Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ontwikkeling van een chronisch model voor rotator cuff-letsel bij konijnen voor de studie van fibrose en spierdegeneratie

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64828
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Institute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 3Center for Neuromusculoskeletal Restorative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Orthopaedics and Traumatology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Deze studie beschrijft procedures voor het vaststellen van een chronisch vergelijkbaar letsel aan de rotator cuff (RC) van konijnen. In het bijzonder wordt de verwonding gecreëerd in de subscapularis (SSC) spierpees/myotendineuze eenheid om de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie na te bootsen, inclusief ernstige spiervetdegeneratie (FD). Dit protocol kan worden toegepast om RC-letsels te bestuderen en regeneratieve therapieën te beoordelen.

Abstract

De pathofysiologie van de rotator cuff (RC) van konijnen kan leiden tot progressieve en zeer degeneratieve veranderingen in de bijbehorende musculatuur en pezen, wat een negatieve invloed heeft op klinisch relevante parameters, zoals kracht en terugtrekking van de spier-pees/myotendineuze eenheid, wat uiteindelijk leidt tot verlies van schouderfunctie en een negatieve invloed heeft op de resultaten van RC-herstel. Diermodellen die aspecten van de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie nabootsen, zijn cruciaal voor het bevorderen van het conceptuele begrip van de progressie van letsel en het ontwikkelen van effectieve weefselmanipulatie en op regeneratieve geneeskunde gebaseerde therapieën.

Binnen deze context is een rabbit subscapularis (SSC)-model geschikt vanwege (i) de anatomische gelijkenis met de menselijke supraspinatus (SSP) bot-pees-spiereenheid, de meest gewonde RC-plaats; ii) de pathofysiologische gelijkenis met de mens in termen van fibrose en spiervetdegeneratie (FD); en (iii) de geschiktheid voor chirurgische ingrepen. Daarom is het doel van deze studie om de chirurgische technieken voor het induceren van SSC RC-letsel te beschrijven. Kort gezegd omvat de procedure de isolatie van de SSC door de coracobrachialis-spier te identificeren, gevolgd door een transsectie over de volledige dikte bij de spier-peesovergang en het vrije uiteinde van de spier-peesovergang te omwikkelen met een penrose-slang op siliconenbasis om spontane herbevestiging te voorkomen. Histologische evaluaties worden uitgevoerd om de progressie van spier-FD 4 weken na de operatie te volgen met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) en de trichrome kleuring van Masson.

Verlies van spieren en FD waren duidelijk 4 weken na transsectie van de SSC-spier-peesovergang, vergelijkbaar met pathofysiologische omstandigheden bij de mens. Dit protocol demonstreert de stappen voor het succesvol opzetten van een chronisch-achtig SSC RC-letselmodel voor konijnen, dat kan dienen als een krachtig hulpmiddel om skeletspierveranderingen geassocieerd met RC-pathofysiologie te bestuderen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor chronisch-achtige RC-tranen te ondersteunen.

Introduction

Chronische scheuren in de rotator cuff (RC) worden gekenmerkt door degeneratieve veranderingen in spieren en pezen, waaronder atrofie van spieren, ophoping van vetweefsel en fibrose, wat de uitkomst van RC-herstel in gevaar kan brengen en uiteindelijk schouderpijn en disfunctie kan veroorzaken 1,2,3,4,5 . Om de pathogenese van RC-scheuren beter te begrijpen en de chirurgische resultaten te verbeteren, is het van cruciaal belang om geschikte diermodellen te ontwikkelen die aspecten van de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie kunnen nabootsen. In het bijzonder moeten RC-letselmodellen aan de volgende criteria voldoen: (i) geen spontane genezing na letsel; ii) een significante aanwezigheid van fibrose, spieratrofie en ophoping van vetweefsel bevatten; en iii) voldoende groot zijn om de chirurgische technieken die bij de mens worden gebruikt te kunnen benaderen6.

Binnen deze context kan de musculus van het konijn subscapularis (SSC) worden gebruikt als een nauwkeurig en betrouwbaar diermodel voor de studie van RC-pathofysiologie, gezien zijn unieke anatomie, pathofysiologische respons en biomechanische eigenschappen7. De anatomie van de SSC RC van konijnen is inderdaad vergelijkbaar met de menselijke supraspinatus (SSP) RC, de spier-peeseenheid die het vaakst wordt geassocieerd met letsel als gevolg van overmatig gebruik 8,9. In het bijzonder gaat het SSC-peescomplex van het konijn door een benige tunnel en onder de musculus coracobrachialis, wat analoog is aan de situatie bij mensen waarbij het SSP-peescomplex door de subacromiale benige tunnel en onder het coracoacromiale ligament7 gaat. Deze anatomische gelijkenis leidt ertoe dat de SSC van het konijn vergelijkbare musculoskeletale bewegingen ondergaat als de menselijke SSP, waarbij de pees onder het acromion beweegt tijdens het optillen en abducteren van het opperarmbeen 7,10.

Bovendien zijn pathohistologische veranderingen, vergelijkbaar met menselijke RC-tranen11, waargenomen bij het konijn na SSC-scheur. In het bijzonder ondergaat de spierbuik ernstige FD, met een aanzienlijk verlies van spiermassa, een verminderd spiervezelgebied in dwarsdoorsnede en een verhoogde adipositas. Bovendien beoordeelden Otarodifard et al. de biomechanische kenmerken van de SSC van het konijn na (1) enkelrijige, (2) dubbele rij en (3) transossale-equivalente RC-reparatietechnieken, en ontdekten dat de initiële biomechanische kenmerken van deze reparaties vergelijkbaar waren met menselijke SSP RC-reparaties uitgevoerd in kadaverspecimens12. Als zodanig maakt de anatomische, fysiologische en biomechanische gelijkenis van konijnen-SSC met menselijke SSP het nuttig voor het modelleren van RC-verwondingen.

Hoewel veel diersoorten, waaronder ratten, muizen, honden en schapen, zijn gebruikt bij de studie van RC-ziekte en -herstel 6,13,14,15, is de mate van chroniciteit van letsel een belangrijke overweging. Dit komt omdat RC-tranen asymptomatisch kunnen zijn en vaak veel later kunnen worden gediagnosticeerd wanneer de scheur is vergroot en chronisch van aard is geworden, waarbij zowel de pees als de spier ernstige degeneratie vertonen16,17,18. De meeste RC-reparatiemodellen maken echter gebruik van acute blessuremodellen, waarbij de gezonde pees wordt doorgesneden en vervolgens onmiddellijk wordt gerepareerd 19,20,21,22. Dit gebeurt grotendeels om redenen van logistieke opportuniteit en technisch gemak, wat resulteert in weinig studies die de pathofysiologie van RC onderzoeken binnen een chronisch-achtige setting. Bovendien kunnen verschillende diermodellen eigenschappen bezitten die het gebruik ervan voor chronische RC-studies belemmeren.

Hoewel de rat bijvoorbeeld op grote schaal is gebruikt om RC-scheuren en -interventies te modelleren, staat het ontbreken van significante vetophoping na letsel in contrast met de menselijke conditie, en zijn kleine formaat maakt herhaalde chirurgische ingrepen een uitdaging23. Verder, hoewel Gerber et al. de infraspinatus van schapen gebruikten om spieratrofie en FD na chronische RC-scheur24 te bestuderen, bestaat er enige anatomische ongelijkheid tussen de infraspinatus van schapen en menselijke SSP, evenals tal van logistieke uitdagingen voor het bestuderen en huisvesten van zo'n groot diermodel. Daarnaast ontwikkelden Gerber et al. een vertraagd RC-letselmodel bij schapen door de oppervlakkige kop van de infraspinatus-spier en -pees los te laten om de kenmerken van een chronische RC-scheur na te bootsen, en evalueerden vervolgens de werkzaamheid van verschillende reparatietechnieken op de pees na 4 tot 6 weken. Helaas had dit chronisch aandoende schapenmodel een beperking, in die zin dat het uiteinde van de losgelaten pees tijdens de tweede chirurgische ingreep niet meer te onderscheiden was van littekenweefsel25.

Coleman et al. ontwikkelden ook een chronisch RC-scheurmodel bij schapen door het doorgesneden peesuiteinde te bedekken met een synthetisch membraan op het moment van de eerste operatie, wat diffusie van voedingsstoffen mogelijk maakte en de vorming van littekenweefsel rond het gewonde weefsel efficiënt minimaliseerde, terwijl de discriminatie tussen de pees en het littekenweefsel werd verbeterd26. Ondertussen suggereerden Turner et al. dat een uitgestelde reparatie binnen 4 weken moet worden uitgevoerd, aangezien directe herbevestiging zelden gebeurt bij een massale peesretractie27. Samen hebben deze studies bijgedragen aan reproduceerbare en betrouwbare protocollen voor de succesvolle oprichting van een chronisch-achtig SSC RC-letselmodel voor konijnen.

In dit protocol wordt een chronisch-achtig RC-letselmodel bij konijnen vastgesteld na 4 weken, waarin pathologische veranderingen gerelateerd aan fibrose en FD-gemedieerde spieratrofie kunnen worden bestudeerd via histologische beoordelingen. Met name het omwikkelen van het vrije uiteinde van de spier-peesovergang met behulp van een penroseslang op siliconenbasis op het moment van de eerste operatie maakt een duidelijke identificatie van de RC-weefsels mogelijk tijdens de tweede chirurgische ingreep en vergemakkelijkt bijgevolg een veilige reparatie om RC-genezing te bestuderen met en zonder steigervergroting. Al met al kan een chronisch-achtig SSC-model voor konijnen de pathofysiologie van RC beter nabootsen en minimale technische en logistieke vereisten stellen.

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van een steriele chirurgische techniek in een goed uitgeruste ruimte die is aangewezen voor dieroperaties volgens een protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van het instituut. In de huidige studie werden konijnenoperaties uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door de Chinese University of Hong Kong Animal Experimentation Ethics Committee.

1. Chirurgische ingreep

  1. Om het operatiegebied voor te bereiden, verwarmt u een verwarmingskussen voor en bedekt u het met steriele operatiegordijnen om de lichaamstemperatuur van het konijn op peil te houden. Leg vervolgens gesteriliseerde chirurgische instrumenten en benodigdheden neer (zoals gespecificeerd in de materiaaltabel) en organiseer ze volgens de voorkeur van de chirurg.
  2. Induceren van anesthesie via intramusculaire toediening van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine aan Nieuw-Zeelandse witte konijnen (met een gewicht tussen 3,5 en 4,5 kg, ongeveer 5-6,5 maanden oud; in dit onderzoek werden twee mannelijke en één vrouwelijke konijnen gebruikt). Bevestig vervolgens de anesthesie met een poot- en/of staartknijptest.
  3. Als aanvullende anesthesie nodig is om het operatievlak te ondersteunen, dien dan 10 mg/kg ketamine en 3 mg/kg xylazine intraveneus toe via de marginale oorader28 en controleer de ademhalingsfrequentie van het dier met regelmatige tussenpozen van 5-10 minuten.
  4. Om het operatievenster voor te bereiden, scheert u de beoogde incisieplaats (het huidgebied dat oppervlakkig is ten opzichte van de SSC-spier-peeseenheid) en reinigt u met drie afwisselende toepassingen van betadine en 70% alcohol. Gebruik een wattenstaafje om betadine en 70% alcohol in cirkelvormige bewegingen (van binnen naar buiten) aan te brengen. Gebruik oogzalf om de ogen van het konijn vochtig en gesmeerd te houden. Dien 20 mg/kg cefalexine intramusculair toe als anti-infectieus middel.
  5. Maak een huidincisie van 3-4 cm die inferieur is aan het sleutelbeen, splits het deltopectorale interval met een chirurgisch scalpel nr. 11 en trek het terug om toegang te krijgen tot de schouder (Figuur 1A,B).
  6. Om de SSC-spierpeeseenheid te lokaliseren, identificeert u eerst de coracobrachialis-spier (als weefsel dat de SSC-peesaanhechting bedekt) en splitst u deze. Identificeer vervolgens de SSC-pees en plaats een haakse klem om de hele SSC-pees bloot te leggen bij het inbrengen op de kleinere tuberositas van het opperarmbeen (Figuur 1C).
  7. Isoleer de SSC-spierpees (Figuur 1D) en dien intraoperatieve verdoving (0,2 mg/kg 0,5% bupivacaïne) lokaal toe in de buurt van de transsectieplaats voordat u het letsel inbrengt. Wikkel de SSC-spierpeeseenheid in penroseslangen op siliconenbasis (Figuur 1E) om ongewenste hechting aan de omliggende weefsels te voorkomen en het daaropvolgende ophalen van weefsel te vergemakkelijken.
  8. Om letsel te veroorzaken, maakt u een doorsnede over de volledige dikte bij de spier-peesovergang met behulp van een chirurgisch scalpel nr. 11 (Figuur 1F). Stop waar nodig het bloeden door druk uit te oefenen met een gaasje en gebruik indien nodig zoutoplossing om de wond te irrigeren.
  9. Om de wond te sluiten, gebruikt u een 4-0 polyglycolzuur (PGA) hechting om het deltaspierweefsel opnieuw te benaderen (Figuur 1G) en een 4-0 nylon hechting om de huidwond te sluiten (Figuur 1H).
  10. Bied postoperatieve zorg door subcutane toediening van 0,03 mg/kg buprenorfine als pijnstiller (eenmaal direct na de operatie en tweemaal daags gedurende de volgende 48 uur29).
  11. Laat de konijnen herstellen op een afgedekt verwarmingskussen en breng een zachte halsband aan om ongewenst gedrag te voorkomen, waaronder zelfverminking, likken van operatieplaatsen en verwijderen van hechtingen (Figuur 1I).
  12. Houd de dieren in de gaten op gewichts- en gedragsveranderingen. Meld elke afname van meer dan 10% lichaamsgewicht en ernstige pijn die niet onder controle kan worden gehouden (beoordeeld op basis van vijf gedragsacties: orbitale verstrakking, afvlakking van de wangen, veranderingen in de vorm van het neusgat, veranderingen in de positie van de snorharen en veranderingen in de vorm en positie van het oor) aan de dierenarts om te bepalen of interventie zoals vroege euthanasie nodig is.

2. Specimen oogst

  1. Euthanaseer de konijnen na 4 weken vanaf het moment van verwonding. Verdoof de konijnen en geef een dodelijke dosis natriumpentobarbital (meer dan 60 mg/kg). Bevestig de dood door thoracotomie.
  2. Identificeer de humeruskop en snijd deze operatief weg, met behoud van de grote en kleine knobbeltjes en alle aanhechtingen van zacht weefsel. Fixeer met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 72 uur bij 4 °C alvorens over te brengen naar een oplossing van 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gedurende 1 maand bij kamertemperatuur (met mediawissel om de 72 uur) om het bot te ontkalken.
  3. Onderwerp de monsters na ontkalking aan standaard histologische verwerking met behulp van graduele ethanoldehydratie, paraffine-inbedding, histologische doorsnede (8 μm-secties) en kleuring met hematoxyline en eosine (H&E) en Masson's trichrome oplossingen30,31,32.
  4. Leg beelden vast met een rechtopstaande microscoop met een vergroting van 10x.
  5. Voer semi-kwantificering uit van de H&E- en Masson's trichrome beelden door de oppervlakte en het percentage spieren, vezelig weefsel en vet in de spier te meten, zoals eerder beschreven33,34 met behulp van grafische ontwerpsoftware naar keuze. In dit voorbeeld wordt Adobe Photoshop-software (https://www.adobe.com) gebruikt.
    1. Selecteer een gebied met een bepaalde kleur dat een bepaald weefseltype vertegenwoordigt met behulp van de toverstaf (rood is spierweefsel, blauw is fibrose en wit staat voor vet).
    2. Klik op de menu-items Selecteren | Omkeren | Selectie opslaan | Geef de sectie een naam.
    3. Tel het aantal pixels binnen het gemarkeerde gebied door te klikken op menu-items Venster | Meting Logboek | Meting opnemen om deze pixelwaarden vast te leggen en handmatig het percentage van de geselecteerde weefseltypen te berekenen.

3. Statistische analyse

  1. Voor histologische gegevens voert u de statistische analyse uit met behulp van de analytische software van uw keuze. Voer een t-toets van een student uit voor de vergelijking van twee onafhankelijke steekproeven tussen de controlegroep en de geblesseerde groep.
  2. Druk de gegevens uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Beschouw een p-waarde van <0,05 als statistisch significant.

Representative Results

Om de chroniciteit van RC-pathologie na de transsectie van SSC-spierpeeseenheden te beoordelen, werden de algehele weefselmorfologie en cellulaire veranderingen gekarakteriseerd via grove evaluatie en histologische analyse (respectievelijk H&E en Masson's trichrome kleuring), 4 weken na de blessure (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4). Representatieve beelden van de morfologie van grof weefsel toonden het verschijnen van wit vetachtig weefsel in gewonde SSC-spieren, dat afwezig was in de controlegroep (Figuur 2). H&E-kleuring bevestigde verlies van spiercellulariteit en -organisatie, dat werd vervangen door grote aantallen adipocyten (lege ruimtes omgeven door dunne randen van cytoplasma die samengedrukte kernen bevatten) in gewonde SSC-spieren ten opzichte van de controlegroep (Figuur 3A).

Semi-kwantitatieve beoordeling van H&E-beelden toonde een hoge mate van intramusculaire adipocyten in geblesseerde SSC-spieren (36,5% ± 8,5%) in vergelijking met de controlegroep (0,69% ± 0,18%) (Figuur 3B). De trichrome kleuring van Masson bevestigde ook spieratrofie en ongeorganiseerde collageenvezelarrangementen in geblesseerde SSC-spieren ten opzichte van de controlegroep (Figuur 4A). Semi-kwantitatieve beoordeling van de trichrome beelden van Masson toonde een vermindering van de spiercellulariteit voor geblesseerde SSC-spieren (41,3% ± 2,6%) ten opzichte van de controlegroep (99,2% ± 0,16%) (Figuur 4B). Hoewel verdere semi-kwantitatieve beoordeling geen significant verschil liet zien voor de vorming van fibrotisch weefsel tussen gewonde SSC-spieren (22,3% ± 13,1%) en de controlegroep (0,07% ± 0,05%), werd een hoge mate van fibrose waargenomen in geblesseerde SSC-spieren (Figuur 4C). Samen toonden grove weefselmorfologie en histologische analyse aan dat gewonde SSC-spierpees van konijnen ernstige spieratrofie, vetophoping en fibrose vertoonde, die bekende kenmerken zijn van chronische RC-pathofysiologie.

Figure 1
Figuur 1: Chirurgische ingreep voor chronisch-achtig SSC spier-peesblessuremodel. (A) Er werd een chirurgisch venster gemaakt en anatomische oriëntatiepunten zoals het opperarmbeen, de humeruskop en het sleutelbeen werden geïdentificeerd door palpatie. (B) Een incisie in de huid van 3,0 cm werd inferieur gemaakt aan het sleutelbeen. (C) De musculus coracobrachialis werd gespleten om de SSC-spier bloot te leggen. (D) De SSC-spierpeeseenheid werd geïsoleerd. (E) Een penrosedrain op siliconenbasis werd gebruikt om het SSC-spier-peesweefsel in te pakken. (F) De SSC-spierpees werd doorsneden. (G) De musculus coracobrachialis werd opnieuw benaderd met behulp van PGA-hechtingen. (H) De huidincisie werd gesloten met nylon hechtingen. (I) Na de operatie kregen de konijnen een zachte halsband om te dragen. Afkortingen: SSC = subscapularis; PGA = polyglycolzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Bruto morfologie van representatieve SSC-spieren. Zwarte pijlen staan voor wit vetweefsel. Afkorting: SSC = subscapularis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Histologische analyse van chronisch-achtig RC-letselmodel na 4 weken. (A) Representatieve H&E-gekleurde histologiebeelden toonden atrofische spiervezels en accumulatie van adipocyten. (B) Kwantificering van het accumulatiepercentage van geblesseerd spiervet. n = 3 konijnen. Foutbalken geven SEM aan. *, statistisch significant (p≤ 0,05). Schaalbalken = 5.000 μm (A, linkerkolom), 600 μm (A, rechterkolom). Afkortingen: SSC = subscapularis; RC = rotator manchet; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Histologische analyse van chronisch-achtig RC-letselmodel na 4 weken. (A) De trichroom gekleurde beelden van Masson toonden substantiële fibrose. Vezelig bindweefsel is blauw gekleurd. (B) Kwantificering van het aandeel spierweefsel en (C) fibrotisch weefsel. n = 3 konijnen. Foutbalken geven SEM aan. *, statistisch significant (p≤ 0,05). Schaalbalken = 5.000 μm (A, linkerkolom), 200 μm (A, rechterkolom). Afkortingen: SSC = subscapularis; RC = rotator manchet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Een reproduceerbaar en fysiologisch relevant diermodel biedt de mogelijkheid om het begrip van de pathogenese van ziekten te vergroten, de resultaten van klinische therapieën te evalueren en chirurgische behandelingen te verbeteren en verder te ontwikkelen35. In deze studie werd een betrouwbaar en nauwkeurig SSC-model voor konijnen vastgesteld dat aspecten van de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie nabootst. RC-tranen zijn gerelateerd aan progressieve en waarschijnlijk onomkeerbare spierdegeneratieve veranderingen, wat resulteert in een verminderd genezingspotentieel. Ko et al. toonden bijvoorbeeld aan dat de hernieuwde hechting van konijnen-SSP na 6 weken de spieratrofie of FD in de volgende 6 weken niet omkeerde. Dergelijke FD-gemedieerde spieratrofie beïnvloedt verschillende belangrijke klinische parameters, waaronder peesspierkracht en gewrichtsbewegingsbereik, die de chirurgische resultaten kunnen beïnvloeden36,37.

Het hier vastgestelde protocol vertoonde significante chronisch-achtige kenmerken na de doorsnede van SSC-spierpeeseenheden. In het bijzonder omvatten deze veranderingen een zichtbaar verminderde spiermassa en een verhoogd vetgehalte en fibrotisch weefsel (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4). Deze bevindingen komen overeen met degeneratieve veranderingen die zijn gerapporteerd in menselijke RC-tranen38. In de afgelopen jaren is de rat naar voren gekomen als een van de meest intensief bestudeerde diermodellen voor RC-ziekte en -letsel vanwege de hoge anatomische overeenkomsten met zowel menselijke als rat SSP's die onder het acromion38,39,40 reizen. Er moet echter worden opgemerkt dat het deel van de SSP van de rat dat onder de acromiale boog doorgaat, gespierd is in tegenstelling tot peesvormig, wat het geval is bij mensen41. Het belangrijkste is dat Barton et al. een gebrek aan significante vetophoping herkenden na SSP-peesloslating bij ratten23, wat in contrast staat met de menselijke conditie42. Als zodanig wordt aangenomen dat het SSC-complex van het konijn een geschikt model kan bieden om de chronische RC-scheur van mensen na te bootsen.

Om de reproduceerbaarheid van dit model te garanderen, zijn twee punten het vermelden waard bij het uitvoeren van dit protocol. Ten eerste kan na de doorsnede van spier-peeseenheden het vrije uiteinde van de doorgesneden pees het risico lopen verklevingen te vormen, waardoor het ophalen van de pees moeilijk kan worden voor latere manipulaties. Om dit probleem te voorkomen, werd een niet-resorbeerbare siliconenslang gebruikt om het vrije uiteinde van de spier-peesovergang na doorsnede te omwikkelen om spontane adhesie aan omliggende weefsels en spontane genezing te voorkomen (Figuur 1E). Verder kan de doorgesneden spier-peeseenheid tijdens een tweede interventieprocedure (d.w.z. om een veilige reparatie uit te voeren; gegevens niet getoond) duidelijk worden geïdentificeerd door het uiteinde van gewonde weefsels in te pakken op het moment van de eerste operatie. Deze techniek is economisch, effectief en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in de chirurgie43. Ten tweede zijn konijnen een zeer gevoelige soort die na een operatie schadelijk gedrag kan vertonen. Om dergelijke problemen te voorkomen, wordt het ten zeerste aanbevolen om ook een zachte kraag aan te brengen om ongewenst gedrag te voorkomen, waaronder zelfverminking, likken van operatieplaatsen en verwijderen van hechtingen (Figuur 1I). In vergelijking met commercieel conventionele E-halsbanden die zijn gemaakt van hard plastic, veroorzaakte de zelfgemaakte zachte halsband geen huidletsel of andere bijwerkingen die het dierenwelzijn of de kwaliteit van wetenschappelijk onderzoek beïnvloedden. Samen zijn dergelijke stappen van cruciaal belang om een nauwkeurig reproduceerbaar RC-verwondingsmodel voor konijnen te creëren en de mogelijkheid te bieden om de regeneratieve reparatiestrategieën te bestuderen.

Om de pathofysiologie en genezing van pezen in een diermodel te bestuderen, moet een duidelijk en reproduceerbaar letsel worden gecreëerd en moeten de studietijdstippen zorgvuldig worden geselecteerd. De overgrote meerderheid van de onderzoeken naar peesletsel en genezing is uitgevoerd op volledig doorgesneden pezenvan dieren 44, aangezien transsectie een eenvoudige procedure is die zeer reproduceerbaar is en het klinische scenario adequaat kan simuleren45,46. Huegel et al. toonden aan dat de verwonding van een gedeeltelijk doorgesneden pees minder ernstig was dan die van een volledig doorgesneden pees, en immobilisatie had een nadelig effect op de peesmechanica, waaronder verhoogde gewrichtsstijfheid47. Om de atrofie en FD te evalueren die wordt gezien in de setting van massieve RC-scheur, is het essentieel om de experimenteel waargenomen karakteristieke tijdstippen te definiëren. Gupta et al. hebben een RC-verwondingsmodel gevalideerd bij het mannelijke konijn en spieratrofie waargenomen op tijdstippen van 2 en 6 weken, met een verhoogd vetgehalte op latere tijdstippen (minder dan 5% vetgehalte na 2 weken versus meer dan 10% vetgehalte na 6 weken), consistent met het pathologische proces dat wordt waargenomen bij menselijke RC-tranen11. In deze studie werd een enorme RC-scheur gecreëerd door transsectie van de SSC-spier-peeseenheid bij mannelijke en vrouwelijke konijnen gedurende 4 weken, wat resulteerde in SSC-spier FD (36,5% vetgehalte). Een tijdspunt van 4 weken is dus geschikt voor het genereren van SSC-spier FD bij mannelijke en vrouwelijke witte konijnen uit Nieuw-Zeeland.

Er zijn verschillende beperkingen aan deze studie. Deze omvatten: (i) stappen die verband houden met het genereren van diermodellen, zoals een relatief kort tijdspunt en mogelijk inflammatoire materialen (penroseslangen op siliconenbasis) voor het genereren van chronisch letsel; ii) karakterisering en analyse van diermodellen, zoals het ontbreken van loopanalyse en elektromyografie om de kinematica van de gewrichten en de contractiele krachtopwekking van de spieren te beoordelen; en (iii) vergelijking van diermodellen, zoals het ontbreken van vergelijking met andere RC-verwondingslocaties.

In termen van modelgeneratie gaat het bij menselijke RC-letsels meestal om progressieve atrofie en FD die over een periode van meerdere jaren kunnen optreden, wat relatief langer is dan het hier gerapporteerde tijdspunt van 4 weken. Dit wordt acceptabel geacht, aangezien een diermodel dat in relatief korte tijd ongeveer 36,5% intramusculair vet genereert, logistiek handig zal zijn en indien nodig kan worden verlengd. Bovendien is de biocompatibiliteit van implantaten op siliconenbasis, zoals penrose-slangen, een bron van langdurige controverse geweest vanwege meldingen van cellulaire immuunrespons en ontsteking47; daarom kan een alternatief inert materiaal, zoals polyethyleenglycol (PEG), worden vervangen door het omwikkelen van de gereseceerde pees als ontstekingsgerelateerde RC-onderzoeken worden uitgevoerd.

Wat de karakterisering en analyse van diermodellen betreft, kan het ontbreken van loopanalyse49 en elektromyograafstudies50 de bevindingen van het onderzoek beperken tot kwalitatieve histologische gegevens. Deze aspecten kunnen in toekomstige studies worden aangepakt door gebruik te maken van videobewegingsanalyse51 en oppervlakte-elektromyografie50 om kwantitatieve gegevens te genereren over schouderkinematica en RC-spierprestaties.

In termen van modelvergelijking, aangezien de SSP- en infraspinatus-pezen bij konijnen ook op grote schaal zijn gebruikt voor RC-studies, zal het vergelijken van de ernst van de verwonding, inclusief FD tussen deze verschillende letselplaatsen in de toekomst, aanvullende plaatsen identificeren voor modeloptimalisatie.

Samenvattend heeft deze studie een protocol ontwikkeld voor het modelleren van chronisch-achtige RC-verwondingen bij mannelijke en vrouwelijke konijnen. Dit model is handig voor onderzoekers vanwege de eenvoud (transsectie) en de relatief korte periode om chroniciteit te induceren (4 weken) en tegelijkertijd een grote mate (36,5%) van intramusculaire FD te genereren. Als zodanig wordt verwacht dat dit protocol onderzoekers zal helpen bij de studie van RC-pathofysiologie, en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor spier-peesherstel en -regeneratie zal vergemakkelijken.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te melden.

Acknowledgments

Het onderzoek van Dai Fei Elmer Ker wordt ondersteund door financiering van het Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK programma), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 and General Research Fund: 14213922) en The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Het onderzoek van Dan Wang wordt ondersteund door financiering van het Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK programma) en Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 en 14121121).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools
4-0 Poly glycolic acid (PGA) e-Sutures GBK884
Toothed Adson forceps Taobao, China
Fine scissors  Taobao, China
Hemostatic forceps Taobao, China
Needle holders Taobao, China
Surgical scalpel with handle Taobao, China No. 11 blade
Suture (4-0 Nylon) Taobao, China 19054 Either nylon or silk sutures are acceptable for skin closure. Each suture has its own advantages and disadvantages and users are advised to choose one according to their preference.
Surgical accessories
Cotton balls Taobao, China
Gauze Taobao, China
Razor Taobao, China
Surgical heating pad Taobao, China
Surgical lamp
Syringe with needles Taobao, China 1 mL, 5 mL, 10 mL
Drugs
Buprenorphine LASEC, CUHK 0.12 mg/kg
Bupivacaine Sigma-Aldrich b5274-5g 1-2 mg/kg
Cephalexin Santa Cruz Biotechnology sc-487556 20 mg/kg
Ketamine  LASEC, CUHK 35 mg/kg
Sodium pentobarbital LASEC, CUHK more than 60 mg/kg
Xylazine LASEC, CUHK 5 mg/kg
Equipment
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope Nikon Instruments Inc, USA
Software
Adobe Photoshop 20.01 Adobe Inc, USA
Other reagents 
Betadine Taobao, China 5%
Ethanol Taobao, China 70%
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS-1KG 10%
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713 4%
Silicone tubing Easy Thru, China ISO13485
Saline Taobao, China
Histological staining reagents
Eosin Stain Solution Sigma-Aldrich R03040 5% Aqueous
Hematoxylin Solution Sigma-Aldrich HHS32
Trichrome Stain (Masson) Kit Sigma-Aldrich HT15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goutallier, D., Postel, J. -M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. -C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre-and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. 304 (304), 78-83 (1994).
  2. Itoigawa, Y., Kishimoto, K. N., Sano, H., Kaneko, K., Itoi, E. Molecular mechanism of fatty degeneration in rotator cuff muscle with tendon rupture. Journal of Orthopaedic Research. 29 (6), 861-866 (2011).
  3. Mal Kim, H., et al. Relationship of tear size and location to fatty degeneration of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (4), 829-839 (2010).
  4. Melis, B., DeFranco, M. J., Chuinard, C., Walch, G. Natural history of fatty infiltration and atrophy of the supraspinatus muscle in rotator cuff tears. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468 (6), 1498-1505 (2010).
  5. Li, K., Zhang, X., Wang, D., Tuan, R. S., Ker, D. F. E. Synergistic effects of growth factor-based serum-free medium and tendon-like substrate topography on tenogenesis of mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. , 146 (2023).
  6. Derwin, K. A., Baker, A. R., Codsi, M. J., Iannotti, J. P. Assessment of the canine model of rotator cuff injury and repair. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S140-S148 (2007).
  7. Grumet, R. C., Hadley, S., Diltz, M. V., Lee, T. Q., Gupta, R. Development of a new model for rotator cuff pathology: The rabbit subscapularis muscle. Acta Orthopaedica. 80 (1), 97-103 (2009).
  8. Renström, P., Johnson, R. J. Overuse injuries in sports. Sports Medicine. 2 (5), 316-333 (1985).
  9. Hertel, R., Lambert, S. M. Supraspinatus rupture at the musculotendinous junction. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 432-435 (1998).
  10. Oh, J. H., Chung, S. W., Kim, S. H., Chung, J. Y., Kim, J. Y. Neer Award: Effect of the adipose-derived stem cell for the improvement of fatty degeneration and rotator cuff healing in rabbit model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 23 (4), 445-455 (2013).
  11. Gupta, R., Lee, T. Q. Contributions of the different rabbit models to our understanding of rotator cuff pathology. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S149-S157 (2007).
  12. Otarodifard, K., Wong, J., Preston, C. F., Tibone, J. E., Lee, T. Q. Relative fixation strength of rabbit subscapularis repair is comparable to human supraspinatus repair at time 0. Clinical Orthopaedics and Related Research. 472 (8), 2440-2447 (2014).
  13. Liu, X., Manzano, G., Kim, H. T., Feeley, B. T. A rat model of massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 588-595 (2011).
  14. Liu, X., et al. A mouse model of massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 94 (7), 41 (2012).
  15. Neer,, et al. Award 2007: Reversion of structural muscle changes caused by chronic rotator cuff tears using continuous musculotendinous traction. An experimental study in sheep. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 18 (2), 163-171 (2009).
  16. Warner, J. J., Parsons, I. M. Latissimus dorsi tendon transfer: A comparative analysis of primary and salvage reconstruction of massive, irreparable rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 10 (6), 514-521 (2001).
  17. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 86 (2), 219-224 (2004).
  18. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  19. Carpenter, J. E., Thomopoulos, S., Flanagan, C. L., DeBano, C. M., Soslowsky, L. J. Rotator cuff defect healing: A biomechanical and histologic analysis in an animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (6), 599-605 (1998).
  20. Jal Soslowsky, L., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: Role of extrinsic and overuse factors. Annals of Biomedical Engineering. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  21. Thomopoulos, S., et al. The localized expression of extracellular matrix components in healing tendon insertion sites: An in situ hybridization study. Journal of Orthopaedic Research. 20 (3), 454-463 (2002).
  22. Su, W., et al. Effect of suture absorbability on rotator cuff healing in a rabbit rotator cuff repair model. The American Journal of Sports Medicine. 46 (11), 2743-2754 (2018).
  23. Barton, E. R., Gimbel, J. A., Williams, G. R., Soslowsky, L. J. Rat supraspinatus muscle atrophy after tendon detachment. Journal of Orthopaedic Research. 23 (2), 259-265 (2005).
  24. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: An experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  25. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Perren, S. M., Nyffeler, R. W. Experimental rotator cuff repair. A preliminary study. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 81 (9), 1281-1290 (1999).
  26. Hal Coleman, S., et al. Chronic rotator cuff injury and repair model in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 85 (12), 2391-2402 (2003).
  27. Turner, A. S. Experiences with sheep as an animal model for shoulder surgery: strengths and shortcomings. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S158-S163 (2007).
  28. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder MA, Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  29. Cooper, C. S., Metcalf-Pate, K. A., Barat, C. E., Cook, J. A., Scorpio, D. G. Comparison of side effects between buprenorphine and meloxicam used postoperatively in Dutch belted rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (3), 279-285 (2009).
  30. Eal Ker, D. F., et al. Functionally graded, bone-and tendon-like polyurethane for rotator cuff repair. Advanced Functional Materials. 28 (20), 1707107 (2018).
  31. Toumi, H., et al. Regional variations in human patellar trabecular architecture and the structure of the proximal patellar tendon enthesis. Journal of Anatomy. 208 (1), 47-57 (2006).
  32. Noor, R. A. M., Shah, N. S. M., Zin, A. A. M., Sulaiman, W. A. W., Halim, A. S. Disoriented collagen fibers and disorganized, fibrotic orbicularis oris muscle fiber with mitochondrial myopathy in non-syndromic cleft lip. Archives of Oral Biology. 140, 105448 (2022).
  33. Wang, D., et al. Growth and differentiation factor-7 immobilized, mechanically strong quadrol-hexamethylene diisocyanate-methacrylic anhydride polyurethane polymer for tendon repair and regeneration. Acta Biomaterialia. 154, 108-122 (2022).
  34. Wang, D., et al. Combinatorial mechanical gradation and growth factor biopatterning strategy for spatially controlled bone-tendon-like cell differentiation and tissue formation. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
  35. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, (2016).
  36. Safran, O., Derwin, K. A., Powell, K., Iannotti, J. P. Changes in rotator cuff muscle volume, fat content, and passive mechanics after chronic detachment in a canine model. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 87 (12), 2662-2670 (2005).
  37. Gerber, C., Fuchs, B., Hodler, J. The results of repair of massive tears of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 82 (4), 505-515 (2000).
  38. Longo, U. G., Berton, A., Khan, W. S., Maffulli, N., Denaro, V. Histopathology of rotator cuff tears. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 19 (3), 227-236 (2011).
  39. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 375-380 (1998).
  40. Soslowsky, L. J., Carpenter, J. E., DeBano, C. M., Banerji, I., Moalli, M. R. Development and use of an animal model for investigations on rotator cuff disease. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 5 (5), 383-392 (1996).
  41. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. 92 (13), 2270-2778 (2010).
  42. Gladstone, J. N., Bishop, J. Y., Lo, I. K., Flatow, E. L. Fatty infiltration and atrophy of the rotator cuff do not improve after rotator cuff repair and correlate with poor functional outcome. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 719-728 (2007).
  43. Chen, W. F., Kim, B. -S., Lin, Y. -T. Penrose drain interposition-A novel approach to preventing adhesion formation after tenolysis. The Journal of Hand Surgery. Asian-Pacific Volume. 27 (1), 174-177 (2022).
  44. Lui, P. P. Y. Stem cell technology for tendon regeneration: Current status, challenges, and future research directions. Stem Cells and Cloning: Advances and Applications. 8, 163-174 (2015).
  45. Howell, K., et al. Novel model of tendon regeneration reveals distinct cell mechanisms underlying regenerative and fibrotic tendon healing. Scientific Reports. 7, 45238 (2017).
  46. Sharma, P., Maffulli, N. Tendinopathy and tendon injury: The future. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1733-1745 Forthcoming.
  47. Huegel, J., et al. Quantitative comparison of three rat models of Achilles tendon injury: A multidisciplinary approach. Journal of Biomechanics. 88, 194-200 (2019).
  48. Pal Heggers, J., et al. Biocompatibility of silicone implants. Annals of Plastic Surgery. 11 (1), 38-45 (1983).
  49. Liu, Y., et al. Evaluation of animal models and methods for assessing shoulder function after rotator cuff tear: A systematic review. Journal of Orthopaedic Translation. 26, 31-38 (2020).
  50. Disselhorst-Klug, C., Schmitz-Rode, T., Rau, G. Surface electromyography and muscle force: Limits in sEMG-force relationship and new approaches for applications. Clinical Biomechanics. 24 (3), 225-235 (2009).
  51. Kwon, D. R., Park, G. -Y., Moon, Y. S., Lee, S. C. Therapeutic effects of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells combined with polydeoxyribonucleotides on full-thickness rotator cuff tendon tear in a rabbit model. Cell Transplantation. 27 (11), 1613-1622 (2018).

Tags

Konijn Chronisch-achtig Rotator Cuff Injury Model Fibrose Spiervervetting Spierstelsel Pezen Kracht Retractie Spier-pees/myotendineuze eenheid Schouderfunctie RC-reparatieresultaten Diermodellen Menselijke RC-anatomie en pathofysiologie Tissue Engineering Op regeneratieve geneeskunde gebaseerde therapieën Rabbit Subscapularis Model Human Supraspinatus Bot-pees-spiereenheid Fibrose en spiervervetting (FD) Chirurgische ingrepen Isolatie van SSC Coracobrachialis-spier Transsectie over de volledige dikte Penrose-buizen op siliconenbasis histologische evaluatie
Ontwikkeling van een chronisch model voor rotator cuff-letsel bij konijnen voor de studie van fibrose en spierdegeneratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. … More

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. F. E. Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64828, doi:10.3791/64828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter