्री का उपयोग करें।
    2. स्विंगिंग बाल्टी और फिक्स्ड-एंगल सेंट्रीफ्यूज, 1.5 एमएल / 2 एमएल ट्यूब, और मल्टी-वेल प्लेट्स दोनों को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकिल करें, जैसा कि नीचे बताया गया है।
    3. ऊतक हैंडलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनएस-मुक्त, एकल-उपयोग वाले चिमटी, एक डिस्पोजेबल बाँझ स्केलपेल, और सूखी बर्फ (-60 डिग्री सेल्सियस) पर एक पेट्री डिश।
    4. बर्फ पर डोंस ग्लास होमोजेनाइज़र और पेस्टल (4 डिग्री सेल्सियस) से पहले। बर्फ और संभावित आरएनएस संदूषण के सीधे संपर्क से बचने के लिए प्रत्येक मूसल (ए और बी) को 5 एमएल ट्यूब में रखें।
    5. आयोडिक्सानोल माध्यम (आईडीएम) (तालिका 1 ए) का एक डिल्यूएंट समाधान तैयार करें, और इसका उपयोग 60% आयोडिक्सानोल स्टॉक घनत्व ढाल माध्यम (तालिका 1 बी और तालिका 1 सी, क्रमशः) के 50% और 29% कमजोर पड़ने के लिए करें।
    6. सभी ट्यूबों को प्रीकिल करें। संसाधित होने वाले प्रत्येक नमूने के लिए, निम्नलिखित ट्यूब तैयार करें:
      1. तीन 1.5 एमएल कम-डीएनए बाइंडिंग ट्यूब तैयार करें (एक फ़िल्टर किए गए ऊतक होमोजेनेट के लिए, दूसरा जिसमें आयोडिक्सानोल समाधान के 50% कमजोर पड़ने का 250 μL होता है, और तीसरा स्वच्छ नाभिक निलंबन के लिए होता है)।
      2. घनत्व प्रवणता पृथक्करण के लिए आयोडिक्सानोल घोल के 29% कमजोर पड़ने के 500 μL युक्त एक 2 mL गोल-तल ट्यूब तैयार करें।
      3. नाभिक अलगाव माध्यम -2 (एनआईएम -2) और होमोजेनाइजेशन बफर (एचबी) के लिए एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें।
    7. नाभिक अलगाव माध्यम -1 (एनआईएम -1) (तालिका 1 डी) तैयार करें, और इसका उपयोग एनआईएम -2 (तालिका 1 ई) और बाद में, एचबी (तालिका 1 एफ) बनाने के लिए करें। उपयोग से ठीक पहले दोनों आरएनएस इनहिबिटर जोड़ें, जैसा कि प्रोटोकॉल में नीचे वर्णित है।
    8. तालिका 1 जी में वर्णित नाभिक भंडारण बफर (एनएसबी) तैयार करें। उपयोग से ठीक पहले पुनः संयोजक आरएनएस अवरोधक जोड़ें। एफएसीएस सॉर्टिंग (वैकल्पिक) के लिए उपयोग करने से पहले एनएसबी में प्रोटीन-आधारित आरएनएस अवरोधक जोड़ें।
    9. होमोजिनाइज़र की इष्टतम सफाई और रखरखाव के लिए ऊतक होमोजेनाइज़ेशन के बाद डौंस होमोजेनाइज़र और पेस्टल्स को भिगोने के लिए बाँझ पानी के साथ 500 एमएल बीकर तैयार करें।
  2. ऊतक समरूपीकरण
    1. सूखी बर्फ पर पेट्री डिश के अंदर एक प्रीचाइल्ड स्केलपेल के साथ20-30 मिलीग्राम (या 5 मिमी 3) ऊतक टुकड़ा काटें। फिर, तुरंत पेट्री डिश को गीली बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें। 1 एमएल एचबी जोड़ें, और ठंडे स्केलपेल का उपयोग करके, ऊतक को जितना संभव हो उतना कीमा करें ताकि इसे 1 एमएल चौड़े छिद्र युक्ति के साथ आसानी से एस्पिरेटेड किया जा सके।
      ध्यान दें: हमेशा सभी ऊतक / नाभिक हस्तांतरण के लिए व्यापक छिद्र युक्तियों का उपयोग करें। एक विकल्प के रूप में, 1 एमएल युक्तियों को व्यापक छिद्र उत्पन्न करने के लिए बाँझ प्लास्टिक कवर पर बाँझ स्केलपेल के साथ काटा जा सकता है (चित्रा 2 ए)।
    2. ऊतक निलंबन एकत्र करें, और इसे एक प्रीचाइल्ड 2 एमएल ग्लास डौंस होमोजेनाइज़र (चित्रा 2 बी) में स्थानांतरित करें।
    3. पेट्री डिश को अतिरिक्त 0.5-1 एमएल एचबी के साथ धोएं, और बर्फ पर सब कुछ रखते हुए सभी शेष ऊतक के टुकड़े इकट्ठा करें।
    4. धीरे-धीरे और सावधानी से बर्फ पर ढीले मूसल ए के साथ पांच स्ट्रोक करें। मूसल को ऊपर और नीचे खींचते समय उसकी घुमावदार गतियों का उपयोग करके बुलबुले बनाने से बचें। सुनिश्चित करें कि मूसल प्रत्येक स्ट्रोक के साथ होमोजेनाइज़र के ऊपर से नीचे तक सावधानीपूर्वक चलता है।
    5. इसके बाद, बर्फ पर तंग मूसल बी के साथ 10-15 धीमे स्ट्रोक करें। बुलबुले पैदा करने से बचें।
      नोट: मूसल बी के साथ 10 स्ट्रोक के बाद माइक्रोस्कोप के तहत नाभिक का नेत्रहीन निरीक्षण करने की सिफारिश की जाती है ताकि यह पता लगाया जा सके कि अधिक स्ट्रोक की आवश्यकता है या नहीं। ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग (नमूने के लिए ट्रिपैन का 1: 1 अनुपात) और एक मैनुअल हेमोसाइटोमीटर (उदाहरण के लिए, 10 μL ट्राइपैन ब्लू को 10 μL नाभिक निलंबन के साथ मिलाएं, और माइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा के लिए मिश्रण के 10 μL का उपयोग करें; चित्र 2 सी)।
    6. होमोजेनेट को 50 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें, जबकि इसे एक प्रीचाइल्ड 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। संयोजी ऊतक झुरमुट की उच्च मात्रा वाले होमोजेनेट्स के लिए एक से अधिक फ़िल्टर और / या ट्यूब का उपयोग करें।
    7. सभी ऊतक होमोजेनेट को अच्छी तरह से इकट्ठा करने के लिए अतिरिक्त 0.5-1 एमएल एचबी के साथ उपयोग किए जाने वाले होमोजेनाइज़र और फिल्टर को कुल्ला करें। घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन पर आगे बढ़ें।
  3. घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन
    1. फ़िल्टर किए गए होमोजेनेट को 1,000 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए एक पूर्व-कोण, निश्चित-कोण सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. जब नमूना घूम रहा हो, तो एक 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें जिसमें 50% आयोडिक्सानोल कमजोर पड़ने का 250 μL और 29% आयोडिक्सानोल कमजोर पड़ने का 500 μL युक्त एक 2 एमएल ट्यूब हो। दोनों ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    3. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, वैक्यूम पंप का उपयोग करके गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें।
      नोट: मैनुअल पिपेटिंग का उपयोग अंतिम नाभिक निलंबन की गुणवत्ता से समझौता करेगा।
    4. 1 एमएल चौड़े छिद्र पिपेट टिप का उपयोग करके गोली में 250 μL HB जोड़ें, और बहुत धीरे-धीरे पुन: निलंबित करें।
    5. नाभिक निलंबन के 250 μL को एक पूर्व-1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 50% आयोडिक्सानोल कमजोर पड़ने का 250 μL होता है, और 25% आयोडिक्सानोल / नाभिक निलंबन उत्पन्न करने के लिए धीरे-धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. नाभिक निलंबन के 500 μL को एक प्रीचाइलेड 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 29% आयोडिक्सानोल कमजोर पड़ने का 500 μL होता है।
      नाभिक निलंबन के 500 μL को 29% आयोडिक्सानोल घोल के 500 μL के शीर्ष पर धीरे से जमा किया जाना चाहिए ताकि 25% / 29% आयोडिक्सानोल मिश्रण स्पष्ट चरण पृथक्करण दिखाएं। इस ढाल इंटरफ़ेस को बनाने के लिए 45 ° कोण पर स्थित पिपेट टिप के साथ ट्यूब की दीवार के किनारे का उपयोग करें। तब से, ट्यूब को धीरे से संभाला जाना चाहिए ताकि इस ढाल को परेशान न किया जा सके।
    7. ट्यूब को 20 मिनट के लिए 12,500 ग्राम पर एक घुमावदार बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज करें, जिसमें ब्रेक बंद हो जाता है।
    8. सेंट्रीफ्यूजेशन चरण पूरा होने से ठीक पहले, एससीआरएनए-सेक पाइपलाइनों पर आगे बढ़ते समय एनएसबी बफर में आरएनएस इनहिबिटर जोड़ें ( तालिका 1 जी देखें)।
    9. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, वैक्यूम पंप का उपयोग करके गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें।
      नोट: मैनुअल पिपेटिंग का उपयोग अंतिम नाभिक निलंबन की गुणवत्ता से समझौता करेगा।
    10. 1 एमएल चौड़े छिद्र पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे से एनएसबी के 100-300 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और नाभिक निलंबन को एक साफ, प्रीकिल्ड 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन (नमूने के लिए ट्रिपैन का 1: 1 अनुपात) और एक मैनुअल हेमोसाइटोमीटर (उदाहरण के लिए, 10 μL ट्राइपैन ब्लू को नाभिक निलंबन के 10 μL के साथ मिलाएं, और गिनती के लिए मिश्रण के 10 μL का उपयोग करें; चित्र 2 डी)।
    12. एकल-नाभिक जीनोमिक्स परख के लिए तुरंत प्राप्त नाभिक निलंबन का उपयोग करें।
      नोट: एनएसबी में नाभिक निलंबन को प्रवाह और / या इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित किया जा सकता है, लेकिन एसएनआरएनए-सेक या एसएनटीएसी-सेक के लिए नहीं।

3. हेपेटोसाइट प्लोइडी प्रोफाइलिंग या अच्छी तरह से आधारित अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए नाभिक छंटाई

  1. फ्लो साइटोमेट्री-आधारित सेल सॉर्टिंग के लिए, नाभिक निलंबन को 50 μm फ़िल्टर के माध्यम से एक प्रीकिल्ड 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब में फ़िल्टर करें।
  2. 100 μm नोजल के साथ सुसज्जित फ्लो साइटोमेट्री सॉर्टर का उपयोग करें। सॉर्टर पर FACS ट्यूब लोड करें, और नमूने का पूर्वावलोकन करें।
  3. नाभिक छंटाई के लिए गेटिंग रणनीति सेट करें, जो आगे के स्कैटर क्षेत्र बनाम साइड स्कैटर क्षेत्र (एफएससी-ए / एसएससी-ए) को प्लॉट करके एक स्कैटर गेट से शुरू होता है, इसके बाद होचस्ट-हाइट बनाम होचस्ट-एरिया (नाभिक गेट), और फिर होचस्ट-चौड़ाई बनाम होचस्ट-एरिया (सिंगल्स गेट) होता है। होचस्ट-एरिया हिस्टोग्राम पर नाभिक प्लोइडी प्रोफाइल की कल्पना करें।
    नोट: बेहतर पीक रिज़ॉल्यूशन के लिए, रैखिक पैमाने (चित्रा 3 ए) पर होचस्ट चैनल (450/50) की कल्पना करें।
  4. 96-/384-वेल प्लेटों में सॉर्ट करने के लिए, ड्रॉपलेट देरी सेट करें, और बेंजिडाइन सब्सट्रेट-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (टीएमबी-एचआरपी) के साथ कलरिमेट्रिक विधि का उपयोग करके प्लेट संरेखण को अनुकूलित करें, जैसा कि पहले वर्णितहै।
  5. नमूना शीतलन और प्लेट धारक दोनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करने के लिए सेट करें, नमूना रोटेशन 300 आरपीएम पर चालू हो।
  6. एकल नाभिक को ~ 1 x 105 नाभिक / एमएल की नमूना एकाग्रता पर और 200-500 घटनाओं / सेकंड पर प्रवाह दर के साथ क्रमबद्ध करें।

4. इमेजिंग साइटोमेट्री (वैकल्पिक) द्वारा परमाणु मापदंडों का दृश्य निरीक्षण और परिमाणीकरण

  1. 2 × 10 7 नाभिक / एमएल की एकाग्रता पर नाभिक निलंबन के 50 μL युक्त0.5 एमएल ट्यूब लोड करें।
  2. नाभिक प्लोइडी प्रोफाइल (चित्रा 3 बी) की कल्पना करने के लिए पहलू अनुपात बनाम होचस्ट फ्लोरेसेंस चैनल के आधार पर एक सभी घटनाओं का गेट सेट करें।
  3. ब्राइटफील्ड (बीएफ) और होचस्ट फ्लोरेसेंस चैनल का उपयोग करके 40x आवर्धन पर नमूना प्राप्त करें।
  4. इमेजिंग साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर (चित्रा 3 सी) के साथ ब्राइटफील्ड माप और होचस्ट फ्लोरेसेंस तीव्रता का उपयोग करके 2 एन और 4 एन नाभिक का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करें।

5. सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए-सेक, एटीएसी-सेक, या मल्टीम लाइब्रेरी निर्माण और अनुक्रमण

  1. ड्रॉपलेट-आधारित एसएनआरएनए-सेक दृष्टिकोण के लिए, शुद्ध नाभिक निलंबन को स्वचालित समानांतर विभाजन और आणविक बारकोडिंग17 के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में सीधे लोड करें।
  2. एकल-कोशिका विभाजन उपकरण में माइक्रोफ्लुइडिक रन पूरा होने के बाद, निर्माता केदिशानिर्देशों 17 में पहले वर्णित के रूप में जेल बीड-एनकैप्सुलेटेड नाभिक एकत्र करें, इनक्यूबेट करें और साफ करें।
  3. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके सीडीएनए प्रीएम्प्लिफिकेशन के लिए 11 पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) चक्र करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, (98 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, 63 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट) x 11, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो। निर्माता17 द्वारा इंगित एक अंतिम मरम्मत और ए-टेलिंग चरण और एडाप्टर लिगेशन के साथ जारी रखें। बाद के अंतिम जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय निर्माण के लिए, निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके 10 पीसीआर चक्र करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 45 एस, (98 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस, 54 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस) x 10, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  4. प्राप्त पुस्तकालयों को ~ 20,000-50,000 माध्य पठन प्रति नाभिक की पढ़ने की गहराई तक अनुक्रमित करें।
  5. संयुक्त मल्टीओमिक्स (आरएनए + एटीएसी) बूंद-आधारित अनुक्रमण के लिए, यकृत नाभिक को 5 मिनट के लिए लाइसिस बफर में इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें 1 घंटे के लिए टैग करें, जैसा कि पहले18 वर्णित है।
  6. स्वचालित समानांतर विभाजन और आणविक बारकोडिंग के लिए टैग किए गए नाभिक को सीधे माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में लोड करें।
  7. माइक्रोफ्लुइडिक रन पूरा होने के बाद, निर्माता18 द्वारा वर्णित जेल बीड-एनकैप्सुलेटेड नाभिक एकत्र करें, इनक्यूबेट करें और साफ करें।
  8. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके सीडीएनए प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण के लिए छह पीसीआर चक्र करें: 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 98 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, (98 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड, 63 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट) x 6, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  9. पूर्व प्रवर्धित नमूने का 35 μL लें, और निम्नानुसार एक cDNA प्रवर्धन करें: 98 °C पर 3 मिनट, (98 °C पर 15 s, 63 °C पर 20 s, 72 °C पर 1 मिनट) x 6, 72 °C पर 1 मिनट, और 4 °C पर पकड़ें। निर्माता18 द्वारा इंगित अंत मरम्मत और ए-टेलिंग चरण और एडाप्टर लिगेशन के साथ जारी रखें। बाद के अंतिम नमूना अनुक्रमण पीसीआर के लिए, 15 पीसीआर चक्र निम्नानुसार करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 45 एस, (98 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस, 54 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस) x 15, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  10. एटीएसी पुस्तकालयों के निर्माण के लिए, निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके नमूना अनुक्रमण के लिए छह पीसीआर चक्रों के लिए 40 μL का उपयोग करें, और निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके नमूना अनुक्रमण के लिए छह PCR चक्रों को बढ़ाएं: 98 °C पर 45 s, (98 °C पर 20 s, 67 °C पर 30 s, 72 °C पर 20 s) x 6, 72 °C पर 1 मिनट, और 4 °C पर पकड़।
  11. प्राप्त मल्टीम जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालयों को प्रति नाभिक 20,000 पठन जोड़े की न्यूनतम पठन गहराई तक अनुक्रमित करें और मल्टीम एटीएसी पुस्तकालयों को प्रति सेल 25,000 रीड जोड़े की न्यूनतम पठन गहराई तक अनुक्रमित करें, जैसा कि निर्माता18 द्वारा अनुशंसित है।

Representative Results

जमे हुए यकृत नमूनों से एकल-नाभिक अलगाव के लिए यह वर्कफ़्लो एकल-नाभिक मल्टीओमिक्स के लिए तैयार किया गया है और तीन मुख्य चरणों पर निर्भर करता है, जिन्हें संक्षेप में प्रस्तुत किया जा सकता है i) सेलुलर विषमता और ऊतक वास्तुकला के समानांतर विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह, ii) एकल-नाभिक निलंबन, और iii) एकल-नाभिक मल्टीओमिक्स (चित्रा 1) ). निकाले गए यकृत को इच्छामृत्यु वाले चूहों से विच्छेदित किया जाता है और पैराफिन-एम्बेडिंग, क्रायोसेक्शनिंग या दोनों के लिए हिस्टोलॉजिकल निरीक्षण के लिए टुकड़ों में काट दिया जाता है। अन्य कटे हुए टुकड़े तुरंत डाउनस्ट्रीम के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए होते हैं, मल्टीओमिक्स विश्लेषण के लिए एकल-नाभिक अलगाव। ऊतक संग्रह की यह प्रणाली उपयोगकर्ता को एक ही व्यक्ति से ऊतक वर्गों पर एकल-नाभिक ओमिक्स डेटा को और मान्य करने की अनुमति देती है, जिससे यदि आवश्यक हो तो स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण के साथ डेटा सेट को पूरक किया जाता है।

यहां वर्णित विधि के साथ जमे हुए यकृत से निकाले गए नाभिक की सूक्ष्म परीक्षा से पता चलता है कि घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन चरण अवांछित सेलुलर और ऊतक मलबे को हटाने की सुविधा प्रदान करता है (चित्रा 2 सी, डी)। इसके अलावा, यह पद्धति प्लोइडी के सभी स्तरों को संरक्षित करती है, जिसे साइटोमेट्रिक विश्लेषण (चित्रा 3) द्वारा मान्य और परिमाणित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन को और मान्य करने के लिए, हमने मिश्रित और एफएसीएस-क्रमबद्ध नाभिक पर ड्रॉपलेट-आधारित एसएनआरएनए-सेक का आयोजन किया और सेरेट पाइपलाइन के बाद डेटा का विश्लेषण किया। संक्षेप में, निकाले गए एकल नाभिक को बूंद-आधारित एसएनआरएनए-सेक के लिए तैयार किया गया था जैसा कि पहले19 वर्णित है। 2 एन और 4 एन नाभिक या प्लोइडी के उच्च स्तर के एसएनआरएनए-सेक के लिए, सीडीएनए प्रवर्धन चरण के लिए 11 चक्रों और अंतिम जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय निर्माण के लिए 10 चक्रों का उपयोग किया गया था। परिणामी पुस्तकालयों को ~ 25,000-39,000 औसत रीडिंग प्रति नाभिक की पढ़ने की गहराई तक अनुक्रमित किया गया था। प्राप्त एकल नाभिक रीड को जीआरसीएम 39 / मिमी 39 माउस जीनोम में मैप किया गया था। प्रीप्रोसेसिंग पाइपलाइन चलाते समय, नाभिक में मौजूद अनस्प्लिस्ड मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के समावेश और परिमाणीकरण का पता लगाने के लिए कमांड - शामिल-इंट्रॉन जोड़ा गया था। संरेखक के भीतर शामिल खाली बूंदों एल्गोरिथ्म को फ़िल्टर किया गया और खाली बूंदों को हटा दिया गया।

आर पैकेज सेरेट (संस्करण 4.1.1) का उपयोग एसएनआरएनए-सेक विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा आउटपुट किए गए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई) गणना मैट्रिक्स का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) मैट्रिक्स की गणना करने के लिए किया गया था। 100 से कम विशेषताओं (जीन) और 10 से कम कोशिकाओं वाली गणनाओं को हटा दिया गया था। नाभिक को पहचाने गए क्यूसी थ्रेसहोल्ड के अनुसार फ़िल्टर किया गया था: जीन की न्यूनतम संख्या = 200 और जीन की अधिकतम संख्या = 8,000, माइटोकॉन्ड्रियल अंश <1% और राइबोसोमल अंश <2%)। शीर्ष 3,000 अत्यधिक परिवर्तनीय जीन (एचवीजी) का उपयोग प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के लिए किया गया था, जैसा कि सेरेट में लागू किया गया था। पीसीए विश्लेषण के परिणामस्वरूप शीर्ष 15 पीसी आयामों को इनपुट करने के बाद ग्राफ-आधारित क्लस्टरिंग की गई थी। कोशिकाओं को क्लस्टर करने के लिए, हमने मॉड्यूलरिटी ऑप्टिमाइज़ेशन तकनीक (लौवेन एल्गोरिदम) को 0.5 पर सेट रिज़ॉल्यूशन पैरामीटर के साथ लागू किया। इस डेटासेट की कल्पना और पता लगाने के लिए, हमने गैर-रैखिक आयामी कमी, अर्थात् यूनिफ़ॉर्म मैनिफोल्ड सन्निकटन और प्रक्षेपण (यूएमएपी) चलाया। मार्कर जीन 6,20,21 के पूर्व ज्ञान के आधार पर प्रत्येक क्लस्टर की पहचान सौंपी गई थी।

चित्रा 4 ए नाभिक निष्कर्षण की इस विधि का उपयोग करके प्राप्त डेटा से उच्च गुणवत्ता वाले मैट्रिक्स दिखाता है। यूएमएपी सभी नाभिकों और प्रमुख सेल प्रकारों में गणनाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें आत्मविश्वास से केवल परमाणु प्रतिलेख और अपेक्षाकृत उथले अनुक्रमण (~ 25,000-40,000 औसत पठन प्रति सेल) के साथ पहचाना जा सकता है (चित्रा 4 बी)। यह दृष्टिकोण यकृत-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों जैसे Hnf4a, Mlxipl, और Ppara, साथ ही ज़ेनोबायोटिक्स (यानी, Cyp2e1 और Cyp2f2) के चयापचय में शामिल डाउनस्ट्रीम लक्ष्य जीन की जांच की अनुमति देता है (चित्रा 4 सी)। ध्यान दें, निकाले गए नाभिक ने यकृत ज़ोनेशन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी को बनाए रखा, जैसा कि पेरिसेंट्रल Cyp2e1 और पेरीपोर्टल Cyp2f2 (चित्रा 4 सी) जैसे हॉलमार्क जीन के पूरक पैटर्न द्वारा दिखाया गया है।

हमने आगे एक ही एकल नाभिक18 में एपिजेनोमिक लैंडस्केप (एटीएसी) और जीन अभिव्यक्ति (आरएनए) की एक साथ प्रोफाइलिंग के लिए नए मल्टीओमिक्स परख के साथ इस विधि का उपयोग करके निकाले गए मिश्रित नाभिक की संगतता का आकलन किया। हमने ट्रांसपोज़ेशन से पहले 5 मिनट तक समय इनक्यूबेशन नाभिक लाइसिस को अनुकूलित किया। अनुक्रमण पुस्तकालयों का निर्माण सीडीएनए प्रीएम्प्लीफिकेशन के लिए छह पीसीआर चक्र चलाकर किया गया था। पूर्व प्रवर्धित नमूने से, जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय के निर्माण के लिए नमूना अनुक्रमण के लिए 35 μL लिया गया और आगे 15 पीसीआर चक्रों द्वारा प्रवर्धित किया गया। सीडीएनए ट्रेस का एक प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम चित्रा 5 ए (शीर्ष) में दिखाया गया है। एटीएसी पुस्तकालयों के निर्माण के लिए, पूर्व प्रवर्धित नमूने के 40 μL का उपयोग किया गया था और नमूना अनुक्रमण के लिए अतिरिक्त छह पीसीआर चक्रों के लिए चलाया गया था, जिसमें डीएनए ट्रेस का प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम चित्र 5 ए (नीचे) में दिखाया गया था। परिणामी जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय (आरएनए) को प्रति नाभिक 44,600 रीड की गहराई तक अनुक्रमित किया गया था और एटीएसी लाइब्रेरी को प्रति नाभिक 43,500 रीड की गहराई तक अनुक्रमित किया गया था (चित्रा 5 बी)।

उपरोक्त वर्णित, एकल-साधन, बूंद-आधारित अनुक्रमण प्रोटोकॉल के समान, रीडिंग मैपिंग, संरेखण, खाली ड्रॉप हटाने और टुकड़े की गिनती मानक दिशानिर्देशों का पालन करते हुए की गई थी, जैसा कि पहले वर्णित है, जीआरसीएम 39 / मिमी 39 संदर्भ जीनोम18 का उपयोग करके। सेरेट और सिग्नैक पैकेज22 का उपयोग करते हुए, हमने दोनों तौर-तरीकों (आरएनए + एटीएसी) (चित्रा 5 सी) के कई मापों के लिए "भारित निकटतम पड़ोसी" (डब्ल्यूएनएन) विश्लेषण किया, जिसने हमें सेल आकार या परमाणु नाजुकता (चित्रा 5 डी) के कारण प्रमुख पूर्वाग्रहों के बिना प्रमुख और मामूली यकृत सेल प्रकारों की पहचान और एनोटेट करने की अनुमति दी। सतीजा प्रयोगशाला22,23 द्वारा प्रकाशित पाइपलाइन में मानक क्यूसी चरण-प्रीप्रोसेसिंग और आयामी कमी शामिल है- जो स्वतंत्र रूप से दोनों परखों पर किया गया है। आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक तौर-तरीकों के भारित संयोजन का एक अच्छा प्रतिनिधित्व करने के लिए, डब्ल्यूएनएन ग्राफ को प्लॉट किया गया था और पहले से पहचाने गए मार्कर जीन 6,20,21 के आधार पर यूएमएपी विज़ुअलाइज़ेशन, क्लस्टरिंग और एनोटेशन के लिए उपयोग किया गया था। एकल साधन का उपयोग करके परख के समान, हमने अपस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों (एचएनएफ 4 ए, पीपीआरए, एमएलसीआईपीएल) और यकृत ज़ोनेशन (हैम्प, Cyp2e1, और Cyp2f2) के हॉलमार्क जीन का भी पता लगाया (चित्रा 5 ई)।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक अवलोकन, वर्कफ़्लो और एकल-कोशिका जीनोमिक अनुप्रयोग। (ए) हिस्टोलॉजी के लिए ऊतक नमूनाकरण का चित्रण (बाएं, पैराफिन एम्बेडिंग और / या क्रायोसेक्शनिंग के लिए तीन वर्गों का चयन किया जाता है), एकल-सेल जीनोमिक्स (मध्य) के लिए फ्लैश-जमे हुए ऊतक संग्रह, और प्रतिनिधि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (दाएं); स्केल बार = 100 μm. (B) उच्च गुणवत्ता वाले एकल-नाभिक निलंबन के लिए महत्वपूर्ण कदम। (सी) नाभिक निलंबन को 10x क्रोमियम चिप पर लोड किया जा सकता है या एफएसीएस सॉर्टिंग और प्लेट-आधारित दृष्टिकोण के लिए उपयोग किया जा सकता है। संक्षिप्तीकरण: एच एंड ई = हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: यकृत विच्छेदन और डौंस-ग्लास ऊतक समरूपीकरण। (ए) 3 महीने के C57BL6/J माउस से प्रतिनिधि मुराइन यकृत (बाएं); एकल-नाभिक अलगाव के लिए उपयोग किया जाने वाला यकृत अनुभाग (मध्य) और स्केलपेल (दाएं) के साथ ऊतक को मिलाने के बाद। स्केल सलाखों = 1 सेमी (बी) "ढीले" मूसल ए (बाएं) के साथ स्ट्रोक से पहले और "तंग" मूसल बी (दाएं) के बाद 2 एमएल डौंस-ग्लास होमोजेनाइजेशन की चित्रात्मक छवियां। ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले हेमोसाइटोमीटर (सी) और ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद (डी) का उपयोग करके ऊतक होमोजेनाइजेशन की निगरानी करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: उच्च-थ्रूपुट नाभिक लक्षण वर्णन के लिए फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग और इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री। (ए) एकल-नाभिक एफएसीएस सॉर्टिंग के लिए गेटिंग रणनीति प्लोइडी के विभिन्न स्तरों की पूछताछ के लिए एक प्लेट में। मलबे को बाहर करने के लिए सेट किए गए साइड स्कैटर क्षेत्र बनाम फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र के आधार पर स्कैटर गेट; होचस्ट-हाइट बनाम होचस्ट-एरिया पर आधारित नाभिक गेट जिसमें कई नाभिक आबादी शामिल हैं; डबल भेदभाव के लिए होचस्ट-चौड़ाई बनाम होचस्ट-ए सेट पर आधारित सिंगल्स गेट; होचस्ट-ए हिस्टोग्राम नाभिक प्लोइडी प्रोफाइल के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। (बी) सभी घटनाओं (बाएं) और एकल (दाएं) घटनाओं का प्रतिनिधि इमेजिंग साइटोमेट्री परिमाणीकरण, द्विगुणित और टेट्राप्लोइड नाभिक दिखाते हुए। (सी) 2 एन और 4 एन नाभिक की ब्राइटफील्ड और होचस्ट छवियां और इमेजिंग साइटोमेट्री का उपयोग करके उनकी मात्रा का ठहराव। संक्षेप: एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एफएससी-ए = आगे बिखराव क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर क्षेत्र; होचस्ट-एच = होचस्ट-ऊंचाई; होचस्ट-ए = होचस्ट-एरिया; होचस्ट-डब्ल्यू = होचस्ट-चौड़ाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए) वायलिन प्लॉट जीन की संख्या, गिनती, माइटोकॉन्ड्रियल जीन के प्रतिशत और राइबोसोमल जीन के प्रतिशत का पता लगाते हैं। (बी) यूएमएपी एसएनआरएनए-सेक (बाएं) का उपयोग करके पता लगाए गए सेल प्रकारों का प्रदर्शन करता है, जिसमें नाभिक (दाएं) के प्रतिशत में व्यक्त मात्रा का परिमाणीकरण होता है। (सी) यूएमएपी गिनती की संख्या को दर्शाता है और हेपेटोसाइट-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति का संकेत देता है। सभी नाभिक (शीर्ष पंक्ति), 2 एन नाभिक (मध्य पंक्ति), और 4 एन नाभिक (नीचे की पंक्ति)। संक्षिप्तरूप: एसएनआरएनए-सेक = एकल-नाभिक आरएनए-सेक; यूएमएपी = यूनिफ़ॉर्म मैनिफोल्ड सन्निकटन और प्रक्षेपण; माइटोक। = माइटोकॉन्ड्रियल जीन; रिबोस। = राइबोसोमल जीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जमे हुए, संग्रहीत युवा यकृत से मल्टीओमिक्स (संयुक्त आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) का गुणवत्ता नियंत्रण और विश्लेषण। (ए) सीडीएनए संश्लेषण और एटीएसी के बाद आणविक भार उत्पाद दिखाने वाली मल्टीओमिक पाइपलाइन के बाद प्राप्त प्रतिनिधि स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेटिक निशान। (बी) वायलिन प्लॉट एटीएसी-सेक, आरएनए-सेक, माइटोकॉन्ड्रियल जीन का प्रतिशत और फ़िल्टरिंग से पहले और बाद में राइबोसोमल जीन के प्रतिशत के लिए गणना की संख्या का प्रदर्शन करता है। (सी) यूएमएपी आरएनए-सेक (बाएं), एटीएसी-सेक (मध्य), और संयुक्त तौर-तरीकों-आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक (दाएं) से जीन अभिव्यक्ति को दर्शाता है। (डी) संकेतित हेपेटोसाइट-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के साथ, विभिन्न सेल प्रकारों को अलग-अलग रंगों में एनोटेट किया जाता है। (ई) फीचर प्लॉट इंगित सेल प्रकारों में संकेतित जीन की क्लस्टर-विशिष्ट अभिव्यक्ति को दर्शाता है। संक्षेप: एटीएसी-सेक = उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख; मध्य हेप = मध्य-क्षेत्रीय हेपेटोसाइट्स; एंडो = एंडोथेलियल कोशिकाएं; पीवी हेप = पेरिपोर्टल हेपेटोसाइट्स; गैर-जेड हेप = गैर-ज़ोनेटेड हेपेटोसाइट्स; सीवी हेप = पेरीसेंट्रल हेपेटोसाइट्स; कुप और डीसी = कुफर और डेंड्राइटिक कोशिकाएं; एससी = स्टेलेट कोशिकाएं, न्यू = न्यूट्रोफिल; चोल = कोलेंजियोसाइट्स; माइटोक। = माइटोकॉन्ड्रियल जीन; रिबोस। = राइबोसोमल जीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) भंडार 10 mL 15 mL 50 mL
(ए) आयोडिक्सानोल मीडियम (आईडीएम)
250 mM सुक्रोज 1M 12.5 एमएल
150 mM KCl 2M 3.75 एमएल
30 mM MgCl2 1M 1.5 एमएल
60 mM Tris बफर pH 8.0 1M 3 mL
अल्ट्राप्योर आरएनएस मुक्त पानी 29.25 एमएल
(बी) 50% आईडीएम
आयोडिक्सानोल 60% 12.5 एमएल
IDM 2.5 mL
(C) 29% IDM
आयोडिक्सानोल 60% 7.25 एमएल
IDM 7.75 एमएल
(डी) नाभिक अलगाव माध्यम -1 (एनआईएम -1)
250 mM सुक्रोज 1M 12.5 एमएल
25 mM KCl 2M 0.625 एमएल
5 mM MgCl2 1M 0.25 एमएल
10 mM Tris बफर pH 8.0 1M 0.5 mL
अल्ट्राप्योर आरएनएस मुक्त पानी 36.125 एमएल
(ई) नाभिक अलगाव माध्यम -2 (एनआईएम -2)
एनआईएम -1 बफर 9.99 mL
Dithiotheritol (DTT) 1 mM 0.01 एमएल
प्रोटीज इनहिबिटर टैबलेट (ईडीटीए मुक्त) 1 1 टैबलेट
(च) होमोजेनाइजेशन बफर (एचबी)
एनआईएम -2 बफर 9.697 एमएल
पुनः संयोजक RNase अवरोधक 40 U/μL 0.1 एमएल
प्रोटीन आधारित आरएनएस इनहिबिटर (SUPERase•IN) 20 U/μL 0.1 एमएल
0.1% ट्राइटन-एक्स 10% 0.1 एमएल
3 μg/mL Hoechst 33342 10 मिलीग्राम / 0.003 एमएल
(छ) नाभिक भंडारण बफर (एनएसबी)
166.5 mM सुक्रोज 1M 1.665 एमएल
5 mM MgCl2 1M 0.05 mL
10 mM Tris pH 8.0 1M 0.1 एमएल
पुनः संयोजक RNase अवरोधक 40 U/μL 0.1 एमएल
प्रोटीन आधारित RNase इनहिबिटर (SUPERase•IN) * 20 U/μL 0.1 एमएल
अल्ट्राप्योर आरएनएस मुक्त पानी 8.085 एमएल
* वैकल्पिक (केवल FACS सॉर्टिंग के लिए)

तालिका 1: समाधान व्यंजनों। (ए) आयोडिक्सानोल माध्यम (आईडीएम) की तैयारी; (बी) आयोडिक्सानोल घोल का 50% कमजोर पड़ना; (सी) आयोडिक्सानोल घोल का 29% कमजोर पड़ना। (डी) नाभिक अलगाव माध्यम -1 (एनआईएम -1) की तैयारी। (ई) नाभिक अलगाव माध्यम -2 (एनआईएम -2) की तैयारी। (च) होमोजेनाइजेशन बफर (एचबी) की तैयारी। (छ) नाभिक भंडारण बफर (एनएसबी) तैयार करना।

Discussion

एकल-कोशिका या एकल-नाभिक आरएनए-सेक द्वारा यकृत की सेलुलर संरचना का विच्छेदन यकृत रोग के विकास और प्रगति 3,4,5,24 की गहरी समझ प्रदान करता है। यकृत से एकल-कोशिका अलगाव समय लेने वाला है और इसके लिए प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जिसमें कठोर यांत्रिक या एंजाइमेटिक पृथक्करण25,26,27 शामिल होते हैं। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि प्रत्येक ऊतक को इष्टतम ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए एक व्यवस्थित मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, साथ ही नाजुक सेल प्रकार या नाभिक28 को पकड़ने के लिए एक उपयुक्त भंडारण विधि भी होती है। ऊतक उपलब्धता, रुचि की बीमारी, विकास चरण, या मॉडल जीव के आधार पर, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए एकल-नाभिक निलंबन की तैयारी एकल-कोशिका निलंबन का उपयोग करने की तुलना में अधिक उपयुक्त पद्धति हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, यकृत में, एससीआरएनए-सेक और एसएनआरएनए-सेक ने परमाणु और साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए के बीच एक उच्च सहसंबंध दिखाया है, यह सुझाव देते हुए कि दोनों दृष्टिकोण पूरक जानकारी 2,3,4,6,29 प्रस्तुत करते हैं।

यह पेपर मनुष्यों और मकाक सहित चूहों और अन्य प्रजातियों से जमे हुए, संग्रहीत यकृत नमूनों से एक मानकीकृत, मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकल-नाभिक अलगाव प्रदान करता है। इस विधि का उपयोग चाउ और उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) के साथ खिलाए गए जंगली प्रकार के चूहों के लिए और अच्छी तरह से प्लेट-आधारित और बूंद-आधारित एकल-नाभिक जीनोमिक दृष्टिकोण दोनों का उपयोग करके यकृत फाइब्रोसिस के माउस मॉडलके लिए किया जा सकता है। यह विधि कृष्णास्वामी एट अल.30 द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों के लिए मूल रूप से वर्णित प्रोटोकॉल पर निर्भर करती है, जिसमें फ्लैश-जमे हुए यकृत के अनुरूप अतिरिक्त संशोधन होते हैं। इष्टतम समरूपीकरण परमाणु झिल्ली अखंडता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना ऊतक से अधिकांश नाभिक को मुक्त करता है। हालांकि, ओवरडॉंसिंग नाजुक नाभिक को नुकसान पहुंचा सकती है और उनकी समग्र गुणवत्ता को कम कर सकती है। युवा और / या फैटी लीवर को आमतौर पर मूसल ए के साथ केवल 5 स्ट्रोक और पेस्टल बी के साथ 10 स्ट्रोक की आवश्यकता होती है, जबकि पुराने और / या फाइब्रोटिक लिवर को मूसल बी के साथ 15 स्ट्रोक की आवश्यकता हो सकती है, लेकिन अधिक नहीं। इसलिए, यहां बताई गई संख्याओं से परे अधिक स्ट्रोक करने की सिफारिश नहीं की जाती है। ओवरडॉंसिंग एकल-नाभिक निलंबन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है और परिवेश आरएनए की मात्रा में वृद्धि कर सकती है। इसके बाद, इससे डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण के दौरान अतिरिक्त कम्प्यूटेशनल फ़िल्टरिंग चरणों को करने की आवश्यकता हो सकती है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बहुमुखी है और युवा (3 महीने) और पुराने (24 महीने) चूहों में विभिन्न यकृत स्थितियों में समायोजित किया जा सकता है। चूंकि हमने पाया कि जिगर का एक बड़ा हिस्सा पुराने, एचएफडी और फाइब्रोटिक ऊतकों के लिए आवश्यक है, प्रसंस्करण के लिए उपलब्ध ऊतक का आकार कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए जैविक सामग्री शुरू करने की छोटी मात्रा के साथ एक सीमा पैदा कर सकता है। हालांकि, बूंद-आधारित जीनोमिक परख के साथ तत्काल नमूना प्रसंस्करण के लिए ढाल शुद्धिकरण की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यदि नाभिक को अच्छी तरह से आधारित परख के लिए 96-/384-वेल प्लेटों में एफएसीएस क्रमबद्ध करने की आवश्यकता होती है, तो ढाल शुद्धिकरण को छोड़ा जा सकता है। हम उपयोगकर्ताओं को अभी भी ढाल शुद्धिकरण करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं यदि एफएसीएस सॉर्टिंग के लिए अनुशंसित नाभिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त ऊतक नमूना है (यानी, ~ 1 × 105 नाभिक / एमएल)।

यकृत को हेपेटोसाइट्स9 की पॉलीप्लोइड प्रकृति की विशेषता है, लेकिन सामान्य शरीर विज्ञान और बीमारी में हेपेटोसाइट प्लोइडी की भूमिका अभी तक स्पष्ट नहीं है। सबूतों का एक बढ़ता हुआ शरीर है जो दर्शाता है कि प्लोइडी जीनोमिक परिवर्तनशीलता प्रदान करता है31, और यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि32,33 वर्ष की आयु के साथ प्लोइडी बढ़ जाती है। मोनोन्यूक्लिएटेड टेट्राप्लोइड हेपेटोसाइट्स का संवर्धन, हालांकि, मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) 34 में खराब रोग का निदान के साथ चिकित्सकीय रूप से जुड़ा हुआ है। इसी तरह, हेपेटोसाइट प्लोइडी के स्तर में परिवर्तन उम्र बढ़ने से संबंधित पुरानी यकृत रोगों जैसे गैर-मादक फैटी लिवर रोग (एनएएफएलडी) 35,36,37 से जुड़ा हुआ है। प्लोइडी जीनोम की दो से अधिक प्रतियां रखने की स्थिति है, जिसे होचस्ट38 जैसे डीएनए डाई के साथ जीनोम सामग्री को धुंधला करके पता लगाया जा सकता है। होचस्ट डाई, जिसे निष्कर्षण से पहले एचबी में जोड़ा जाता है, अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान सभी नाभिकों को लेबल करता है। यह एक प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण पर यूवी (350 एनएम) या वायलेट (450 एनएम) लेजर द्वारा उत्तेजित होने पर उनकी डीएनए सामग्री के आधार पर द्विगुणित और पॉलीप्लोइड नाभिक के बीच अंतर करने की अनुमति देता है। प्रदर्शित गेटिंग रणनीति के साथ, ऊतक समारोह1 (चित्रा 3 ए) में सेलुलर विषमता की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए जमे हुए, संग्रहीत यकृत में हेपेटोसाइट प्लोइडी के 2 एन, 4 एन, 8 एन और उच्च स्तर की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, आकार और मात्रा सहित परमाणु आकृति विज्ञान को इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है ताकि नाभिक के आकार में परिवर्तन को गुणित स्तर (चित्रा 3 बी, सी) के आधार पर गणना की कुल संख्या या जीन की संख्या में परिवर्तन के साथ सहसंबंधित किया जा सके।

मल्टीमॉडल ओमिक्स माप एक साथ जीनोमिक संगठन की कई परतों की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। संयुक्त आरएनए + एटीएसी मल्टीओमिक्स दृष्टिकोण अपस्ट्रीम नियामकों और डाउनस्ट्रीम चयापचय जीन की जांच की अनुमति देता है, जो ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर यकृत समारोह से जुड़े क्रोमैटिन आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इसके अलावा, कम्प्यूटेशनल विधियों में प्रगति के साथ जो डेटा स्पर्श और अनुक्रमण लागत में कमी के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं, एकल-सेल मल्टीओमिक्स एक ही सेल से कई तौर-तरीकों के मूल्यांकन का नेतृत्व कर रहा है। यह एकल-नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन डेटा सेट के व्यक्तिगत और संयुक्त मूल्यांकन के साथ संगत है। हमने डेटा की गुणवत्ता को चित्रित करने के लिए स्टुअर्ट एट अल .23 (सिग्नैक पैकेज) द्वारा स्थापित मानक पाइपलाइनों का उपयोग किया है, जबकि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण 23,39,40,41 के लिए कई उपलब्ध और वैकल्पिक कम्प्यूटेशनल विधियों को आसानी से अपनाया जा सकता है।

कुल मिलाकर, एकल-नाभिक मल्टीओमिक्स यहां प्रस्तुत नाभिक-निष्कर्षण प्रोटोकॉल को लागू करके बहुत कम मात्रा में प्रारंभिक नमूना सामग्री का उपयोग करके जैव-संग्रहीत, एफएफ माउस, मानव और गैर-मानव प्राइमेट यकृत ऊतकों की जांच की अनुमति देता है। यह अमूल्य उपकरण यकृत जीवविज्ञानियों को विभिन्न यकृत विकृति के संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन पहुंच दोनों से पूछताछ करने के लिए सशक्त करेगा। इसके अतिरिक्त, हेपेटोसाइट प्लोइडी के विभिन्न स्तर और यकृत लोब्यूल में उनके स्थान पर निर्भर जीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप समायोजन यकृत विकृति में उनकी भूमिका को प्रकट कर सकता है। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि सेलुलर विषमता की जांच एचसीसी और एनएएफएलडी जैसी बीमारियों के खिलाफ सटीक चिकित्सा और लक्षित हस्तक्षेप के विकास के लिए नए अवसर प्रदान करेगी।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को हेल्महोल्ट्ज़ पायनियर कैंपस (एमएस, केवाई, सीपीएम-जे) और इंस्टीट्यूट ऑफ कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी (सीटी-एल) द्वारा समर्थित किया गया था। इस शोध को अनुदान संख्या जेपी 20जेएम0610035 (सी.पी.एम.-जे.) के तहत एएमईडी द्वारा भी समर्थित किया गया था। हम एचएमजीयू (आई डे ला रोजा) और जैव सूचना विज्ञान (टी वाल्ज़थोनी) समर्थन में कोर जीनोमिक्स को धन्यवाद देते हैं, विशेष रूप से जेवियर पास्टर को प्रशिक्षण और मार्गदर्शन के लिए। हम एचएमजीयू पैथोलॉजी और ऊतक विश्लेषणात्मक कोर सुविधा के ए. फ्यूचिंगर, यू. बुचोल्ज़, जे. बुश और अन्य सभी स्टाफ सदस्यों को उनके तकनीकी और वैज्ञानिक समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं, साथ ही, जे ज़ोर्न, आर एर्डेलन, डी वुर्जिंगर, ई-स्ट्रेफेन के स्टाफ सदस्यों के साथ-साथ प्रयोगशाला पशु सेवा कोर सुविधा को उनके चल रहे वैज्ञानिक समर्थन और चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ट्रांसलैटम (आर मिश्रा) और ल्यूमिनेक्स, ए डायसोरिन कंपनी (पी रेन) में कोर फैसिलिटी सेल विश्लेषण के आभारी हैं। हम अपने तकनीकी समर्थन के लिए डॉ आई डेलिगियानिस को धन्यवाद देते हैं। हार्टमैन, डॉ ए श्रोडर और सुश्री ए बार्डेन (हेल्महोल्ट्ज़ पायनियर कैंपस) अपने कानूनी, प्रबंधकीय और प्रशासनिक समर्थन के लिए मौलिक थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Tween 20 - 5 mL Bio-Rad 1662404
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA
Adhesive PCR film Thermo Fisher Scientific AB0558
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196
Cell Sorter For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428000619 Use chilled at 4 °C
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X Genomics 1000127
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions 10X Genomics 1000269
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions 10X Genomics 1000285
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 11873580001
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution Sigma Aldrich 646563 Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration.
DNA AWAY Surface Decontaminant Thermo Fisher Scientific 10223471 Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 16628742
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 16638742
Elution Buffer (EB) - 250 mL Qiagen 19086
Eppendorf ThermoMixer C Thermo Fisher Scientific 13527550
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock Thermo Fisher Scientific 13518470
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL  Thermo Fisher Scientific 10517694
Filters 50 µm, sterile   SYSMEX PARTEC - CELLTRICS 04-004-2327 Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L Ricca Chemical Company 3290-32
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white Bio-Rad HSP3905
Herenz Heinz ABS Forceps Thermo Fisher Scientific 1131884
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Invitrogen H3570 Light-sensitive
Imaging Flow Cytometer For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream
Invitrogen TE Buffer - 100 mL Thermo Fisher Scientific 11568846
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL Thermo Fisher Scientific AM9640G
MgCl2 (1 M), 100 mL Thermo Fisher Scientific AM9530G
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips Thermo Fisher Scientific 10209104
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips Thermo Fisher Scientific 10733087
Mörser 2 mL DOUNCE Wagner & Munz GmbH 9651632 RNase zap and rinse with MillQ before use
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 Benchmark Scientific C1012 Or any other strip and tube mini centrifuge
Neubauer Hemocytometer OMNILAB  LABORZENTRUM 5435293 Visualize and count nuclei under microscope
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Thermo Fisher Scientific AM9937
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma Aldrich D1556
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O Mettler Toledo 30389218
Pistill "A" 2 mL Wagner & Munz GmbH  9651621 RNase zap and rinse with MillQ before use
Pistill "B" 2 mL Wagner & Munz GmbH 9651627 RNase zap and rinse with MillQ before use
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube Thermo Fisher Scientific 10579691
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm Thermo Fisher Scientific 10634141
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes Thermo Fisher Scientific 10100151
Protector RNase inhibitor - 2,000 U Sigma Aldrich 3335399001 Keep in -20 °C until use
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) Thermo Fisher Scientific AM2696 Keep in -20 °C until use
Recombinant RNase Inhibitor Clontech Takara 2313B Keep in -20 °C until use
RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL Thermo Fisher Scientific AM12450
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780 Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
SPRIselect - 60 mL Beckman Coulter B23318 Aliquot and store in 4 °C
Sucrose, 500 g Sigma Aldrich S0389-500G Make a 1 M stock solution
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels Thermo Fisher Scientific 11798343
Tris-HCI (1M), pH 8.0 Invitrogen 15568025
Triton X-100, 98%, 100 mL Thermo Fisher Scientific 10671652 Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light.
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 11538886
Vortex- Mixer VWR 444-1372 Or any other type of vortex

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References

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जीव विज्ञान अंक 190
सिंगल-सेल मल्टीओमिक्स के लिए फ्लैश-जमे हुए यकृत ऊतक से नाभिक का अलगाव
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Strzelecki, M., Yin, K.,… More

Strzelecki, M., Yin, K., Talavera-López, C., Martinez-Jimenez, C. P. Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics. J. Vis. Exp. (190), e64792, doi:10.3791/64792 (2022).

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