Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utvikling av en kanin kronisk-lignende rotator mansjett skade modell for studier av fibrose og muskelfett degenerasjon

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64828
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Institute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 3Center for Neuromusculoskeletal Restorative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Orthopaedics and Traumatology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Denne studien beskriver prosedyrer for å etablere en kronisk lignende kaninrotatormansjett (RC) skade. Spesielt er skaden opprettet i subscapularis (SSC) muskel-sene / myotendinøs enhet for å etterligne human RC-anatomi og patofysiologi, inkludert alvorlig muskelfettdegenerasjon (FD). Denne protokollen kan brukes til å studere RC-skader og vurdere regenerative terapier.

Abstract

Patofysiologien ved rotatormansjetten hos kanin (RC) kan føre til progressive og svært degenerative endringer i tilhørende muskulatur og sener, noe som negativt påvirker klinisk relevante parametere, som styrke og tilbaketrekning av muskel-senen/myotendinøs enhet, noe som til slutt forårsaker tap av skulderfunksjon og negativt påvirker RC-reparasjonsresultatene. Dyremodeller som etterligner aspekter av human RC-anatomi og patofysiologi er avgjørende for å fremme den konseptuelle forståelsen av skadeprogresjon og utvikle effektiv vevsteknikk og regenerativ medisinbasert terapi.

I denne sammenheng er en kanin subscapularis (SSC) modell egnet på grunn av (i) dens anatomiske likhet med den humane supraspinatus (SSP) bein-sene-muskelenheten, som er det hyppigst skadede RC-stedet; (ii) dens patofysiologiske likhet med mennesker når det gjelder fibrose og muskelfettdegenerasjon (FD); og (iii) dens evne til kirurgiske prosedyrer. Derfor er målet med denne studien å beskrive kirurgiske teknikker for å indusere SSC RC-skade. Kort fortalt innebærer prosedyren isolering av SSC ved å identifisere coracobrachialis-muskelen etterfulgt av en transeksjon i full tykkelse ved muskel-sene-krysset og innpakning av den frie enden av muskel-sene-krysset med et silikonbasert penroserør for å forhindre spontan reattachment. Histologiske evalueringer utføres for å overvåke utviklingen av muskel FD 4 uker etter operasjonen ved bruk av hematoksylin og eosin (H &E) samt Massons trikrome farging.

Tap av muskel og FD ble påvist 4 uker etter transeksjon av SSC muskel-sene-overgangen, tilsvarende humane RC patofysiologiske tilstander. Denne protokollen demonstrerer trinnene for vellykket etablering av en kronisk-lignende kanin SSC RC-skademodell, som kan tjene som et kraftig verktøy for å studere skjelettmuskulaturendringer assosiert med RC-patofysiologi og hjelpe utviklingen av nye terapeutiske strategier for kronisk-lignende RC-tårer.

Introduction

Kronisk rotator cuff (RC) tårer er preget av degenerative endringer i muskulatur og sener, inkludert atrofi av muskler, akkumulering av fettvev, og fibrose, som kan kompromittere utfallet av RC reparasjon og til slutt føre til skulder smerte og dysfunksjon 1,2,3,4,5 . For bedre å forstå RC-tårepatogenesen og forbedre kirurgiske resultater, er det avgjørende å utvikle passende dyremodeller som kan etterligne aspekter av human RC-anatomi og patofysiologi. Spesielt bør RC-skademodeller oppfylle følgende kriterier: (i) mangler spontan helbredelse etter skade; (ii) inneholder en signifikant tilstedeværelse av fibrose, muskelatrofi og akkumulering av fettvev; og (iii) være av tilstrekkelig størrelse til å tillate tilnærming av kirurgiske teknikker brukt hos mennesker6.

I denne sammenheng kan kanin subscapularis (SSC) muskelen brukes som en nøyaktig og pålitelig dyremodell for studiet av RC-patofysiologi, gitt sin unike anatomi, patofysiologiske respons og biomekaniske egenskaper7. Faktisk er kanin SSC RC-anatomi lik human supraspinatus (SSP) RC, som er muskel-seneenheten som oftest er forbundet med skade som stammer fra overforbruk 8,9. Spesielt passerer kanin SSC-senekomplekset gjennom en benete tunnel og under coracobrachialis-muskelen, som er analog med situasjonen hos mennesker hvor SSP-senekomplekset passerer gjennom den subakromiale benete tunnelen og under det korakoakromiale ligamentet7. Denne anatomiske likheten resulterer i at kanin SSC gjennomgår lignende muskel- og skjelettbevegelser som human SSP, hvor senen beveger seg under acromion under heving og bortføring av humerus 7,10.

Videre er det observert patihistologiske forandringer, tilsvarende humane RC-rifter11, hos kanin etter rift i SSC. Spesielt gjennomgår muskelmagen alvorlig FD, med et betydelig tap av muskelmasse, redusert muskelfibertverrsnittsareal og økt fett. I tillegg vurderte Otarodifard et al. de biomekaniske egenskapene til kaninen SSC etter (1) enkeltrad, (2) dobbeltrad og (3) transosseøs-ekvivalente RC-reparasjonsteknikker, og fant at de første biomekaniske egenskapene til disse reparasjonene var lik menneskelige SSP RC-reparasjoner utført i kadaveriske prøver12. Som sådan gjør den anatomiske, fysiologiske og biomekaniske likheten til kanin SSC med menneskelig SSP det nyttig for modellering av RC-skader.

Selv om mange dyrearter, inkludert rotter, mus, hunder og sauer, har blitt brukt i studiet av RC-sykdom og reparasjon 6,13,14,15, er graden av skadekronisitet et sentralt hensyn. Dette skyldes at RC-tårer kan være asymptomatiske og ofte kan diagnostiseres mye senere når riften har forstørret og blitt kronisk i naturen, med både senen og muskelen som viser alvorlig degenerasjon16,17,18. Imidlertid bruker de fleste RC-reparasjonsmodeller akutte skademodeller, der den friske senen transekteres og deretter umiddelbart repareres 19,20,21,22. Dette skjer i stor grad på grunn av logistisk hensiktsmessighet og teknisk letthet, noe som resulterer i få studier som undersøker RC-patofysiologien innenfor en kronisk lignende setting. Videre kan flere dyremodeller ha egenskaper som hindrer deres bruk for kroniske RC-studier.

For eksempel, selv om rotta har blitt mye brukt til å modellere RC-tåre og intervensjon, står mangelen på signifikant fettakkumulering etter skade i kontrast til den menneskelige tilstanden, og den lille størrelsen gjør gjentatte kirurgiske prosedyrer utfordrende23. Videre, selv om Gerber et al. brukte infraspinatus av sau for å studere muskelatrofi og FD etter kronisk RC-rive24, eksisterer det noen anatomiske ulikheter mellom sau infraspinatus og menneskelig SSP, samt mange logistiske utfordringer for å studere og huse en så stor dyremodell. I tillegg utviklet Gerber et al. en forsinket RC-skademodell hos sauer ved å frigjøre det overfladiske hodet til infraspinatusmuskelen og senen for å etterligne funksjonene til en kronisk RC-tåre, og evaluerte deretter effekten av forskjellige reparasjonsteknikker på senen ved 4 til 6 uker. Dessverre hadde denne kronisk-lignende sauemodellen en begrensning, ved at enden av den frigjorte senen ikke kunne skilles fra arrvev under det andre kirurgiske inngrepet25.

Coleman et al. utviklet også en kronisk RC-tåremodell hos sau ved å dekke den transekterte senenden med en syntetisk membran på tidspunktet for den første operasjonen, noe som tillot næringsdiffusjon og effektivt minimert arrvevsdannelse rundt det skadede vevet, samtidig som diskrimineringen mellom senen og arrvevet ble forbedret26. I mellomtiden foreslo Turner et al. at en forsinket reparasjon skulle utføres innen 4 uker, siden direkte reattachment sjelden skjer i en massiv senetilbaketrekning27. Sammen har disse studiene bidratt til reproduserbare og pålitelige protokoller for vellykket etablering av en kronisk-lignende kanin SSC RC skademodell.

I denne protokollen etableres en kronisk-lignende kanin RC-skademodell ved 4 uker, der patologiske endringer relatert til fibrose og FD-mediert muskelatrofi kan studeres via histologiske vurderinger. Spesielt innpakning av den frie enden av muskel-senekrysset ved hjelp av en silikonbasert penroseslange på tidspunktet for den første operasjonen muliggjør klar identifisering av RC-vevet under den andre kirurgiske prosedyren, og følgelig letter en sikker reparasjon for å studere RC-helbredelse med og uten stillasforstørrelse. Alt i alt kan en kronisk lignende kanin SSC-modell bedre etterligne RC-patofysiologi og stille minimale tekniske og logistiske krav.

Protocol

Alle prosedyrer må utføres ved hjelp av steril kirurgisk teknikk i et passende utstyrt rom beregnet for dyreoperasjoner i henhold til en protokoll godkjent av instituttets etiske komité for dyreforsøk. I denne studien ble kaninoperasjoner utført i samsvar med en protokoll godkjent av The Chinese University of Hong Kong Animal Experimentation Ethics Committee.

1. Kirurgisk prosedyre

  1. For å forberede det kirurgiske området, forvarm en varmepute og overlegg den med sterile kirurgiske gardiner for å opprettholde kroppstemperaturen på kaninen. Deretter legger du ut steriliserte kirurgiske verktøy og forsyninger (som angitt i materialfortegnelsen) og organiserer dem i henhold til kirurgens preferanse.
  2. Indusere anestesi via intramuskulær administrering av 35 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin til hvite kaniner fra New Zealand (som veier mellom 3,5 og 4,5 kg, ca. 5-6,5 måneder; to hannkaniner og en hunnkanin ble brukt i denne studien). Deretter bekrefter anestesi med en pote og / eller hale klype test.
  3. Hvis ytterligere anestesi er nødvendig for å opprettholde operasjonsplanet, administrer 10 mg / kg ketamin og 3 mg / kg xylazin intravenøst via den marginale ørevenen28 og overvåke dyrets pustefrekvens med jevne mellomrom på 5-10 minutter.
  4. For å forberede operasjonsvinduet, barber det tiltenkte snittstedet (hudområdet overfladisk til SSC muskel-seneenheten) og rengjør med tre vekslende påføringer av betadin og 70% alkohol. Bruk en bomullspinne for å påføre betadin og 70% alkohol i sirkulære bevegelser (fra innsiden til utsiden). Bruk øyesalve for å holde kaninens øyne fuktige og smurte. Administrer 20 mg/kg cefaleksin intramuskulært som et antiinfeksjonsmiddel.
  5. Gjør et 3-4 cm hudsnitt dårligere enn kragebenet, del deltolektoralintervallet med en kirurgisk skalpell nr. 11, og trekk inn for å få tilgang til skulderen (figur 1A,B).
  6. For å lokalisere SSC muskel-sene-enheten, identifiser først coracobrachialis-muskelen (som vev som dekker SSC-senevedlegget) og splitt den. Etter dette, identifiser SSC-senen, og sett inn en rettvinklet klemme for å eksponere hele SSC-senen ved innføringen på den mindre tuberositeten til humerus (figur 1C).
  7. Før skaden innføres, isoleres SSC-muskelsenen (figur 1D) og intraoperativ bedøvelse (0,2 mg/kg 0,5 % bupivakain) lokalt nær transseksjonsstedet. Pakk SSC muskel-sene-enheten i silikonbasert penroseslange (figur 1E) for å forhindre uønsket festing til det omkringliggende vevet og hjelpe påfølgende vevsuthenting.
  8. For å indusere skade, lag en fulltykkelsestransseksjon ved muskel-sene-overgangen ved hjelp av en kirurgisk skalpell nr. 11 (figur 1F). Stopp blødningen ved å påføre trykk med et stykke gasbind og bruk saltvann for å irrigere såret etter behov.
  9. For å lukke såret, bruk en 4-0 polyglykolsyre (PGA) sutur for å reapproximere deltoidmuskelvevet (figur 1G) og en 4-0 nylonsutur for å lukke hudsåret (figur 1H).
  10. Lever behandling etter operasjonen gjennom subkutan administrering av 0,03 mg/kg buprenorfin som smertestillende middel (én gang umiddelbart etter operasjonen og to ganger daglig de neste 48 timeneog 29).
  11. La kaninene komme seg på en tildekket varmepute og påfør en myk krage for å forhindre uønsket atferd, inkludert selvlemlestelse, slikking av operasjonssteder og fjerning av suturer (figur 1I).
  12. Overvåk dyrene for vekt- og atferdsendringer. Rapporter enhver reduksjon på mer enn 10% kroppsvekt og alvorlig smerte som ikke kan kontrolleres (vurdert basert på fem atferdshandlinger: orbital stramming, kinnflating, neseborformendringer, værhårposisjonsendringer og øreform og posisjonsendringer) til veterinæren for å avgjøre om intervensjon som tidlig avlivning er nødvendig.

2. Prøvehøsting

  1. Euthanize kaninene på 4 uker fra skadetidspunktet. Bedøv kaninene og gi en dødelig dose natriumpentobarbital (mer enn 60 mg/kg). Bekreft død ved toraktomi.
  2. Identifiser humeralhodet og øk det kirurgisk, samtidig som du beholder de større og mindre tuberklene og alle bløtvevsvedlegg. Fiks med 4 % paraformaldehyd (PFA) i 72 timer ved 4 °C før overføring til en oppløsning med 10 % etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 1 måned ved romtemperatur (med medieskift hver 72. time) for å avkalke ben.
  3. Etter avkalkning, utsett prøvene for standard histologisk behandling ved bruk av gradert etanoldehydrering, parafininnebygging, histologisk seksjonering (8 μm seksjoner) og farging med hematoksylin og eosin (H&E) og Massons trikrome løsninger30,31,32.
  4. Ta bilder med et oppreist mikroskop ved 10x forstørrelse.
  5. Utfør semi-kvantifisering av H &E og Massons trichrome-bilder ved å måle området og prosentandelen av muskler, fibrøst vev og fett i muskelen, som tidligere beskrevet33,34 ved hjelp av en grafisk designprogramvare du velger. I dette eksemplet brukes Adobe Photoshop-programvare (https://www.adobe.com).
    1. Velg et område med en bestemt farge som representerer en bestemt vevstype ved hjelp av tryllestavverktøyet (rødt er muskelvev, blått er fibrose og hvitt representerer fett).
    2. Klikk på menyelementene Velg | Omvendt | Lagre merket område | Gi seksjonen et navn.
    3. Telle antall piksler i det merkede området ved å klikke menyelementer Vindu | Målelogg | Registrer mål for å registrere disse bildepunktverdiene, og manuelt beregne prosentandelen av de valgte vevstypene.

3. Statistisk analyse

  1. For histologiske data, utfør den statistiske analysen ved hjelp av den valgte analytiske programvaren. Utfør en Student t-test for sammenligning av to uavhengige prøver mellom kontrollgruppen og den skadde gruppen.
  2. Uttrykk dataene som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet. Vurder en p-verdi på <0,05 som statistisk signifikant.

Representative Results

For å vurdere kronisiteten til RC-patologi etter transeksjon av SSC-muskel-seneenheter, ble total vevsmorfologi og cellulære forandringer karakterisert via grov evaluering og histologisk analyse (henholdsvis H&E og Massons trichrome-farging) 4 uker etter skade (figur 2, figur 3 og figur 4). Representative bilder av grov vevsmorfologi viste forekomst av hvitt fettlignende vev i skadet SSC-muskulatur, noe som manglet i kontrollgruppen (figur 2). H&E-farging bekreftet tap av muskelcellularitet og organisering, som ble erstattet med et stort antall adipocytter (tomme rom omgitt av tynne kanter av cytoplasma som inneholdt komprimerte kjerner) i skadede SSC-muskler i forhold til kontrollgruppen (figur 3A).

Semi-kvantitativ vurdering av H&E-bilder viste en høy grad av intramuskulære adipocytter tilstede i skadede SSC-muskler (36,5 % ± 8,5 %) i forhold til kontrollgruppen (0,69 % ± 0,18 %) (figur 3B). Massons trikrome farging bekreftet også muskelatrofi og uorganiserte kollagenfiberarrangementer i skadede SSC-muskler i forhold til kontrollgruppen (figur 4A). Semi-kvantitativ vurdering av Massons trichrome-bilder viste en reduksjon i muskelcellularitet for skadede SSC-muskler (41,3 % ± 2,6 %) i forhold til kontrollgruppen (99,2 % ± 0,16 %) (figur 4B). Selv om ytterligere semi-kvantitativ vurdering ikke viste noen signifikant forskjell for fibrotisk vevsdannelse mellom skadet SSC-muskulatur (22,3 % ± 13,1 %) og kontrollgruppen (0,07 % ± 0,05 %), ble det observert høy grad av fibrose i skadet SSC-muskulatur (figur 4C). Sammen viste grov vevsmorfologi og histologisk analyse at skadet kanin SSC muskelsene viste alvorlig muskelatrofi, fettakkumulering og fibrose, som er kjente kjennetegn på kronisk RC-patofysiologi.

Figure 1
Figur 1 Kirurgisk prosedyre ved kronisk-liknende SSC muskel-seneskademodell. (A) Et kirurgisk vindu ble opprettet og anatomiske landemerker som humerus, humeral hode og kragebenet ble identifisert ved palpasjon. (B) Et 3,0 cm hudsnitt ble gjort dårligere enn kragebenet. (C) Coracobrachialis muskelen ble delt for å eksponere SSC-muskelen. (D) SSC muskel-sene-enheten ble isolert. (E) Et silikonbasert penrosedren ble brukt til å pakke inn SSC-muskel-senevevet. (F) SSC-muskelsenen ble transektert. (G) Coracobrachialis-muskelen ble retilnærmet ved hjelp av PGA-suturer. (H) Hudsnittet ble lukket ved hjelp av nylonsuturer. (I) Etter operasjonen fikk kaninene en myk krage å ha på seg. Forkortelser: SSC = subscapularis; PGA = polyglykolsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Brutto morfologi av representative SSC-muskler. Svarte piler representerer hvitt fettvev. Forkortelse: SSC = subscapularis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Histologisk analyse av kronisk liknende RC-skademodell ved 4 uker. (A) Representative H&E-fargede histologibilder viste atrofiske muskelfibre og akkumulering av adipocytter. (B) Kvantifisering av skadet muskelfettakkumuleringsprosent. n = 3 kaniner. Feilfelt angir SEM. *, statistisk signifikant (s≤ 0,05). Skalastenger = 5000 μm (A, venstre kolonne), 600 μm (A, høyre kolonne). Forkortelser: SSC = subscapularis; RC = rotator mansjett; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Histologisk analyse av kronisk liknende RC-skademodell ved 4 uker. (A) Massons trikromefargede bilder viste betydelig fibrose. Fibrøst bindevev er farget blått. (B) Kvantifisering av andelen muskler og (C) fibrotisk vev. n = 3 kaniner. Feilfelt angir SEM. *, statistisk signifikant (s≤ 0,05). Skalastolper = 5000 μm (A, venstre kolonne), 200 μm (A, høyre kolonne). Forkortelser: SSC = subscapularis; RC = rotator mansjett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

En reproduserbar og fysiologisk relevant dyremodell gir muligheten til å fremme forståelsen av sykdomspatogenese, evaluere resultatene av kliniske terapier og forbedre og videreutvikle kirurgiske behandlinger35. I denne studien ble det etablert en pålitelig og nøyaktig kanin SSC-modell som etterligner aspekter av human RC-anatomi og patofysiologi. RC-rifter er relatert til progressive og sannsynligvis irreversible muskulære degenerative forandringer, noe som resulterer i redusert helbredelsespotensial. For eksempel viste Ko et al. at reattachment av kanin SSP ved 6 uker ikke reverserte muskelatrofi eller FD i de følgende 6 ukene. Slik FD-mediert muskelatrofi påvirker flere viktige kliniske parametere, inkludert senemuskelstyrke og felles bevegelsesutslag, noe som kan påvirke de kirurgiske utfallene36,37.

Protokollen som ble etablert her viste signifikante kronisk-lignende egenskaper etter transeksjonen av SSC muskel-seneenheter. Spesielt inkluderer disse endringene synlig redusert muskelmasse og økt fettinnhold og fibrotisk vev (figur 2, figur 3 og figur 4). Disse funnene stemmer overens med degenerative endringer rapportert i humane RC-rifter38. I de senere år har rotta dukket opp som en av de mest intensivt studerte dyremodellene for RC-sykdom og skade på grunn av sine høye anatomiske likheter med både menneskelige og rotte SSP som reiser under acromion38,39,40. Det skal imidlertid bemerkes at den delen av rotte SSP som passerer under den akromialbuen er muskuløs i motsetning til tendinøs, noe som er tilfelle hos mennesker41. Viktigst av alt, Barton et al. anerkjente mangel på betydelig fettakkumulering etter SSP-seneløsning hos rotter23, som står i kontrast til den menneskelige tilstanden42. Som sådan antas det at kanin SSC-komplekset kan gi en passende modell for å etterligne den kroniske RC-tåre hos mennesker.

For å sikre reproduserbarheten til denne modellen, er to punkter verdt å merke seg når du utfører denne protokollen. For det første, etter transeksjon av muskel-sene-enheter, kan den frie enden av den transekterte senen være i fare for å danne sammenvoksninger, noe som kan gjøre seneuthenting utfordrende for senere manipulasjoner. For å unngå dette problemet ble det brukt et ikke-resorberbart silikonrør for å vikle den frie enden av muskel-sene-overgangen etter transeksjon for å unngå spontan vedheft til omkringliggende vev samt spontan tilheling (figur 1E). Videre kan den transekterte muskel-sene-enheten under en annen prosedyre for intervensjon (dvs. å utføre en sikker reparasjon, data ikke vist) tydelig identifiseres ved å pakke enden av skadet vev på tidspunktet for første operasjon. Denne teknikken er økonomisk, effektiv og kan enkelt implementeres i kirurgi43. For det andre er kaniner en svært følsom art som kan utvise skadelig oppførsel etter operasjonen. For å unngå slike problemer anbefales det sterkt at en myk krage også brukes for å forhindre uønsket atferd, inkludert selvlemlestelse, slikking av operasjonssteder og fjerning av suturer (figur 1I). Sammenlignet med kommersielt konvensjonelle E-krager som er laget av stiv plast, forårsaket den selvlagde myke kragen ingen hudskader eller andre bivirkninger som påvirket dyrevelferden eller kvaliteten på vitenskapelige undersøkelser. Sammen er slike trinn avgjørende for å skape en nøyaktig reproduserbar kanin RC-skademodell og gi mulighet for å studere de regenerative reparasjonsstrategiene.

For å studere senepatofysiologi og helbredelse i en dyremodell, må det opprettes en distinkt og reproduserbar skade, og studietidspunktene må velges nøye. De aller fleste studier på seneskade og tilheling er utført på fullt transekterte dyresener44, da transeksjon er en enkel prosedyre som er svært reproduserbar og kan simulere det kliniske scenariet45,46 på en adekvat måte. Huegel et al. viste at skaden av en delvis transektert sene var mindre alvorlig enn en fullt transektert sene, og immobilisering hadde en skadelig effekt på senemekanikken, inkludert økt leddstivhet47. For å evaluere atrofi og FD som ses i innstillingen av massiv RC-tåre, er det viktig å definere de eksperimentelt observerte karakteristiske tidspunktene. Gupta et al. har validert en RC-skademodell hos hannkanin og observert muskelatrofi ved 2 og 6 ukers tidspunkter, med økt fettinnhold på senere tidspunkter (mindre enn 5% fettinnhold ved 2 uker vs. mer enn 10% fettinnhold ved 6 uker), i samsvar med den patologiske prosessen observert i humane RC-tårer11. I denne studien ble en massiv RC-rift opprettet ved transeksjon av SSC muskel-sene-enheten hos hann- og hunnkaniner i 4 uker, noe som resulterte i SSC muskel-FD (36,5% fettinnhold). Dermed er et 4 ukers tidspunkt passende for å generere SSC muskel FD hos mannlige og kvinnelige New Zealand hvite kaniner.

Det er flere begrensninger ved denne studien. Disse inkluderer: (i) trinn assosiert med generering av dyremodeller, for eksempel et relativt kort tidspunkt og potensielt inflammatoriske materialer (silikonbasert penroserør) for kronisk lignende skadegenerering; (ii) karakterisering og analyse av dyremodeller, for eksempel mangel på ganganalyse og elektromyografi for å vurdere leddkinematikk og muskelkontraktil kraftgenerering; og (iii) sammenligning av dyremodeller, for eksempel mangel på sammenligning med andre RC-skadesteder.

Når det gjelder modellgenerering, involverer menneskelige RC-skader vanligvis progressiv atrofi og FD som kan oppstå i løpet av flere år, noe som er relativt lengre enn 4-ukers tidspunktet som er rapportert her. Dette anses å være akseptabelt, siden en dyremodell som genererer rundt 36,5% intramuskulært fett på relativt kort tid vil være logistisk praktisk og kan forlenges hvis det anses nødvendig. Videre har biokompatibiliteten til silikonbaserte implantater, som penroserør, vært en kilde til langvarig kontrovers på grunn av rapporter om cellulær immunrespons og betennelse47; Derfor kan et alternativt inert materiale, som polyetylenglykol (PEG), erstattes for innpakning av resektert sene hvis man forfølger betennelsesassosierte RC-studier.

Når det gjelder karakterisering og analyse av dyremodeller, kan mangelen på ganganalyse49 og elektromyografstudier50 begrense studiens funn til kvalitative histologiske data. Disse aspektene kan tas opp i fremtidige studier ved å bruke videobevegelsesanalyse51 og overflateelektromyografi50 for å generere kvantitative data om skulderkinematikk og RC-muskelytelse.

Når det gjelder modellsammenligning, siden SSP- og infraspinatussenene hos kaninene også har blitt mye brukt til RC-studier, vil sammenligning av skadealvorlighetsgrad, inkludert FD blant disse forskjellige skadestedene i fremtiden, identifisere flere steder for modelloptimalisering.

Oppsummert har denne studien utviklet en protokoll for modellering av kronisk-lignende RC-skader hos hann- og hunnkaniner. Denne modellen er praktisk for etterforskere på grunn av sin enkelhet (transeksjon) og relativt kort periode for å indusere kronisitet (4 uker) mens den genererer en stor grad (36,5%) intramuskulær FD. Som sådan forventes denne protokollen å hjelpe etterforskere i studiet av RC-patofysiologi, samt legge til rette for utvikling av nye terapier for reparasjon og regenerering av muskelsener.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å oppgi.

Acknowledgments

Dai Fei Elmer Kers forskning støttes av finansiering fra Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK program), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 og General Research Fund: 14213922), og The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018 / A / 01). Dan Wangs forskning støttes av finansiering fra Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK program), og Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 og 14121121).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools
4-0 Poly glycolic acid (PGA) e-Sutures GBK884
Toothed Adson forceps Taobao, China
Fine scissors  Taobao, China
Hemostatic forceps Taobao, China
Needle holders Taobao, China
Surgical scalpel with handle Taobao, China No. 11 blade
Suture (4-0 Nylon) Taobao, China 19054 Either nylon or silk sutures are acceptable for skin closure. Each suture has its own advantages and disadvantages and users are advised to choose one according to their preference.
Surgical accessories
Cotton balls Taobao, China
Gauze Taobao, China
Razor Taobao, China
Surgical heating pad Taobao, China
Surgical lamp
Syringe with needles Taobao, China 1 mL, 5 mL, 10 mL
Drugs
Buprenorphine LASEC, CUHK 0.12 mg/kg
Bupivacaine Sigma-Aldrich b5274-5g 1-2 mg/kg
Cephalexin Santa Cruz Biotechnology sc-487556 20 mg/kg
Ketamine  LASEC, CUHK 35 mg/kg
Sodium pentobarbital LASEC, CUHK more than 60 mg/kg
Xylazine LASEC, CUHK 5 mg/kg
Equipment
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope Nikon Instruments Inc, USA
Software
Adobe Photoshop 20.01 Adobe Inc, USA
Other reagents 
Betadine Taobao, China 5%
Ethanol Taobao, China 70%
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS-1KG 10%
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713 4%
Silicone tubing Easy Thru, China ISO13485
Saline Taobao, China
Histological staining reagents
Eosin Stain Solution Sigma-Aldrich R03040 5% Aqueous
Hematoxylin Solution Sigma-Aldrich HHS32
Trichrome Stain (Masson) Kit Sigma-Aldrich HT15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goutallier, D., Postel, J. -M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. -C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre-and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. 304 (304), 78-83 (1994).
  2. Itoigawa, Y., Kishimoto, K. N., Sano, H., Kaneko, K., Itoi, E. Molecular mechanism of fatty degeneration in rotator cuff muscle with tendon rupture. Journal of Orthopaedic Research. 29 (6), 861-866 (2011).
  3. Mal Kim, H., et al. Relationship of tear size and location to fatty degeneration of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (4), 829-839 (2010).
  4. Melis, B., DeFranco, M. J., Chuinard, C., Walch, G. Natural history of fatty infiltration and atrophy of the supraspinatus muscle in rotator cuff tears. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468 (6), 1498-1505 (2010).
  5. Li, K., Zhang, X., Wang, D., Tuan, R. S., Ker, D. F. E. Synergistic effects of growth factor-based serum-free medium and tendon-like substrate topography on tenogenesis of mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. , 146 (2023).
  6. Derwin, K. A., Baker, A. R., Codsi, M. J., Iannotti, J. P. Assessment of the canine model of rotator cuff injury and repair. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S140-S148 (2007).
  7. Grumet, R. C., Hadley, S., Diltz, M. V., Lee, T. Q., Gupta, R. Development of a new model for rotator cuff pathology: The rabbit subscapularis muscle. Acta Orthopaedica. 80 (1), 97-103 (2009).
  8. Renström, P., Johnson, R. J. Overuse injuries in sports. Sports Medicine. 2 (5), 316-333 (1985).
  9. Hertel, R., Lambert, S. M. Supraspinatus rupture at the musculotendinous junction. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 432-435 (1998).
  10. Oh, J. H., Chung, S. W., Kim, S. H., Chung, J. Y., Kim, J. Y. Neer Award: Effect of the adipose-derived stem cell for the improvement of fatty degeneration and rotator cuff healing in rabbit model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 23 (4), 445-455 (2013).
  11. Gupta, R., Lee, T. Q. Contributions of the different rabbit models to our understanding of rotator cuff pathology. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S149-S157 (2007).
  12. Otarodifard, K., Wong, J., Preston, C. F., Tibone, J. E., Lee, T. Q. Relative fixation strength of rabbit subscapularis repair is comparable to human supraspinatus repair at time 0. Clinical Orthopaedics and Related Research. 472 (8), 2440-2447 (2014).
  13. Liu, X., Manzano, G., Kim, H. T., Feeley, B. T. A rat model of massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 588-595 (2011).
  14. Liu, X., et al. A mouse model of massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 94 (7), 41 (2012).
  15. Neer,, et al. Award 2007: Reversion of structural muscle changes caused by chronic rotator cuff tears using continuous musculotendinous traction. An experimental study in sheep. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 18 (2), 163-171 (2009).
  16. Warner, J. J., Parsons, I. M. Latissimus dorsi tendon transfer: A comparative analysis of primary and salvage reconstruction of massive, irreparable rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 10 (6), 514-521 (2001).
  17. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 86 (2), 219-224 (2004).
  18. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  19. Carpenter, J. E., Thomopoulos, S., Flanagan, C. L., DeBano, C. M., Soslowsky, L. J. Rotator cuff defect healing: A biomechanical and histologic analysis in an animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (6), 599-605 (1998).
  20. Jal Soslowsky, L., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: Role of extrinsic and overuse factors. Annals of Biomedical Engineering. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  21. Thomopoulos, S., et al. The localized expression of extracellular matrix components in healing tendon insertion sites: An in situ hybridization study. Journal of Orthopaedic Research. 20 (3), 454-463 (2002).
  22. Su, W., et al. Effect of suture absorbability on rotator cuff healing in a rabbit rotator cuff repair model. The American Journal of Sports Medicine. 46 (11), 2743-2754 (2018).
  23. Barton, E. R., Gimbel, J. A., Williams, G. R., Soslowsky, L. J. Rat supraspinatus muscle atrophy after tendon detachment. Journal of Orthopaedic Research. 23 (2), 259-265 (2005).
  24. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: An experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  25. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Perren, S. M., Nyffeler, R. W. Experimental rotator cuff repair. A preliminary study. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 81 (9), 1281-1290 (1999).
  26. Hal Coleman, S., et al. Chronic rotator cuff injury and repair model in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 85 (12), 2391-2402 (2003).
  27. Turner, A. S. Experiences with sheep as an animal model for shoulder surgery: strengths and shortcomings. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S158-S163 (2007).
  28. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder MA, Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  29. Cooper, C. S., Metcalf-Pate, K. A., Barat, C. E., Cook, J. A., Scorpio, D. G. Comparison of side effects between buprenorphine and meloxicam used postoperatively in Dutch belted rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (3), 279-285 (2009).
  30. Eal Ker, D. F., et al. Functionally graded, bone-and tendon-like polyurethane for rotator cuff repair. Advanced Functional Materials. 28 (20), 1707107 (2018).
  31. Toumi, H., et al. Regional variations in human patellar trabecular architecture and the structure of the proximal patellar tendon enthesis. Journal of Anatomy. 208 (1), 47-57 (2006).
  32. Noor, R. A. M., Shah, N. S. M., Zin, A. A. M., Sulaiman, W. A. W., Halim, A. S. Disoriented collagen fibers and disorganized, fibrotic orbicularis oris muscle fiber with mitochondrial myopathy in non-syndromic cleft lip. Archives of Oral Biology. 140, 105448 (2022).
  33. Wang, D., et al. Growth and differentiation factor-7 immobilized, mechanically strong quadrol-hexamethylene diisocyanate-methacrylic anhydride polyurethane polymer for tendon repair and regeneration. Acta Biomaterialia. 154, 108-122 (2022).
  34. Wang, D., et al. Combinatorial mechanical gradation and growth factor biopatterning strategy for spatially controlled bone-tendon-like cell differentiation and tissue formation. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
  35. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, (2016).
  36. Safran, O., Derwin, K. A., Powell, K., Iannotti, J. P. Changes in rotator cuff muscle volume, fat content, and passive mechanics after chronic detachment in a canine model. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 87 (12), 2662-2670 (2005).
  37. Gerber, C., Fuchs, B., Hodler, J. The results of repair of massive tears of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 82 (4), 505-515 (2000).
  38. Longo, U. G., Berton, A., Khan, W. S., Maffulli, N., Denaro, V. Histopathology of rotator cuff tears. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 19 (3), 227-236 (2011).
  39. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 375-380 (1998).
  40. Soslowsky, L. J., Carpenter, J. E., DeBano, C. M., Banerji, I., Moalli, M. R. Development and use of an animal model for investigations on rotator cuff disease. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 5 (5), 383-392 (1996).
  41. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. 92 (13), 2270-2778 (2010).
  42. Gladstone, J. N., Bishop, J. Y., Lo, I. K., Flatow, E. L. Fatty infiltration and atrophy of the rotator cuff do not improve after rotator cuff repair and correlate with poor functional outcome. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 719-728 (2007).
  43. Chen, W. F., Kim, B. -S., Lin, Y. -T. Penrose drain interposition-A novel approach to preventing adhesion formation after tenolysis. The Journal of Hand Surgery. Asian-Pacific Volume. 27 (1), 174-177 (2022).
  44. Lui, P. P. Y. Stem cell technology for tendon regeneration: Current status, challenges, and future research directions. Stem Cells and Cloning: Advances and Applications. 8, 163-174 (2015).
  45. Howell, K., et al. Novel model of tendon regeneration reveals distinct cell mechanisms underlying regenerative and fibrotic tendon healing. Scientific Reports. 7, 45238 (2017).
  46. Sharma, P., Maffulli, N. Tendinopathy and tendon injury: The future. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1733-1745 Forthcoming.
  47. Huegel, J., et al. Quantitative comparison of three rat models of Achilles tendon injury: A multidisciplinary approach. Journal of Biomechanics. 88, 194-200 (2019).
  48. Pal Heggers, J., et al. Biocompatibility of silicone implants. Annals of Plastic Surgery. 11 (1), 38-45 (1983).
  49. Liu, Y., et al. Evaluation of animal models and methods for assessing shoulder function after rotator cuff tear: A systematic review. Journal of Orthopaedic Translation. 26, 31-38 (2020).
  50. Disselhorst-Klug, C., Schmitz-Rode, T., Rau, G. Surface electromyography and muscle force: Limits in sEMG-force relationship and new approaches for applications. Clinical Biomechanics. 24 (3), 225-235 (2009).
  51. Kwon, D. R., Park, G. -Y., Moon, Y. S., Lee, S. C. Therapeutic effects of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells combined with polydeoxyribonucleotides on full-thickness rotator cuff tendon tear in a rabbit model. Cell Transplantation. 27 (11), 1613-1622 (2018).

Tags

Kanin kronisk-lignende rotator mansjett skade modell fibrose muskelfett degenerasjon muskulatur sener styrke tilbaketrekning muskel-sene / myotendinøs enhet skulderfunksjon RC reparasjon utfall dyremodeller human RC anatomi og patofysiologi vevsteknikk regenerativ medisin-baserte terapeutika kanin subscapularis modell human supraspinatus bein-sene-muskel enhet fibrose og muskelfett degenerasjon (FD) kirurgiske prosedyrer isolering av SSC Coracobrachialis muskel Transeksjon i full tykkelse silikonbasert penroserør histologisk evaluering
Utvikling av en kanin kronisk-lignende rotator mansjett skade modell for studier av fibrose og muskelfett degenerasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. … More

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. F. E. Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64828, doi:10.3791/64828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter