Summary
この研究では、慢性的なウサギ回旋筋腱板(RC)損傷を確立するための手順を詳しく説明します。具体的には、重度の筋脂肪変性症(FD)を含むヒトRCの解剖学的構造と病態生理学を模倣するために、肩甲下筋(SSC)筋腱/筋腱ユニットに損傷が生じます。このプロトコルは、RC損傷の研究と再生療法の評価に適用できます。
Abstract
ウサギ回旋筋腱板(RC)の病態生理学は、関連する筋肉組織と腱の進行性で高度に変性的な変化につながる可能性があり、筋腱/筋腱ユニットの強度や収縮などの臨床的に関連するパラメーターに悪影響を及ぼし、最終的に肩の機能の喪失を引き起こし、RC修復結果に悪影響を及ぼします。ヒトRCの解剖学的構造と病態生理学の側面を模倣した動物モデルは、損傷の進行の概念的理解を進め、効果的な組織工学および再生医療ベースの治療法を開発するために不可欠です。
この文脈では、ウサギ肩甲下筋(SSC)モデルは、(i)最も頻繁に損傷するRC部位であるヒトの棘上筋(SSP)骨-腱-筋肉ユニットとの解剖学的類似性のために適しています。(ii)線維症および筋脂肪変性(FD)に関するヒトとの病態生理学的類似性。(iii)外科的処置に対するその適応性。したがって、この研究の目的は、SSC RC 損傷を誘発するための外科的技術を説明することです。簡単に言うと、この手順では、烏口腕筋を特定し、続いて筋腱接合部に全層の離断線を行い、筋腱接合部の自由端をシリコンベースのペンローズチューブで包んで自発的な再付着を防ぐことにより、SSCを分離します。組織学的評価は、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)およびマッソンのトリクローム染色を使用して、術後4週間での筋肉FDの進行を監視するために行われます。
筋肉とFDの喪失は、SSC筋腱接合部の切断から4週間後に明らかであり、ヒトのRC病態生理学的状態と同様であった。このプロトコルは首尾よくRCの病態生理学と関連付けられる骨格筋の変更を研究し、慢性そっくりのRCの破損のための新しい治療上の作戦の開発を助ける強力な用具として役立つことができる慢性そっくりのウサギSSC RCの傷害モデルを確立するためのステップを示す。
Introduction
慢性回旋筋腱板(RC)断裂は、筋肉の萎縮、脂肪組織の蓄積、線維症など、筋肉組織と腱の変性変化を特徴とし、RC修復の結果を損ない、最終的に肩の痛みや機能障害を引き起こす可能性があります1,2,3,4,5.RC裂傷の病因をよりよく理解し、手術結果を改善するには、ヒトRCの解剖学的構造と病態生理学の側面を模倣できる適切な動物モデルを開発することが重要です。具体的には、RC損傷モデルは次の基準を満たす必要があります:(i)損傷後の自然治癒を欠いています。(ii)線維症、筋萎縮、および脂肪組織の蓄積の著しい存在を含む。(iii)ヒトで使用される外科的技術の近似を可能にするのに十分なサイズであること6。
この文脈において、ウサギの肩甲下筋(SSC)は、そのユニークな解剖学的構造、病態生理学的反応、および生体力学的特性を考えると、RC病態生理学の研究のための正確で信頼性の高い動物モデルとして使用することができます7。実際、ウサギのSSC RCの解剖学的構造は、酷使による損傷に最も頻繁に関連する筋腱ユニットであるヒト棘上筋(SSP)RCに類似しています8,9。具体的には、ウサギSSC腱複合体は骨トンネルを通り、烏口腕筋の下を通過するが、これは、SSP腱複合体が肩峰下骨トンネルを通り、烏口肩峰靭帯の下を通過するヒトの状況と類似している7。この解剖学的類似性により、ウサギSSCはヒトSSPと同様の筋骨格運動を経験し、上腕骨の上昇および外転中に腱が肩峰の下を移動する7,10。
さらに、SSC涙液後のウサギでは、ヒトRC涙液11と同様の病理組織学的変化が観察されている。具体的には、筋肉腹は重度のFDを受け、筋肉量の大幅な損失、筋繊維断面積の減少、および脂肪の増加を伴います。さらに、Otarodifardらは、(1)単列、(2)複列、および(3)経骨等価RC修復技術後のウサギSSCの生体力学的特性を評価し、これらの修復の初期生体力学的特性が、死体標本で行われたヒトSSP RC修復と類似していることを発見しました12。そのため、ウサギSSCとヒトSSPの解剖学的、生理学的、生体力学的類似性は、RC損傷のモデル化に有用である。
ラット、マウス、イヌ、ヒツジを含む多くの動物種がRC疾患の研究に使用され、修復されている6,13,14,15が、傷害の慢性化の程度は重要な考慮事項である。これは、RC断裂は無症候性である可能性があり、裂傷が肥大して慢性化し、腱と筋肉の両方が重度の変性を示す16,17,18のかなり後に診断される可能性があるためです。しかし、ほとんどのRC修復モデルは、健康な腱を切除し、すぐに修復する急性損傷モデルを採用しています19,20,21,22。これは主に物流上の便宜性と技術的な容易さの理由で発生し、慢性的な設定内でRCの病態生理を調べる研究はほとんどありません。さらに、いくつかの動物モデルは、慢性RC研究への使用を妨げる特性を有する可能性がある。
例えば、ラットはRCの涙液と介入をモデル化するために広く使用されてきたが、損傷後の有意な脂肪蓄積の欠如は人間の状態とは対照的であり、そのサイズが小さいため、繰り返しの外科的処置は困難である23。さらに、Gerberらは、慢性RC断裂後の筋萎縮とFDを研究するためにヒツジの棘下筋を使用したが24、ヒツジの棘下筋とヒトSSPの間には解剖学的相違があり、そのような大型動物モデルを研究して飼育するための多くのロジスティック上の課題がある。さらに、Gerberらは、慢性RC断裂の特徴を模倣するために棘下筋と腱の表在頭部を解放することにより、ヒツジの遅延RC損傷モデルを開発し、4〜6週間後の腱に対するさまざまな修復技術の有効性を評価しました。残念なことに、この慢性的なヒツジのモデルには、2回目の外科的処置中に放出された腱の端が瘢痕組織と区別できなくなるという制限がありました25。
Colemanらは、最初の手術時に切除された腱端を合成膜で覆うことで、栄養の拡散を可能にし、損傷組織の周囲の瘢痕組織の形成を効率的に最小限に抑えながら、腱と瘢痕組織の識別を改善することで、ヒツジの慢性RC裂傷モデルも開発した26。.一方、Turnerらは、大規模な腱の収縮では直接的な再付着がめったに起こらないため、遅延修復は4週間以内に実施されるべきであると示唆した27。これらの研究は、慢性的なウサギSSC RC損傷モデルの確立を成功させるための再現性と信頼性の高いプロトコルに貢献しています。
このプロトコルでは、慢性的なウサギRC損傷モデルが4週間で確立され、線維症とFD媒介性筋萎縮に関連する病理学的変化を組織学的評価 を介して 研究できます。特に、最初の手術時にシリコーンベースのペンローズチューブを使用して筋腱接合部の自由端を包むと、2回目の手術中にRC組織を明確に識別でき、その結果、足場増強の有無にかかわらずRC治癒を研究するための安全な修復が容易になります。全体として、慢性的なウサギSSCモデルは、RC病態生理をよりよく模倣し、最小限の技術的および物流要件をもたらす可能性があります。
Protocol
すべての処置は、研究所の動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って、動物手術用に指定された適切な設備の整った部屋で、無菌手術技術を使用して実行する必要があります。本研究では、香港中文大学動物実験倫理委員会が承認したプロトコルに従ってウサギの手術が行われました。
1.外科的処置
- 手術部位を準備するには、加熱パッドを予熱し、滅菌手術用ドレープで覆い、ウサギの体温を維持します。その後、滅菌された手術器具と消耗品( 材料表で指定されているように)をレイアウトし、外科医の好みに応じて整理します。
- ニュージーランドの白ウサギ(体重3.5〜4.5 kg、生後約5〜6.5か月、この研究では2匹の雄ウサギと1匹の雌ウサギを使用)に35 mg / kgのケタミンと5 mg / kgのキシラジンの筋肉内投与 による 麻酔を誘発します。その後、足や尻尾のピンチテストで麻酔を確認します。
- 手術面を維持するために追加の麻酔が必要な場合は、耳辺縁静脈28 を介して10 mg / kgケタミンと3 mg / kgキシラジンを静脈内投与し、動物の呼吸数を5〜10分の一定の間隔で監視します。
- 手術窓を準備するには、目的の切開部位(SSC筋腱ユニットの表層の皮膚領域)を剃り、ベタジンと70%アルコールを交互に3回塗布して洗浄します。綿棒を使用して、ベタジンと70%アルコールを円を描くように(内側から外側に)塗布します。目の軟膏を使用して、ウサギの目を湿らせ、滑らかに保ちます。抗感染剤として20mg/kgのセファレキシンを筋肉内に投与する。
- 鎖骨より下方に3〜4cmの皮膚切開を行い、外科用No.11メスを使用して三角胸筋間を分割し、肩にアクセスできるように引っ込めます(図1A、B)。
- SSC筋腱ユニットを見つけるには、まず、烏口腕筋(SSC腱付着部を覆う組織として)を特定し、それを分割します。これに続いて、SSC腱を特定し、直角クランプを挿入して、上腕骨の小さい結節に挿入されたSSC腱全体を露出させます(図1C)。
- 損傷を導入する前に、SSC筋腱を分離し(図1D)、術中麻酔薬(0.2 mg / kgの0.5%ブピバカイン)を離断部位の近くに局所的に投与します。SSC筋腱ユニットをシリコンベースのペンローズチューブ(図1E)で包んで、周囲の組織への望ましくない付着を防ぎ、その後の組織回収を支援します。
- 傷害を誘発するには、外科用No.11メスを使用して筋腱接合部に全層の切断線を作成します(図1F)。必要に応じて、ガーゼで圧力をかけて出血を止め、必要に応じて生理食塩水を使用して傷口を灌漑します。
- 創傷を閉じるには、4-0ポリグリコール酸(PGA)縫合糸を使用して三角筋組織を再形成し(図1G)、4-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚の創傷を閉じます(図1H)。
- 鎮痛剤として 0.03 mg/kg ブプレノルフィンを皮下投与して術後ケアを提供します (手術直後に 1 回、次の 48 時間29 日間 1 日2回)。
- ウサギがカバー付きの加熱パッドで回復するのを待ち、柔らかい首輪を装着して、自傷行為、手術部位の舐め、縫合糸の除去などの望ましくない行動を防ぎます(図1I)。
- 動物の体重と行動の変化を監視します。体重が10%以上減少し、コントロールできない激しい痛み(眼窩の引き締め、頬の平ら化、鼻孔の形の変化、ひげの位置の変化、耳の形と位置の変化の5つの行動行動に基づいて評価)を獣医に報告し、早期安楽死などの介入が必要かどうかを判断します。
2. 標本採取
- 傷害時から4週間でウサギを安楽死させます。ウサギに麻酔をかけ、致死量のペントバルビタールナトリウム(60 mg / kg以上)を与えます。.開胸術による死亡の確認。
- 上腕骨頭を特定し、大小の結節とすべての軟部組織の付着部を維持しながら、外科的に切除します。4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで72時間固定した後、10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)の溶液に移し、室温で1ヶ月間(培地は72時間ごとに交換)して骨を脱灰します。
- 脱灰後、段階的なエタノール脱水、パラフィン包埋、組織学的切片(8 μm切片)、およびヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)およびMassonのトリクローム溶液30,31,32による染色を使用して、サンプルを標準的な組織学的処理に供します。
- 正立顕微鏡で倍率10倍の画像を撮影します。
- 選択したグラフィックデザインソフトウェアを使用して、前述のように、筋肉内の筋肉、線維組織、および脂肪の面積と割合を測定することにより、H&EおよびMassonのトリクローム画像の半定量化を実行します33,34。この例では、Adobe Photoshopソフトウェア(https://www.adobe.com)を使用しています。
- 魔法の杖ツールを使用して、特定の組織タイプを表す特定の色の領域を選択します(赤は筋肉組織、青は線維化、白は脂肪を表します)。
- メニュー項目の [選択] |逆 |選択範囲を保存 |セクションに名前を付けます。
- マークされた領域内のピクセル数を数えるには、メニュー項目 ウィンドウ |測定ログ |測定 を記録して、これらのピクセル値を記録し、選択した組織タイプのパーセンテージを手動で計算します。
3. 統計解析
- 組織学的データについては、選択した分析ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。対照群と傷害群の2つの独立した標本を比較するために、スチューデントの t検定を実行します。
- データを平均±平均の標準誤差として表します。 p 値<0.05を統計的に有意なものと考えます。
Representative Results
SSC筋腱ユニットの切断後のRC病理の慢性性を評価するために、全体的な組織形態と細胞の変化は、損傷後4週間で、肉眼的評価と組織学的分析(それぞれH&EとMassonのトリクローム染色) によって 特徴付けられました(図2、図 3、 および図4).肉眼的組織形態の代表的な画像は、損傷したSSC筋に白色脂肪様組織の出現を示しましたが、対照群には存在しませんでした(図2)。H&E染色により、筋肉の細胞性と組織の喪失が確認され、対照群と比較して損傷したSSC筋の多数の脂肪細胞(圧縮された核を含む細胞質の細い縁に囲まれた空の空間)に置き換えられました(図3A)。
H&E画像の半定量的評価では、対照群(0.69%±±0.18%)と比較して、損傷したSSC筋(36.5%8.5%)に存在する高度な筋肉内脂肪細胞が示されました(図3B)。Massonのトリクローム染色では、対照群と比較して、損傷したSSC筋の筋萎縮とコラーゲン線維の無秩序な配置も確認されました(図4A)。Massonのトリクローム画像の半定量的評価では、対照群(99.2%±±0.16%)と比較して、損傷したSSC筋(41.3%2.6%)の筋肉細胞性の低下が示されました(図4B)。さらなる半定量的評価では、損傷したSSC筋(22.3%±13.1%)と対照群(0.07%±0.05%)の間で線維化組織形成に有意差は見られませんでしたが、損傷したSSC筋では高度な線維化が観察されました(図4C)。肉眼的組織形態学と組織学的分析を合わせて、損傷したウサギSSC筋腱は、慢性RC病態生理学の既知の特徴である重度の筋萎縮、脂肪蓄積、および線維化を示すことが示されました。
図1:慢性様SSC筋腱損傷モデルの外科的処置。 (A)手術窓を作製し、触診により上腕骨、上腕骨頭、鎖骨などの解剖学的ランドマークを同定した。(B)鎖骨より下方に3.0cmの皮膚切開を行った。(C)烏口腕筋を裂き、SSC筋を露出させた。(D)SSC筋腱ユニットを単離した。(E)シリコーンベースのペンローズドレーンを使用して、SSC筋腱組織を包みました。(F)SSC筋腱を切除した。(G)烏口上腕筋は、PGA縫合糸を使用して再近似されました。(H)皮膚切開部はナイロン縫合糸を使用して閉じました。(I)手術後、ウサギには柔らかい首輪を着用させました。略語:SSC = subscapularis;PGA = ポリグリコール酸。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:代表的なSSC筋の肉眼的形態。黒い矢印は白い脂肪組織を表します。略語:SSC = subscapularis。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:4週間後の慢性様RC損傷モデルの組織学的解析。 (A)代表的なH&E染色組織像は、萎縮性筋線維と脂肪細胞の蓄積を示しました。(B)損傷した筋肉脂肪の蓄積率の定量化。n = 3匹のウサギ。エラーバーはSEMを示します。 *、統計的に有意(p≤0.05)。スケールバー = 5,000 μm(A、左カラム)、600 μm(A、右カラム)。略語:SSC = subscapularis;RC =回旋筋腱板;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:4週間後の慢性RC損傷モデルの組織学的解析。 (A)マッソンのトリクローム染色画像は、実質的な線維化を示していた。線維性結合組織は青色に染色されています。(B)筋肉と(C)線維化組織の割合の定量化。n = 3匹のウサギ。エラーバーはSEMを示します。 *、統計的に有意(p≤0.05)。スケールバー = 5,000 μm(A、左カラム)、200 μm(A、右カラム)。略語:SSC = subscapularis;RC = 回旋筋腱板。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
再現性があり、生理学的に関連性のある動物モデルは、疾患の病因の理解を深め、臨床療法の結果を評価し、外科的治療を改善し、さらに発展させる能力を提供します35。本研究では、ヒトRCの解剖学的構造と病態生理学の側面を模倣した信頼性の高い正確なウサギSSCモデルが確立されました。RC断裂は、進行性で不可逆的な筋肉の変性変化に関連しており、治癒の可能性が低下します。例えば、Koらは、ウサギSSPを6週間で再付着しても、その後の6週間で筋萎縮やFDを逆転させないことを示しました。このようなFD媒介性筋萎縮は、腱筋力や関節可動域など、いくつかの重要な臨床パラメータに影響を与え、手術結果に影響を与える可能性があります36,37。
ここで確立されたプロトコルは、SSC筋腱ユニットの切断後に有意な慢性様属性を示しました。具体的には、これらの変化には、目に見えて筋肉量の減少、脂肪含有量と線維化組織の増加が含まれます(図2、図3、および図4)。これらの所見は、ヒトのRC涙液で報告された変性変化と一致している38。近年、ラットは、肩峰38,39,40の下を移動するヒトとラットの両方のSSPと解剖学的に高い類似性があるため、RC疾患および傷害の最も集中的に研究されている動物モデルの1つとして浮上しています。しかし、ラットSSPの肩峰弓の下を通る部分は、ヒトの場合のように腱ではなく筋肉質であることに注意すべきである41。最も重要なのは、BartonらがラットのSSP腱剥離後に有意な脂肪蓄積が見られないこと23であり、これはヒトの状態42とは対照的である。そのため、ウサギSSC複合体は、ヒトの慢性RC裂傷を模倣するための適切なモデルを提供する可能性があると考えられています。
このモデルの再現性を確保するために、このプロトコルを実行する際には2つの点に注意する必要があります。まず、筋腱ユニットの離断後、切除された腱の自由端が癒着を形成するリスクがあり、その後の操作のために腱の回収が困難になる可能性があります。この問題を回避するために、非吸収性のシリコンチューブを使用して、離断後の筋腱接合部の自由端を包み込み、周囲の組織への自然癒着や自然治癒を回避しました(図1E)。さらに、介入のための第2の処置(すなわち、確実な修復を行う;データは示されていない)の間に切除された筋腱ユニットは、最初の手術時に損傷した組織の端部を包むことによって明確に識別することができる。この技術は、経済的で効果的であり、手術43において容易に実施することができる。第二に、ウサギは非常に敏感な種であり、手術後に有害な行動を示す可能性があります。このような問題を回避するには、自傷行為、手術部位の舐め、縫合糸の除去などの望ましくない行動を防ぐために、ソフトカラーも適用することを強くお勧めします(図1I)。硬質プラスチック製の市販の従来のEカラーと比較して、自作のソフトカラーは、動物福祉や科学的調査の質に影響を与える皮膚損傷やその他の副作用を引き起こしませんでした。このようなステップは、正確に再現可能なウサギRC損傷モデルを作成し、再生修復戦略を研究する可能性を提供するために重要です。
動物モデルで腱の病態生理学と治癒を研究するには、明確で再現性のある損傷を作成し、研究時点を慎重に選択する必要があります。腱の損傷と治癒に関する研究の大部分は、完全に切除された動物の腱44で行われており、切断は再現性が高く、臨床シナリオを適切にシミュレートできる単純な手順であるため45,46。Huegelらは、部分的に切除された腱の損傷は、完全に切除された腱の損傷よりも深刻ではなく、固定化は関節の硬さの増加を含む腱の力学に有害な影響を与えることを示しました47。大規模なRC裂傷の設定で見られる萎縮とFDを評価するには、実験的に観察された特徴的な時点を定義することが不可欠です。Guptaらは、雄ウサギのRC損傷モデルを検証し、2週目と6週目の時点で筋肉の萎縮を観察し、後の時点で脂肪含有量が増加し(2週間後の脂肪含有量が5%未満対6週間で10%を超える脂肪含有量)、ヒトのRC涙液で観察された病理学的プロセスと一致しています11。この研究では、雌雄のウサギのSSC筋腱ユニットを4週間切断することにより、大規模なRC裂傷が作成され、SSC筋FD(脂肪含有量36.5%)が得られました。したがって、4週間の時点は、雄と雌のニュージーランド白ウサギでSSC筋FDを生成するのに適しています。
この研究にはいくつかの限界がある。これらには以下が含まれます:(i)慢性様傷害発生のための比較的短い時間点および潜在的に炎症性材料(シリコーンベースのペンローズチューブ)など、動物モデル生成に関連するステップ。(ii)関節の運動学と筋収縮力の発生を評価するための歩行分析と筋電図検査の欠如などの動物モデルの特性評価と分析。(iii)他のRC損傷部位との比較の欠如など、動物モデルの比較。
モデル生成の観点から見ると、ヒトのRC損傷は通常、進行性の萎縮とFDを伴い、数年にわたって発生する可能性があり、これはここで報告されている4週間の時点よりも比較的長い。これは、比較的短い期間で約36.5%の筋肉内脂肪を生成する動物モデルは、ロジスティック的に便利であり、必要と思われる場合は延長できるため、許容できると見なされます。さらに、ペンローズチューブなどのシリコーンベースのインプラントの生体適合性は、細胞性免疫応答と炎症の報告により、長年の論争の原因となっています47。したがって、炎症関連のRC研究を進める場合、切除された腱を包む代わりに、ポリエチレングリコール(PEG)などの代替の不活性材料を代用することができます。
動物モデルの特性評価と分析に関しては、歩行分析49 と筋電図研究50 の欠如は、研究の結果を定性的組織学的データに制限する可能性がある。これらの態様は、肩の運動学およびRC筋のパフォーマンスに関する定量的データを生成するために、ビデオ動作解析51 および表面筋電図50 を使用することによって、将来の研究で対処され得る。
モデル比較に関しては、ウサギのSSPと棘下腱はRC研究にも広く使用されているため、将来、これらの異なる損傷部位間でFDを含む損傷の重症度を比較することで、モデルの最適化のための追加の部位が特定されます。
要約すると、この研究は、雄と雌のウサギの慢性的なRC損傷をモデル化するためのプロトコルを開発しました。このモデルは、その単純さ(離断)と、慢性性を誘発する比較的短い期間(4週間)により、研究者にとって便利です 筋肉内FDの程度(36.5%)を生成します。そのため、このプロトコルは、RC病態生理学の研究において研究者を支援し、筋腱の修復と再生のための新しい治療法の開発を促進することが期待されています。
Disclosures
著者は、宣言する競合する利害関係を持っていません。
Acknowledgments
Dai Fei Elmer Ker氏の研究は、香港特別行政区食品衛生局(Health Medical and Research Fund:08190466)、香港特別行政区イノベーション技術委員会(Tier 3 Award:ITS/090/18;Health@InnoHKプログラム)、香港研究助成評議会、香港特別行政区(早期キャリアスキーム賞:24201720および一般研究基金:14213922)、および香港中文大学(学部イノベーション賞:FIA2018/A/01)。Dan Wang氏の研究は、香港特別行政区食品衛生局(Health Medical and Research Fund, 07180686)、香港特別行政区イノベーション技術委員会(Tier 3 Award: ITS/333/18;Health@InnoHKプログラム)、および香港研究助成評議会、香港特別行政区(一般研究費:14118620および14121121)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| 4-0 Poly glycolic acid (PGA) | e-Sutures | GBK884 | |
| Toothed Adson forceps | Taobao, China | ||
| Fine scissors | Taobao, China | ||
| Hemostatic forceps | Taobao, China | ||
| Needle holders | Taobao, China | ||
| Surgical scalpel with handle | Taobao, China | No. 11 blade | |
| Suture (4-0 Nylon) | Taobao, China | 19054 | Either nylon or silk sutures are acceptable for skin closure. Each suture has its own advantages and disadvantages and users are advised to choose one according to their preference. |
| Surgical accessories | |||
| Cotton balls | Taobao, China | ||
| Gauze | Taobao, China | ||
| Razor | Taobao, China | ||
| Surgical heating pad | Taobao, China | ||
| Surgical lamp | |||
| Syringe with needles | Taobao, China | 1 mL, 5 mL, 10 mL | |
| Drugs | |||
| Buprenorphine | LASEC, CUHK | 0.12 mg/kg | |
| Bupivacaine | Sigma-Aldrich | b5274-5g | 1-2 mg/kg |
| Cephalexin | Santa Cruz Biotechnology | sc-487556 | 20 mg/kg |
| Ketamine | LASEC, CUHK | 35 mg/kg | |
| Sodium pentobarbital | LASEC, CUHK | more than 60 mg/kg | |
| Xylazine | LASEC, CUHK | 5 mg/kg | |
| Equipment | |||
| Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope | Nikon Instruments Inc, USA | ||
| Software | |||
| Adobe Photoshop 20.01 | Adobe Inc, USA | ||
| Other reagents | |||
| Betadine | Taobao, China | 5% | |
| Ethanol | Taobao, China | 70% | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | 10% |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 4% |
| Silicone tubing | Easy Thru, China | ISO13485 | |
| Saline | Taobao, China | ||
| Histological staining reagents | |||
| Eosin Stain Solution | Sigma-Aldrich | R03040 | 5% Aqueous |
| Hematoxylin Solution | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Trichrome Stain (Masson) Kit | Sigma-Aldrich | HT15 |
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