Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פיתוח מודל פגיעה בשרוול מסובב דמוי ארנב כרוני לחקר פיברוזיס וניוון שומן שרירי

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64828
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Institute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 3Center for Neuromusculoskeletal Restorative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Orthopaedics and Traumatology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Summary

מחקר זה מפרט נהלים לביסוס פגיעה כרונית בשרוול מסובב ארנב (RC). באופן ספציפי, הפציעה נוצרת ביחידה תת-סקפולארית (SSC) של גיד-שריר/מיוטנדי כדי לחקות אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי, כולל ניוון שומן שרירי חמור (FD). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לחקור פציעות RC ולהעריך טיפולים רגנרטיביים.

Abstract

פתופיזיולוגיה של השרוול המסובב ארנב (RC) יכולה להוביל לשינויים מתקדמים וניווניים מאוד בשרירים ובגידים הקשורים אליו, אשר משפיעים לרעה על פרמטרים רלוונטיים מבחינה קלינית, כגון כוח ונסיגה של יחידת שריר-גיד/מיוטנדי, מה שבסופו של דבר גורם לאובדן תפקוד הכתף ומשפיע לרעה על תוצאות תיקון RC. מודלים של בעלי חיים המחקים היבטים של אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי חיוניים לקידום ההבנה המושגית של התקדמות פציעות ופיתוח הנדסת רקמות יעילה וטיפולים מבוססי רפואה רגנרטיבית.

בהקשר זה, מודל subscapularis ארנב (SSC) מתאים בשל (i) הדמיון האנטומי שלו ליחידת שריר העצם-גיד האנושית supraspinatus (SSP), שהיא אתר RC הפצוע ביותר; (ii) הדמיון הפתופיזיולוגי שלה לבני אדם במונחים של פיברוזיס וניוון שומן שרירים (FD); ו-(iii) התאמתו להליכים כירורגיים. לכן, מטרת מחקר זה היא לתאר את הטכניקות הכירורגיות לגרימת פציעת SSC RC. בקצרה, ההליך כולל בידוד של SSC על ידי זיהוי שריר coracobrachialis ואחריו טרנסקציה בעובי מלא בצומת שריר-גיד ועיטוף הקצה החופשי של צומת שריר-גיד עם צינור פנרוז מבוסס סיליקון כדי למנוע חיבור מחדש ספונטני. הערכות היסטולוגיות מבוצעות כדי לעקוב אחר התקדמות FD שריר ב 4 שבועות לאחר הניתוח באמצעות hematoxylin ו eosin (H&E) כמו גם צביעת טריכרום של Masson.

אובדן שריר ו-FD ניכרו 4 שבועות לאחר טרנסקציה של צומת שריר-גיד SSC, בדומה למצבים פתופיזיולוגיים של RC אנושי. פרוטוקול זה מדגים את השלבים לביסוס מוצלח של מודל פציעה דמוי ארנב SSC RC דמוי ארנב, שיכול לשמש ככלי רב עוצמה לחקר שינויים בשרירי השלד הקשורים לפתופיזיולוגיה של RC ולסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לקרעי RC דמויי כרוניקה.

Introduction

קרעים כרוניים בשרוול המסובב (RC) מאופיינים בשינויים ניווניים בשרירים ובגידים, כולל ניוון שרירים, הצטברות רקמת שומן ופיברוזיס, אשר יכולים לסכן את התוצאה של תיקון RC ובסופו של דבר לגרום לכאבים בכתף ולתפקוד לקוי 1,2,3,4,5 . כדי להבין טוב יותר את הפתוגנזה של דמעות RC ולשפר את תוצאות הניתוח, חיוני לפתח מודלים מתאימים של בעלי חיים שיכולים לחקות היבטים של אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי. באופן ספציפי, מודלים של פציעות RC צריכים לעמוד בקריטריונים הבאים: (i) חסר ריפוי ספונטני לאחר פציעה; (ii) להכיל נוכחות משמעותית של פיברוזיס, ניוון שרירים והצטברות של רקמת שומן; ו-(iii) להיות בגודל מתאים כדי לאפשר קירוב של טכניקות כירורגיות המשמשות בבני אדם6.

בהקשר זה, שריר הארנב subscapularis (SSC) יכול לשמש כמודל חייתי מדויק ואמין לחקר פתופיזיולוגיה RC, בהתחשב באנטומיה הייחודית שלו, התגובה הפתופיזיולוגית והתכונות הביומכניות שלו7. ואכן, אנטומיה של ארנב SSC RC דומה לאנטומיה של SUPRASPINATUS האנושי (SSP) RC, שהיא יחידת השריר-גיד הקשורה לרוב לפציעה הנובעת משימוש יתר 8,9. באופן ספציפי, קומפלקס גיד SSC ארנב עובר דרך תעלה גרמית מתחת שריר coracobrachialis, אשר מקביל למצב בבני אדם שבו קומפלקס גיד SSP עובר דרך התעלה הגרמית subacromial ומתחת הרצועה coracoacromial7. דמיון אנטומי זה גורם לכך שארנב SSC עובר תנועות שרירים ושלד דומות לאלה של SSP אנושי, בהן הגיד נע מתחת לאקרומיון במהלך הגבהה וחטיפה של ההומרוס 7,10.

יתר על כן, שינויים פתולוגיים, בדומה לקרעי RC11 אנושיים, נצפו בארנב לאחר קרע SSC. באופן ספציפי, בטן השריר עוברת FD חמור, עם אובדן משמעותי של מסת שריר, ירידה באזור חתך סיבי שריר, ושומן מוגבר. בנוסף, Otarodifard et al. העריכו את המאפיינים הביומכניים של SSC הארנב לאחר (1) שורה אחת, (2) שורה כפולה, ו (3) טכניקות תיקון RC שוות ערך transosseous, ומצאו כי המאפיינים הביומכניים הראשוניים של תיקונים אלה היו דומים לתיקוני SSP RC אנושיים שבוצעו בדגימות cadaveric12. ככזה, הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והביומכני של SSC ארנב עם SSP אנושי הופך אותו שימושי למידול פציעות RC.

למרות שמינים רבים של בעלי חיים, כולל חולדות, עכברים, כלבים וכבשים, שימשו בחקר מחלת RC ותיקון 6,13,14,15, מידת כרוניקת הפציעה היא שיקול מרכזי. הסיבה לכך היא שקרעי RC יכולים להיות א-סימפטומטיים ולעתים קרובות עשויים להיות מאובחנים הרבה יותר מאוחר כאשר הקרע גדל והפך כרוני בטבע, כאשר הן הגיד והן השריר מפגינים ניוון חמור16,17,18. עם זאת, רוב דגמי תיקון RC משתמשים במודלים של פציעה חריפה, שבהם מעבירים את הגיד הבריא ואז מתקנים אותו מיד 19,20,21,22. זה קורה בעיקר מסיבות של תועלת לוגיסטית וקלות טכנית, וכתוצאה מכך מחקרים מעטים הבוחנים את הפתופיזיולוגיה RC בסביבה כרונית. יתר על כן, מספר מודלים של בעלי חיים עשויים להיות בעלי תכונות המעכבות את השימוש בהם למחקרי RC כרוניים.

לדוגמה, למרות שנעשה שימוש נרחב בחולדה כדי למדל קרע RC והתערבות, היעדר הצטברות שומן משמעותית לאחר פציעה מנוגד למצב האנושי, וגודלה הקטן הופך הליכים כירורגיים חוזרים ונשנים למאתגרים23. יתר על כן, למרות שגרבר ועמיתיו השתמשו באינפרא-ספינטוס של כבשים כדי לחקור ניוון שרירים ו-FD לאחר קרע RC כרוני24, קיים שוני אנטומי מסוים בין אינפרא-ספינטוס של כבשים לבין SSP אנושי, כמו גם אתגרים לוגיסטיים רבים ללימוד ודיור של מודל בעלי חיים כה גדול. בנוסף, Gerber et al. פיתחו מודל של פגיעה מאוחרת ב-RC בכבשים על ידי שחרור הראש השטחי של השריר והגיד האינפרא-ספינטוס כדי לחקות את התכונות של קרע RC כרוני, ולאחר מכן העריכו את היעילות של טכניקות תיקון שונות על הגיד לאחר 4 עד 6 שבועות. למרבה הצער, מודל כבשה כרוני זה היה בעל מגבלה, בכך שקצה הגיד המשוחרר הפך לבלתי ניתן להבחנה מרקמת צלקת במהלך ההליך הכירורגי השני25.

קולמן ועמיתיו פיתחו גם מודל של קרע RC כרוני בכבשים על ידי כיסוי קצה הגיד הטרנסקטטיבי בקרום סינתטי בזמן הניתוח הראשוני, אשר איפשר דיפוזיה של חומרי מזון ומזער ביעילות היווצרות רקמת צלקת סביב הרקמה הפגועה, תוך שיפור ההבחנה בין הגיד לרקמת הצלקת26. בינתיים, טרנר ואחרים הציעו כי תיקון מושהה צריך להתבצע בתוך 4 שבועות, שכן חיבור מחדש ישיר קורה לעתים רחוקות בנסיגה מסיבית של גיד27. יחד, מחקרים אלה תרמו לפרוטוקולים ניתנים לשחזור ואמינים לביסוס מוצלח של מודל פציעה דמוי ארנב כרוני SSC RC.

בפרוטוקול זה, מודל פציעה RC דמוי ארנב כרוני נקבע לאחר 4 שבועות, שבו ניתן ללמוד שינויים פתולוגיים הקשורים לפיברוזיס וניוון שרירים בתיווך FD באמצעות הערכות היסטולוגיות. בפרט, עיטוף הקצה החופשי של צומת שריר-גיד באמצעות צינור פנרוז מבוסס סיליקון בזמן הניתוח הראשוני מאפשר זיהוי ברור של רקמות RC במהלך ההליך הכירורגי השני, וכתוצאה מכך, מאפשר תיקון בטוח ללמוד ריפוי RC עם וללא הגדלת פיגומים. בסך הכל, מודל SSC דמוי ארנב כרוני עשוי לחקות טוב יותר פתופיזיולוגיה RC ולהציב דרישות טכניות ולוגיסטיות מינימליות.

Protocol

כל ההליכים חייבים להתבצע בטכניקה כירורגית סטרילית בחדר מאובזר המתאים לניתוחים בבעלי חיים על פי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של המכון. במחקר הנוכחי, ניתוחי ארנבים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הסינית של הונג קונג.

1. הליך כירורגי

  1. כדי להכין את אזור הניתוח, לחמם מראש כרית חימום ולכסות אותו עם וילונות כירורגיים סטריליים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של הארנב. לאחר מכן, הניחו כלים וציוד כירורגי מעוקר (כמפורט בטבלת החומרים) וארגנו אותם בהתאם להעדפת המנתח.
  2. השראת הרדמה באמצעות מתן תוך שרירי של 35 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין לארנבים לבנים בניו זילנד (במשקל שבין 3.5 ל-4.5 ק"ג, כבני 5-6.5 חודשים; במחקר זה נעשה שימוש בשני ארנבים זכרים ונקבה אחת). לאחר מכן, יש לאשר את ההרדמה בבדיקת צביטת כפות ו/או זנב.
  3. אם נדרשת הרדמה נוספת כדי לקיים את המישור הניתוחי, יש לתת 10 מ"ג/ק"ג קטמין ו-3 מ"ג/ק"ג קסילזין דרך וריד האוזן השולי28 ולעקוב אחר קצב הנשימה של בעל החיים בפרקי זמן קבועים של 5-10 דקות.
  4. להכנת חלון הניתוח, יש לגלח את אזור החתך המיועד (אזור העור שטחי ליחידת שריר-גיד SSC) ולנקות עם שלושה מריחה לסירוגין של בטאדין ו-70% אלכוהול. השתמשו במקלון צמר גפן כדי למרוח בטאדין ו-70% אלכוהול בתנועות סיבוביות (מבפנים לחוץ). השתמש משחת עיניים כדי לשמור על העיניים של הארנב לח ומשומן. יש לתת 20 מ"ג/ק"ג צפלקסין תוך שרירית כחומר אנטי זיהומי.
  5. בצעו חתך עור בקוטר 3-4 ס"מ נחות מעצם הבריח, פצלו את המרווח הדלטופקטורלי באמצעות אזמל כירורגי מס' 11, ונסוגו לאחור כדי לקבל גישה לכתף (איור 1A,B).
  6. כדי לאתר את יחידת שריר-גיד SSC, ראשית, יש לזהות את שריר הקוראקוברכיאליס (כרקמה המכסה את חיבור גיד SSC) ולפצל אותו. לאחר מכן, זהו את גיד ה-SSC, והכניסו מהדק ישר-זווית כדי לחשוף את כל גיד ה-SSC בעת החדרתו על הטוברוזיות הפחותות של עצם הזרוע (איור 1C).
  7. לפני תחילת הפציעה, בודדו את גיד-שריר SSC (איור 1D) ובצעו הרדמה תוך ניתוחית (0.2 מ"ג/ק"ג של 0.5% bupivacaine) באופן מקומי ליד אתר הטרנסקציה. עטפו את יחידת גיד השריר SSC בצינורות פנרוז מבוססי סיליקון (איור 1E) כדי למנוע היצמדות לא רצויה לרקמות שמסביב ולסייע בשאיבת הרקמה לאחר מכן.
  8. כדי לגרום לפציעה, צרו טרנסקציה בעובי מלא בצומת שריר-גיד באמצעות אזמל כירורגי מס' 11 (איור 1F). במידת הצורך, להפסיק את הדימום על ידי הפעלת לחץ עם חתיכת גזה ולהשתמש מלוחים כדי להשקות את הפצע לפי הצורך.
  9. כדי לסגור את הפצע, השתמשו בתפר של 4-0 חומצה פוליגליקולית (PGA) כדי לדמות מחדש את רקמת שריר הדלטואיד (איור 1G) ובתפר ניילון 4-0 כדי לסגור את פצע העור (איור 1H).
  10. לספק טיפול לאחר הניתוח באמצעות מתן תת עורי של 0.03 מ"ג / ק"ג buprenorphine כמו משכך כאבים (פעם אחת מיד לאחר הניתוח פעמיים ביום במשך 48 שעות29 הבא).
  11. אפשרו לארנבים להתאושש על כרית חימום מכוסה והשתמשו בקולר רך כדי למנוע התנהגות בלתי רצויה, כולל הטלת מום עצמי, ליקוק אתרי ניתוח והסרת תפרים (איור 1I).
  12. עקוב אחר בעלי החיים עבור משקל ושינויים התנהגותיים. דווחו לווטרינר על כל ירידה של יותר מ-10% במשקל הגוף ועל כאבים חמורים שאינם ניתנים לשליטה (מוערכים על סמך חמש פעולות התנהגותיות: הידוק מסלולי, השטחת לחיים, שינויים בצורת הנחיריים, שינויים במיקום השפם ושינויים בצורת האוזן ובמיקום) כדי לקבוע אם נדרשת התערבות כגון המתת חסד מוקדמת.

2. קציר דגימות

  1. הרדימו את הארנבים בגיל 4 שבועות מרגע הפציעה. מרדימים את הארנבים ונותנים מנה קטלנית של נתרן pentobarbital (יותר מ 60 מ"ג / ק"ג). לאשר מוות על ידי thoracotomy.
  2. לזהות את ראש ההומרל ולסלק אותו בניתוח, תוך שמירה על השחפיות הגדולות יותר ופחות וכל חיבורי הרקמות הרכות. תקן עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 72 שעות ב 4 ° C לפני המעבר לתמיסה של 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך חודש אחד בטמפרטורת החדר (עם שינוי מדיה כל 72 שעות) כדי decalcize עצם.
  3. לאחר ההסתיידות, יש להעביר את הדגימות לעיבוד היסטולוגי סטנדרטי באמצעות התייבשות אתנול מדורגת, הטבעה פרפין, חתך היסטולוגי (חתכים של 8 מיקרומטר) וצביעה עם המטוקסילין ואאוסין (H&E) ותמיסות טריכרום30,31,32 של Masson.
  4. צלם תמונות עם מיקרוסקופ זקוף בהגדלה של פי 10.
  5. בצע כימות למחצה של תמונות הטריכרום של H&E ו- Masson על ידי מדידת השטח והאחוז של שריר, רקמה סיבית ושומן בתוך השריר, כפי שתואר קודם33,34 באמצעות תוכנת עיצוב גרפי לבחירה. בדוגמה זו, נעשה שימוש בתוכנת Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).
    1. בחר אזור בצבע מסוים המייצג סוג רקמה מסוים באמצעות הכלי מטה הקסם (אדום הוא רקמת שריר, כחול הוא פיברוזיס ולבן מייצג שומן).
    2. לחץ על פריטי התפריט בחר | הפוך | שמור בחירה | תן שם לסעיף.
    3. ספירת מספר הפיקסלים באזור המסומן על-ידי לחיצה על פריטי תפריט חלון | יומן מדידות | הקלט מדידה כדי להקליט ערכי פיקסלים אלה, ולחשב ידנית את אחוז סוגי הרקמה שנבחרו.

3. ניתוח סטטיסטי

  1. עבור נתונים היסטולוגיים, בצע את הניתוח הסטטיסטי באמצעות התוכנה האנליטית הנבחרת. בצע מבחן t של תלמיד להשוואה של שתי דגימות בלתי תלויות בין קבוצת הביקורת לבין קבוצת הנפגעים.
  2. בטא את הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. שקול ערך p של <0.05 כמובהק סטטיסטית.

Representative Results

כדי להעריך את הכרוניות של פתולוגיית RC בעקבות הטרנסקציה של יחידות שריר-גיד SSC, המורפולוגיה הכוללת של הרקמה והשינויים התאיים אופיינו באמצעות הערכה גסה וניתוח היסטולוגי (H&E וצביעת טריכרום של מאסון, בהתאמה), 4 שבועות לאחר הפציעה (איור 2, איור 3 ואיור 4). תמונות מייצגות של מורפולוגיה של רקמה גסה הראו הופעה של רקמה דמוית שומן לבן בשרירי SSC פגועים, שנעדרה בקבוצת הביקורת (איור 2). צביעת H&E אישרה אובדן של תאי שריר וארגון, אשר הוחלף במספר גדול של אדיפוציטים (חללים ריקים המוקפים בשוליים דקים של ציטופלסמה שהכילו גרעינים דחוסים) בשרירי SSC פגועים ביחס לקבוצת הביקורת (איור 3A).

הערכה כמותית למחצה של תמונות H&E הראתה רמה גבוהה של נוכחות אדיפוציטים תוך שריריים בשרירי SSC פגועים (36.5% ± 8.5%) ביחס לקבוצת הביקורת (0.69% ± 0.18%) (איור 3B). צביעת הטריכרום של מאסון גם אישרה ניוון שרירים וסידור לא מאורגן של סיבי קולגן בשרירי SSC פגועים ביחס לקבוצת הביקורת (איור 4A). הערכה כמותית למחצה של תמונות הטריכרום של מאסון הראתה ירידה בתאי השריר עבור שרירי SSC פגועים (41.3% ± 2.6%) ביחס לקבוצת הביקורת (99.2% ± 0.16%) (איור 4B). אף על פי שהערכה כמותית למחצה נוספת לא הראתה הבדל משמעותי בהיווצרות רקמות פיברוטיות בין שרירי SSC פגועים (22.3% ± 13.1%) לבין קבוצת הביקורת (0.07% ± 0.05%), נצפתה רמה גבוהה של פיברוזיס בשרירי SSC פגועים (איור 4C). יחד, מורפולוגיה גסה של רקמות וניתוח היסטולוגי הראו כי גיד שריר SSC של ארנב פצוע הפגין ניוון שרירים חמור, הצטברות שומן ופיברוזיס, שהם סימני ההיכר הידועים של פתופיזיולוגיה כרונית של RC.

Figure 1
איור 1: הליך כירורגי עבור מודל פציעה כרונית דמוית SSC שריר-גיד. (A) נוצר חלון ניתוחי וזוהו נקודות ציון אנטומיות כגון עצם הזרוע, ראש הומרל ועצם הבריח במישוש. (B) חתך בעור בקוטר 3.0 ס"מ נעשה נחות מעצם הבריח. (C) שריר הקוראקוברכיאליס פוצל כדי לחשוף את שריר ה-SSC. (D) בודדה יחידת שריר-גיד SSC. (E) נעשה שימוש בניקוז פנרוז מבוסס סיליקון כדי לעטוף את רקמת גיד השריר SSC. (F) גיד שריר-SSC עבר טרנסקטציה. (G) שריר הקוראקוברכיאליס עבר קירוב מחדש באמצעות תפרים PGA. (H) החתך בעור נסגר באמצעות תפרי ניילון. (I) לאחר הניתוח, הארנבים קיבלו צווארון רך ללבישה. קיצורים: SSC = subscapularis; PGA = חומצה פולי גליקולית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה גסה של שרירי SSC מייצגים. חיצים שחורים מייצגים רקמות שומן לבנות. קיצור: SSC = subscapularis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח היסטולוגי של מודל פציעה RC דמוי RC כרוני לאחר 4 שבועות. (A) תמונות היסטולוגיה מוכתמות H&E מייצגות הראו סיבי שריר אטרופיים והצטברות של אדיפוציטים. (B) כימות אחוז הצטברות שומן בשריר פגוע. n = 3 ארנבים. קווי שגיאה מציינים SEM. *, מובהק סטטיסטית (p≤ 0.05). פסי קנה מידה = 5,000 מיקרומטר (A, עמודה שמאלית), 600 מיקרומטר (A, עמודה ימנית). קיצורים: SSC = subscapularis; RC = שרוול מסובב; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח היסטולוגי של מודל פציעה RC דמוי כרוני לאחר 4 שבועות. (A) התמונות המוכתמות בטריכרום של מאסון הראו פיברוזיס משמעותי. רקמת חיבור סיבית מוכתמת בכחול. (B) כימות החלק היחסי של שריר ו-(C) רקמה פיברוטית. n = 3 ארנבים. קווי שגיאה מציינים SEM. *, מובהק סטטיסטית (p≤ 0.05). פסי קנה מידה = 5,000 מיקרומטר (A, עמודה שמאלית), 200 מיקרומטר (A, עמודה ימנית). קיצורים: SSC = subscapularis; RC = שרוול מסובב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מודל בעל חיים הניתן לשחזור ורלוונטי פיזיולוגית מספק את היכולת לקדם את ההבנה של פתוגנזה של מחלות, להעריך את התוצאות של טיפולים קליניים, ולשפר ולפתח טיפולים כירורגיים35. במחקר זה נקבע מודל SSC ארנבי אמין ומדויק המחקה היבטים באנטומיה ובפתופיזיולוגיה של RC אנושי. דמעות RC קשורות לשינויים ניווניים שריריים מתקדמים וככל הנראה בלתי הפיכים, וכתוצאה מכך פוטנציאל ריפוי מופחת. לדוגמה, Ko et al. הראו כי חיבור מחדש של SSP ארנב לאחר 6 שבועות לא להפוך ניוון שרירים או FD ב 6 שבועות הבאים. ניוון שרירים בתיווך FD כזה משפיע על מספר פרמטרים קליניים חשובים, כולל כוח שריר הגידים וטווח התנועה של המפרקים, אשר עשויים להשפיע על תוצאות הניתוח36,37.

הפרוטוקול שנקבע כאן הראה תכונות כרוניות משמעותיות לאחר הטרנססקציה של יחידות שריר-גיד SSC. באופן ספציפי, השינויים האלה כוללים ירידה ניכרת במסת השריר ועלייה בתכולת השומן וברקמות הפיברוטיות (איור 2, איור 3 ואיור 4). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם שינויים ניווניים שדווחו בדמעות RC אנושיות38. בשנים האחרונות, החולדה התגלתה כאחד המודלים הנחקרים ביותר בבעלי חיים עבור מחלת RC ופציעה בשל הדמיון האנטומי הגבוה שלה עם SSPs אנושיים וחולדות הנעים תחת אקרומיון38,39,40. עם זאת, יש לציין כי החלק של SSP חולדה אשר עובר מתחת לקשת אקרומיאלית הוא שרירי לעומת מגמתי, כפי שקורה בבני אדם41 . חשוב מכל, ברטון ועמיתיו זיהו חוסר בהצטברות שומן משמעותית לאחר ניתוק גיד SSP בחולדות23, העומד בניגוד למצב האנושי42. ככזה, הוא האמין כי קומפלקס SSC ארנב עשוי לספק מודל מתאים כדי לחקות את קרע RC כרוני של בני אדם.

כדי להבטיח את השחזור של מודל זה, שתי נקודות ראוי לציין בעת ביצוע פרוטוקול זה. ראשית, לאחר הטרנסקציה של יחידות שריר-גיד, הקצה החופשי של הגיד הטרנסקדטיבי עלול להיות בסיכון ליצירת הידבקויות, מה שיכול להפוך את שליפת הגידים למאתגרת עבור מניפולציות הבאות. כדי להימנע מהבעיה הזו, השתמשו בצינור סיליקון שאינו ניתן לספיגה כדי לעטוף את הקצה החופשי של צומת השריר-גיד לאחר טרנסקציה כדי למנוע הידבקות ספונטנית לרקמות שמסביב כמו גם ריפוי ספונטני (איור 1E). יתר על כן, ניתן לזהות בבירור את יחידת גיד השריר הטרנסקט במהלך הליך התערבות שני (כלומר, לבצע תיקון מאובטח; הנתונים אינם מוצגים) על ידי עטיפת קצה הרקמות הפגועות בזמן הניתוח הראשוני. טכניקה זו חסכונית, יעילה, וניתן ליישם אותה בקלות בניתוח43. שנית, ארנבים הם מין רגיש מאוד שעלול להפגין התנהגות מזיקה לאחר ניתוח. כדי להימנע מבעיות כאלה, מומלץ מאוד להשתמש גם בקולר רך כדי למנוע התנהגות לא רצויה, כולל הטלת מום עצמי, ליקוק אתרי ניתוח והסרת תפרים (איור 1I). בהשוואה לצווארונים אלקטרוניים קונבנציונליים מסחרית העשויים מפלסטיק קשיח, הצווארון הרך מייצור עצמי לא גרם לפגיעה בעור או לתופעות לוואי אחרות שהשפיעו על רווחת בעלי החיים או על איכות המחקר המדעי. יחד, צעדים כאלה הם קריטיים כדי ליצור מודל פציעת RC ארנב הניתן לשחזור מדויק ולספק את האפשרות ללמוד את אסטרטגיות התיקון הרגנרטיבי.

כדי לחקור פתופיזיולוגיה של גידים וריפוי במודל של בעלי חיים, יש ליצור פגיעה מובחנת וניתנת לשחזור, ולבחור בקפידה את נקודות הזמן של המחקר. הרוב המכריע של המחקרים על פגיעה בגידים וריפוי בוצעו על גידים בעלי חיים שעברו טרנסקטציה מלאה44, שכן טרנסקציה היא הליך פשוט שניתן לשחזר מאוד ויכול לדמות כראוי את התרחיש הקליני45,46. Huegel et al. הראו כי פציעה של גיד שעבר טרנסקטציה חלקית הייתה פחות חמורה מזו של גיד שעבר טרנסקטציה מלאה, ולאימוביליזציה הייתה השפעה מזיקה על מכניקת הגידים, כולל נוקשות מפרקים מוגברת47. כדי להעריך את הניוון ואת FD שנראה במצב של קרע RC מסיבי, חיוני להגדיר את נקודות הזמן האופייניות שנצפו בניסוי. גופטה ועמיתיו אימתו מודל פציעה RC בארנב הזכר והבחינו בניוון שרירים בנקודות זמן של שבועיים ושישה שבועות, עם תכולת שומן מוגברת בנקודות זמן מאוחרות יותר (פחות מ -5% תכולת שומן לאחר שבועיים לעומת יותר מ -10% תכולת שומן לאחר 6 שבועות), בהתאם לתהליך הפתולוגי שנצפה בדמעות RC אנושיות11. במחקר זה, נוצר קרע RC מסיבי על ידי טרנסקציה של יחידת גיד שריר SSC בארנבים זכרים ונקבות במשך 4 שבועות, מה שהביא לשריר SSC FD (תכולת שומן של 36.5%). לכן, נקודת זמן של 4 שבועות מתאימה ליצירת שריר SSC FD בארנבים לבנים בניו זילנד זכרים ונקבות.

קיימות מספר מגבלות למחקר זה. אלה כוללים: (i) שלבים הקשורים ליצירת מודלים של בעלי חיים, כגון נקודת זמן קצרה יחסית וחומרים דלקתיים פוטנציאליים (צינורות פנרוז מבוססי סיליקון) ליצירת פציעות כרוניות; (ii) אפיון וניתוח מודלים של בעלי חיים, כגון חוסר ניתוח הליכה ואלקטרומיוגרפיה להערכת קינמטיקה משותפת ויצירת כוח כיווץ שרירים; ו-(iii) השוואת מודלים של בעלי חיים, כגון חוסר השוואה לאתרי פגיעה אחרים של RC.

במונחים של יצירת מודל, פציעות RC אנושיות כוללות בדרך כלל ניוון מתקדם ו- FD שעלולים להתרחש בטווח של מספר שנים, שהוא ארוך יחסית מנקודת הזמן של 4 שבועות שדווחה כאן. זה נחשב מקובל, שכן מודל בעלי חיים המייצר סביב 36.5% שומן תוך שרירי בטווח זמן קצר יחסית יהיה נוח מבחינה לוגיסטית וניתן להאריך אותו במידת הצורך. יתר על כן, התאימות הביולוגית של שתלים מבוססי סיליקון, כגון צינורות פנרוז, הייתה מקור למחלוקת ארוכת שנים עקב דיווחים על תגובה חיסונית תאית ודלקת47; לכן, חומר אינרטי חלופי, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), עשוי להיות מוחלף לעטיפת הגיד המנותח אם מחפשים מחקרי RC הקשורים לדלקת.

מבחינת אפיון וניתוח מודלים של בעלי חיים, היעדר ניתוח הליכה49 ומחקרי אלקטרומיוגרף50 עשויים להגביל את ממצאי המחקר לנתונים היסטולוגיים איכותיים. היבטים אלה עשויים להיות מטופלים במחקרים עתידיים באמצעות ניתוח תנועה וידאו51 ואלקטרומיוגרפיה פני השטח50 כדי ליצור נתונים כמותיים על קינמטיקה של הכתף וביצועי שרירי RC.

מבחינת השוואת מודלים, מכיוון שגידי SSP ואינפרא-ספינטוס בארנבים נמצאים בשימוש נרחב גם במחקרי RC, השוואת חומרת הפציעה, כולל FD בין אתרי פציעה שונים אלה בעתיד, תזהה אתרים נוספים לאופטימיזציה של המודל.

לסיכום, מחקר זה פיתח פרוטוקול למידול פציעות RC כרוניות בארנבים זכרים ונקבות. מודל זה נוח לחוקרים בשל פשטותו (טרנסקציה) ופרק זמן קצר יחסית להשראת כרוניות (4 שבועות) תוך יצירת מידה רבה (36.5%) של FD תוך שרירי. ככזה, פרוטוקול זה צפוי לסייע לחוקרים בחקר הפתופיזיולוגיה של RC, כמו גם להקל על פיתוח טיפולים חדשניים לתיקון והתחדשות שריר-גיד.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.

Acknowledgments

המחקר של דאי פיי אלמר קר נתמך על ידי מימון מלשכת המזון והבריאות, הונג קונג SAR (קרן בריאות רפואית ומחקר: 08190466), ועדת חדשנות וטכנולוגיה, הונג קונג SAR (פרס דרגה 3: ITS/090/18; תוכנית Health@InnoHK), מועצת מענקי המחקר של הונג קונג, הונג קונג SAR (פרס תוכנית הקריירה המוקדמת: 24201720 וקרן המחקר הכללית: 14213922), והאוניברסיטה הסינית של הונג קונג (פרס חדשנות פקולטית: FIA2018/A/01). המחקר של דן וואנג נתמך על ידי מימון מלשכת המזון והבריאות, הונג קונג SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), ועדת החדשנות והטכנולוגיה, הונג קונג SAR (פרס Tier 3: ITS/333/18; תוכנית Health@InnoHK), ומועצת מענקי המחקר של הונג קונג, הונג קונג SAR (קרן מחקר כללית: 14118620 ו 14121121).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools
4-0 Poly glycolic acid (PGA) e-Sutures GBK884
Toothed Adson forceps Taobao, China
Fine scissors  Taobao, China
Hemostatic forceps Taobao, China
Needle holders Taobao, China
Surgical scalpel with handle Taobao, China No. 11 blade
Suture (4-0 Nylon) Taobao, China 19054 Either nylon or silk sutures are acceptable for skin closure. Each suture has its own advantages and disadvantages and users are advised to choose one according to their preference.
Surgical accessories
Cotton balls Taobao, China
Gauze Taobao, China
Razor Taobao, China
Surgical heating pad Taobao, China
Surgical lamp
Syringe with needles Taobao, China 1 mL, 5 mL, 10 mL
Drugs
Buprenorphine LASEC, CUHK 0.12 mg/kg
Bupivacaine Sigma-Aldrich b5274-5g 1-2 mg/kg
Cephalexin Santa Cruz Biotechnology sc-487556 20 mg/kg
Ketamine  LASEC, CUHK 35 mg/kg
Sodium pentobarbital LASEC, CUHK more than 60 mg/kg
Xylazine LASEC, CUHK 5 mg/kg
Equipment
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope Nikon Instruments Inc, USA
Software
Adobe Photoshop 20.01 Adobe Inc, USA
Other reagents 
Betadine Taobao, China 5%
Ethanol Taobao, China 70%
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS-1KG 10%
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713 4%
Silicone tubing Easy Thru, China ISO13485
Saline Taobao, China
Histological staining reagents
Eosin Stain Solution Sigma-Aldrich R03040 5% Aqueous
Hematoxylin Solution Sigma-Aldrich HHS32
Trichrome Stain (Masson) Kit Sigma-Aldrich HT15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goutallier, D., Postel, J. -M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. -C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre-and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. 304 (304), 78-83 (1994).
  2. Itoigawa, Y., Kishimoto, K. N., Sano, H., Kaneko, K., Itoi, E. Molecular mechanism of fatty degeneration in rotator cuff muscle with tendon rupture. Journal of Orthopaedic Research. 29 (6), 861-866 (2011).
  3. Mal Kim, H., et al. Relationship of tear size and location to fatty degeneration of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (4), 829-839 (2010).
  4. Melis, B., DeFranco, M. J., Chuinard, C., Walch, G. Natural history of fatty infiltration and atrophy of the supraspinatus muscle in rotator cuff tears. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468 (6), 1498-1505 (2010).
  5. Li, K., Zhang, X., Wang, D., Tuan, R. S., Ker, D. F. E. Synergistic effects of growth factor-based serum-free medium and tendon-like substrate topography on tenogenesis of mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. , 146 (2023).
  6. Derwin, K. A., Baker, A. R., Codsi, M. J., Iannotti, J. P. Assessment of the canine model of rotator cuff injury and repair. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S140-S148 (2007).
  7. Grumet, R. C., Hadley, S., Diltz, M. V., Lee, T. Q., Gupta, R. Development of a new model for rotator cuff pathology: The rabbit subscapularis muscle. Acta Orthopaedica. 80 (1), 97-103 (2009).
  8. Renström, P., Johnson, R. J. Overuse injuries in sports. Sports Medicine. 2 (5), 316-333 (1985).
  9. Hertel, R., Lambert, S. M. Supraspinatus rupture at the musculotendinous junction. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 432-435 (1998).
  10. Oh, J. H., Chung, S. W., Kim, S. H., Chung, J. Y., Kim, J. Y. Neer Award: Effect of the adipose-derived stem cell for the improvement of fatty degeneration and rotator cuff healing in rabbit model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 23 (4), 445-455 (2013).
  11. Gupta, R., Lee, T. Q. Contributions of the different rabbit models to our understanding of rotator cuff pathology. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S149-S157 (2007).
  12. Otarodifard, K., Wong, J., Preston, C. F., Tibone, J. E., Lee, T. Q. Relative fixation strength of rabbit subscapularis repair is comparable to human supraspinatus repair at time 0. Clinical Orthopaedics and Related Research. 472 (8), 2440-2447 (2014).
  13. Liu, X., Manzano, G., Kim, H. T., Feeley, B. T. A rat model of massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 588-595 (2011).
  14. Liu, X., et al. A mouse model of massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 94 (7), 41 (2012).
  15. Neer,, et al. Award 2007: Reversion of structural muscle changes caused by chronic rotator cuff tears using continuous musculotendinous traction. An experimental study in sheep. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 18 (2), 163-171 (2009).
  16. Warner, J. J., Parsons, I. M. Latissimus dorsi tendon transfer: A comparative analysis of primary and salvage reconstruction of massive, irreparable rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 10 (6), 514-521 (2001).
  17. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 86 (2), 219-224 (2004).
  18. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  19. Carpenter, J. E., Thomopoulos, S., Flanagan, C. L., DeBano, C. M., Soslowsky, L. J. Rotator cuff defect healing: A biomechanical and histologic analysis in an animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (6), 599-605 (1998).
  20. Jal Soslowsky, L., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: Role of extrinsic and overuse factors. Annals of Biomedical Engineering. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  21. Thomopoulos, S., et al. The localized expression of extracellular matrix components in healing tendon insertion sites: An in situ hybridization study. Journal of Orthopaedic Research. 20 (3), 454-463 (2002).
  22. Su, W., et al. Effect of suture absorbability on rotator cuff healing in a rabbit rotator cuff repair model. The American Journal of Sports Medicine. 46 (11), 2743-2754 (2018).
  23. Barton, E. R., Gimbel, J. A., Williams, G. R., Soslowsky, L. J. Rat supraspinatus muscle atrophy after tendon detachment. Journal of Orthopaedic Research. 23 (2), 259-265 (2005).
  24. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: An experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  25. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Perren, S. M., Nyffeler, R. W. Experimental rotator cuff repair. A preliminary study. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 81 (9), 1281-1290 (1999).
  26. Hal Coleman, S., et al. Chronic rotator cuff injury and repair model in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 85 (12), 2391-2402 (2003).
  27. Turner, A. S. Experiences with sheep as an animal model for shoulder surgery: strengths and shortcomings. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S158-S163 (2007).
  28. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder MA, Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  29. Cooper, C. S., Metcalf-Pate, K. A., Barat, C. E., Cook, J. A., Scorpio, D. G. Comparison of side effects between buprenorphine and meloxicam used postoperatively in Dutch belted rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (3), 279-285 (2009).
  30. Eal Ker, D. F., et al. Functionally graded, bone-and tendon-like polyurethane for rotator cuff repair. Advanced Functional Materials. 28 (20), 1707107 (2018).
  31. Toumi, H., et al. Regional variations in human patellar trabecular architecture and the structure of the proximal patellar tendon enthesis. Journal of Anatomy. 208 (1), 47-57 (2006).
  32. Noor, R. A. M., Shah, N. S. M., Zin, A. A. M., Sulaiman, W. A. W., Halim, A. S. Disoriented collagen fibers and disorganized, fibrotic orbicularis oris muscle fiber with mitochondrial myopathy in non-syndromic cleft lip. Archives of Oral Biology. 140, 105448 (2022).
  33. Wang, D., et al. Growth and differentiation factor-7 immobilized, mechanically strong quadrol-hexamethylene diisocyanate-methacrylic anhydride polyurethane polymer for tendon repair and regeneration. Acta Biomaterialia. 154, 108-122 (2022).
  34. Wang, D., et al. Combinatorial mechanical gradation and growth factor biopatterning strategy for spatially controlled bone-tendon-like cell differentiation and tissue formation. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
  35. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, (2016).
  36. Safran, O., Derwin, K. A., Powell, K., Iannotti, J. P. Changes in rotator cuff muscle volume, fat content, and passive mechanics after chronic detachment in a canine model. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 87 (12), 2662-2670 (2005).
  37. Gerber, C., Fuchs, B., Hodler, J. The results of repair of massive tears of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 82 (4), 505-515 (2000).
  38. Longo, U. G., Berton, A., Khan, W. S., Maffulli, N., Denaro, V. Histopathology of rotator cuff tears. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 19 (3), 227-236 (2011).
  39. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 375-380 (1998).
  40. Soslowsky, L. J., Carpenter, J. E., DeBano, C. M., Banerji, I., Moalli, M. R. Development and use of an animal model for investigations on rotator cuff disease. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 5 (5), 383-392 (1996).
  41. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. 92 (13), 2270-2778 (2010).
  42. Gladstone, J. N., Bishop, J. Y., Lo, I. K., Flatow, E. L. Fatty infiltration and atrophy of the rotator cuff do not improve after rotator cuff repair and correlate with poor functional outcome. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 719-728 (2007).
  43. Chen, W. F., Kim, B. -S., Lin, Y. -T. Penrose drain interposition-A novel approach to preventing adhesion formation after tenolysis. The Journal of Hand Surgery. Asian-Pacific Volume. 27 (1), 174-177 (2022).
  44. Lui, P. P. Y. Stem cell technology for tendon regeneration: Current status, challenges, and future research directions. Stem Cells and Cloning: Advances and Applications. 8, 163-174 (2015).
  45. Howell, K., et al. Novel model of tendon regeneration reveals distinct cell mechanisms underlying regenerative and fibrotic tendon healing. Scientific Reports. 7, 45238 (2017).
  46. Sharma, P., Maffulli, N. Tendinopathy and tendon injury: The future. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1733-1745 Forthcoming.
  47. Huegel, J., et al. Quantitative comparison of three rat models of Achilles tendon injury: A multidisciplinary approach. Journal of Biomechanics. 88, 194-200 (2019).
  48. Pal Heggers, J., et al. Biocompatibility of silicone implants. Annals of Plastic Surgery. 11 (1), 38-45 (1983).
  49. Liu, Y., et al. Evaluation of animal models and methods for assessing shoulder function after rotator cuff tear: A systematic review. Journal of Orthopaedic Translation. 26, 31-38 (2020).
  50. Disselhorst-Klug, C., Schmitz-Rode, T., Rau, G. Surface electromyography and muscle force: Limits in sEMG-force relationship and new approaches for applications. Clinical Biomechanics. 24 (3), 225-235 (2009).
  51. Kwon, D. R., Park, G. -Y., Moon, Y. S., Lee, S. C. Therapeutic effects of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells combined with polydeoxyribonucleotides on full-thickness rotator cuff tendon tear in a rabbit model. Cell Transplantation. 27 (11), 1613-1622 (2018).

Tags

ארנב מודל פציעה של שרוול מסובב דמוי כרוני פיברוזיס ניוון שומני שרירי שרירים גידים כוח נסיגה יחידת שריר-גיד/מיוטנדי תפקוד כתף תוצאות תיקון RC מודלים של בעלי חיים אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי הנדסת רקמות טיפולים מבוססי רפואה רגנרטיבית מודל תת-סקפולאריס של ארנב יחידת שריר-גיד עצם אנושית Supraspinatus פיברוזיס וניוון שומן שרירים (FD) הליכים כירורגיים בידוד SSC שריר Coracobrachialis טרנסקציה בעובי מלא צינורות פנרוז על בסיס סיליקון הערכה היסטולוגית
פיתוח מודל פגיעה בשרוול מסובב דמוי ארנב כרוני לחקר פיברוזיס וניוון שומן שרירי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. … More

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. F. E. Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64828, doi:10.3791/64828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter