Summary
Zebrafisk målrettet mod reaktive elektrofiler og oxidanter (Z-REX) er en kemisk biologisk baseret metode til undersøgelse af reaktiv småmolekylesignalering. Denne teknik kan anvendes til levende fisk i forskellige udviklingsstadier. Her kobler vi standardanalyser i zebrafisk med Z-REX til signalvejsanalyse.
Abstract
Reaktive metabolitter og relaterede elektrofile lægemidler er blandt de mest udfordrende små molekyler at studere. Konventionelle tilgange til at dekonstruere virkningsmåden (MOA) af sådanne molekyler udnytter bulkbehandling af eksperimentelle prøver med et overskud af en specifik reaktiv art. I denne tilgang gør elektrofilernes høje reaktivitet ikke-diskriminerende mærkning af proteomet på en tids- og kontekstafhængig måde; Redoxfølsomme proteiner og processer kan også påvirkes indirekte og ofte irreversibelt. På baggrund af utallige potentielle mål og indirekte sekundære effekter er det fortsat en kompleks opgave at knytte fænotype til specifikt målengagement. Zebrafisk rettet mod reaktive elektrofiler og oxidanter (Z-REX) - en on-demand reaktiv elektrofil leveringsplatform tilpasset til brug i larvezebrafisk - er designet til at levere elektrofiler til et specifikt protein af interesse (POI) i ellers uforstyrrede levende fiskeembryoner. Nøglefunktioner i denne teknik inkluderer et lavt niveau af invasivitet sammen med doserings-, kemotype- og rumligt styret præcisionselektrofil levering. I forbindelse med en unik række kontroller undgår denne teknik således virkninger uden for målet og systemisk toksicitet, der ellers observeres efter ukontrolleret bulkeksponering af dyr for reaktive elektrofiler og pleiotropiske elektrofile lægemidler. Ved at udnytte Z-REX kan forskere etablere fodfæste i forståelsen af, hvordan individuelle stressresponser og signaloutput ændres som følge af specifikt reaktivt ligandengagement med et specifikt POI under næsten fysiologiske forhold i intakte levende dyr.
Introduction
Et utal af cellulære signalhændelser involverer reaktioner mellem små reaktive molekyler (endogent produceret i cellen eller xenobiotika/xenometabolitter, såsom lægemidler) og deres proteinmål. I mange tilfælde kan et substøkiometrisk niveau af sådanne kovalente bindingshændelser udløse cellulære reaktioner, hvilket fører til ændringer i for eksempel udvikling, metabolisme, apoptose og / eller immunrespons1. Imidlertid har det vist sig udfordrende at dekonstruere virkningsmåden (MOA) ved at forbinde specifikke bindingsbegivenheder med deres fænotypiske konsekvenser. Traditionelle bolusdoseringsmetoder, der involverer introduktion af høje koncentrationer af de reaktive arter, resulterer ofte i en lang række proteiner, der ændres, samt overdreven toksicitet for modelorganismen2. Sådanne forhold er langt fra ideelle. Der blev udviklet en metode til at løse disse problemer i cellekultur ved hjælp af præcisionslokaliseret elektrofil levering i en indfødt cellulær kontekst, kaldet T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. I de mellemliggende år er fokus vendt mod forsøg i hele organismer, som giver mulighed for at studere proteiner i specifikke cellulære sammenhænge i ikke-transformerede celler. Således har vi udvidet teknikken til at være kompatibel med flere modeller, herunder Danio rerio embryomodeller. Heri præsenterer vi Z-REX (zebrafisk rettet mod reaktive elektrofiler og oxidanter) (figur 1).
For at forstå Z-REX præsenterer denne artikel først REX-teknologier og deres underliggende koncepter. I deres kerne modellerer disse teknikker endogene fysiologiske reaktive elektrofile arter (RES) signalering ved at efterligne, hvordan naturlige elektrofiler produceres lokalt in vivo med rumlig tidsmæssig præcision. Proteinet af interesse (POI) udtrykkes som en fusionskonstruktion til Halo; sidstnævnte forankrer den vævsgennemtrængelige og inerte sonde, der bærer den fotoburede RES i en 1: 1 støkiometri. En sådan endogen RES er 4-hydroxynonenal (HNE i det følgende), som fotobures i sonden Ht-PreHNE. I mange tilfælde bruger vi en alkynfunktionaliseret version af HNE [dvs. HNE (alkyn)], som i det væsentlige har identiske biologiske egenskaber med HNE, men kan mærkes ved klikkemi. Sonden, som også er funktionaliseret med en chloralkan til reaktivitet med Halo, kaldes Ht-PreHNE (alkyn). Komplekset af Halo-POI-fusionen og den således dannede sonde tillader proksimal levering af RES til det smeltede POI ved bestråling med UV-lys. Hvis POI reagerer hurtigt med den frigjorte RES, giver den resulterende kovalente mærkning af POI med RES os mulighed for at identificere kinetisk privilegerede cysteiner.
Z-REX tager de førnævnte fordele ved REX-teknologier og anvender dem bredt til at studere specifikke signalveje i levende fisk. Denne protokol er optimeret til zebrafisk (D. rerio), da de er genetisk medgørlige hvirveldyrorganismer, der er gennemsigtige under udviklingen og dermed ideelle til optokemiske / genetiske teknikker som REX-teknologier. Ikke desto mindre vil en lignende strategi sandsynligvis også fungere godt på andre genetisk medgørlige fiskearter, da metodens brede anvendelighed skyldes den pseudo-intramolekylære mekanisme for lipidafledt elektrofil (LDE) levering. Faktisk er proceduren meget biokompatibel, da fisk kan behandles med Z-REX fotocaged-elektrofil [f.eks. Ht-PreHNE (alkyn)] i mindst 48 timer uden nogen mærkbar indvirkning på udviklingen. En lignende protokol fungerer i C. elegans 4,5.
Protokollen beskriver først brugen af mRNA-injektion til at producere et forbigående udtryk af en ikke-native Halo-POI-fusionskonstruktion i embryonale zebrafiskmodeller 1-1,5 dage efter befrugtning (dpf). Dette resulterer i ekspression af det ektopiske protein i størstedelen af cellerne i fisken (i det følgende benævnt 'allestedsnærværende') snarere end i specifikke væv eller lokaliteter; Dataene viser imidlertid, at cellespecifikke virkninger kan observeres i visse tilfælde. Efter injektion inkuberes embryonerne med en lav koncentration [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alkyn)] af sonden i op til 30,5 timer efter befrugtning (hpf). Derefter opnås levering af RES til POI i fisk på et brugerforeskrevet tidspunkt ved fotouncaging i 2-5 minutter. Efter fotouncaging af RES kan der udføres en række nedstrøms fænotypiske assays i løbet af de næste 2-10 timer: 1) levende billeddannelse af reporterlinjer (figur 2A); 2) vurdering af målmærkning ved western blot-analyse (figur 3); 3) transkriptomisk analyse (figur 4); eller 4) helmonteret immunfluorescens (figur 5).
Som et eksempel på live imaging af reporterlinjer demonstreres Z-REX sammen med live imaging af fiskelinjer, Tg (lyz: TagRFP) og Tg (mpeg1: eGFP), for at måle, hvordan RES-modifikation af en specifik elektrofilsensor-POI (nemlig Keap1) reducerer henholdsvis neutrofil- og makrofagniveauer uden observerbare virkninger på andre celler i fisken. Vi har dog tidligere vist, at POI-mærkningen og konsekvensvejssignalerne fra T-REX-studier kan reproduceres ved hjælp af Z-REX for flere proteiner: Akt3 6, Keap17 og Ube2v26. Samlet set kan forskere med Z-REX studere konsekvensen (e) af kovalent modifikation af POI'er af RES i forbindelse med flere komplekse redoxveje. Denne teknik er primet til at lokalisere mål og deres funktionelle rester for kovalent lægemiddeldesign og nye lægemiddelmekanismer i en mere kontekstuelt relevant heldyrsmodel.
Protocol
Zebrafiskeopdræt og håndteringsprocedurer ved Cornell University (USA) blev udført efter retningslinjerne fra National Institutes of Health (NIH) og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Zebrafiskeopdræt og håndteringsprocedurer på zebrafiskenheden ved Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL, Schweiz) blev udført i henhold til dyrevelfærdsloven SR 455 og dyrevelfærdsforordningen SR 455.1 med kantonal veterinærtilladelse VD-H23.
BEMÆRK: I denne protokol bruges Tg(lyz:TagRFP ) og Tg(mpeg1:EGFP) fiskelinjer, der udtrykker Halo-TeV-Keap1, til at demonstrere Z-REX. Metoden kan udvides til andre proteiner af interesse, transgene reporterfiskelinjer og nedstrøms biologiske assays. Der henvises til supplerende tabel 1 for de buffere, der anvendes i denne undersøgelse. Alle reagenser, instrumenter, udstyr, antistoffer, plasmider, zebrafiskstammer og udstyr er opført i materialetabellen.
1. mRNA-forberedelse
- Forbered Halo-TeV-Keap1-2xHA og Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA ved hjælp af mMessage mMachine SP6 in vitro-transskriptionssættet.
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger og udfør 40 μL skalareaktioner for hvert mRNA. Opløs mRNA-pelleten igen i 10 μL nukleasefrit vand. - Vurder mRNA-kvaliteten og mål koncentrationen ved hjælp af mikrovolumenspektrofotometer og agarosegelelektroforese. Et mRNA af god kvalitet skal have et A260/A 280-forhold på omkring eller over 2,0.
- Fortynd mRNA'et til 1-1,5 mg / ml med nukleasefrit vand.
- Der alikvotes mRNA-opløsningen (1-2 μL pr. reagensglas), og delprøverne opbevares ved -80 °C.
2. Produktion af fiskeembryoner
- Mulighed 1: Produktion af vildtype-fiskeembryoner.
- Opsæt 10 fisk, der krydser par i 10 separate tanke, hvor hver tank indeholder en skillelinje mellem den mandlige og kvindelige forældrefisk.
BEMÆRK: I alt 10 krydsningspar giver typisk et tilstrækkeligt antal embryoner til analyserne. Antallet af krydsningspar kan justeres i henhold til forsøgsdesignet/-behovet og forældrefiskens frugtbarhed. - Den følgende morgen, efter opsætning af injektoren, skal du fjerne skillevæggene i fem af tankene. Vent i 30 minutter på, at fisken parrer sig.
- Flyt forældrefisken til en anden tank, saml embryoner ved at føre tankvandet gennem en sil, og skyl derefter embryonerne fra silen i en 10 cm petriskål. Disse embryoner vil blive brugt til den første runde af injektioner.
BEMÆRK: Hvis ægkvaliteten fra et bestemt parti er dårlig (f.eks. hvis æg er uigennemsigtige på grund af aggregering af proteiner), skal du ikke samle dem med de andre embryoner. - (Valgfrit) Udfør lignende procedurer som beskrevet i trin 2.1.2-2.1.3 på de andre fem beholdere til næste injektionsrunde.
BEMÆRK: Det er bedst kun at udføre en injektionsrunde for at minimere aldersforskellen mellem embryoner. Men hvis der kræves flere embryoner, end der kan injiceres i et parti, anbefales det at udføre to injektionsrunder for at sikre, at embryonerne forbliver på et 1-4-cellestadium under mRNA-injektion. Antallet af injektionsrunder kan justeres i henhold til operatørens injektionsevne og eksperimentdesign. Det foreslås dog at udføre hele proceduren (fra fjernelse af den første skillevæg til injektion af det sidste embryo) inden for 2 timer. En stor aldersforskel på tværs af embryoner kan forringe forsøgsresultaternes pålidelighed og reproducerbarhed.
- Opsæt 10 fisk, der krydser par i 10 separate tanke, hvor hver tank indeholder en skillelinje mellem den mandlige og kvindelige forældrefisk.
- Mulighed 2: Produktion af heterozygote transgene neutrofile / makrofagreporterfiskeembryoner.
- Opsæt 10 fisk, der krydser par i 10 separate tanke, hvor hver tank indsættes med en skillelinje mellem han- og hunforældrefisk: WT-fisk versus Tg( lyz:TagRFP) eller WT-fisk versus Tg(mpeg1:eGFP).
BEMÆRK: Undgå krydsninger mellem heterozygote transgene fisk, som kan påvirke nedstrøms fluorescerende aflæsninger, da homozygote reporterfisk viser et højere fluorescerende signal sammenlignet med heterozygote fisk. Transgene reporterlinjer og WT-embryoner kan let skelnes ved billeddannelse. At have en blanding af WT og heterozygote embryoner i samme pool er ikke et problem. lyz:TagRFP rapporterer neutrofiler, og mpeg:eGFP rapporterer makrofager. Denne protokol kan også anvendes på andre reporterfiskelinjer. - Følg trin 2.1.2-2.1.4.
- Opsæt 10 fisk, der krydser par i 10 separate tanke, hvor hver tank indsættes med en skillelinje mellem han- og hunforældrefisk: WT-fisk versus Tg( lyz:TagRFP) eller WT-fisk versus Tg(mpeg1:eGFP).
3. Opsætning af mikroinjektor
- Tænd for luftkilden, indstil modtrykket til 0,2-0,5 psi, og indstil injektionstrykket til 25-30 psi. Det specifikke trykområde, der vises, anbefales typisk.
BEMÆRK: Det er vigtigt at have et stabilt modtryk for at forhindre tilbagestrømning af fiskemedier i nålen. Ved kalibrering af injektionsvolumen i trin 3.8 bør kun injektionstiden ændres. Du må ikke ændre injektionstrykket i følgende trin; Lavt injektionstryk kan føre til injektionssvigt på grund af overflade- og grænsefladespændinger, mens højt injektionstryk kan skade embryoner. - Rengør udstyret og injektionsplatformen med RNase-dekontamineringsopløsning.
BEMÆRK: RNase, som nedbryder mRNA, kan komme fra operatøren eller udstyret. Det er nødvendigt at udføre oprydningen før eksperimentet og bære handsker. - (Valgfrit) Hvis du injicerer mRNA og morpholino samtidig, skal du forblande de to i et 0,2 ml rør.
BEMÆRK: Z-REX fungerer godt ved at bruge Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA-opløsning med en koncentration på 250-1500 ng/μL. Flere morpholinos er også blevet brugt i zebrafisk, og de optimale koncentrationer er rapporteret7. Hvis der anvendes en morpholino med en ikke-offentliggjort sekvens, bør operatøren først vurdere morfolinoens toksicitet og genknockdowneffektivitet, før den anvendes i Z-REX. - Overfør 1-2 μL mRNA (og/eller morpholino, hvor relevant7) til en injektionsnål med en pipettespids af mikrolæsseren.
BEMÆRK: Hvis nåle tilberedes med en flammende/brun mikropipetteaftrækker, er opsætningen som følger. Varme: 520 enheder; trækstyrke: 60 enheder; hastighed: 70 enheder; forsinkelse: 155 enheder; tryk: 550 enheder; rampe: 530 enheder. - Installer nålen på mikroinjektionsmanipulatoren.
BEMÆRK: Modtryk fra luftkilden skal skubbe mRNA (/ morpholino) opløsningen til nålespidsen. - Brug skarpe pincet eller et barberblad til at bryde nålespidsen, hvilket skaber en passende åbning til injektion.
- Nedsænk nålespidsen i mineralolie på et scenemikrometer.
- Påfør to eller tre injektionsimpulser for at fjerne luftbobler i spidsen.
- Kalibrer dråbestørrelsen til 2 nul ved at ændre injektionstiden.
BEMÆRK: Dette udføres bedst ved at injicere i mineralolie (som efterligner blommesækkens viskositet) lagt på et hæmocytometer. Brug et mikroskop til at bruge hæmocytometrets gitterlinjer til at estimere størrelsen af dråben dannet under injektionen og justere injektionstiden i overensstemmelse hermed. Selvom phenolrødt farvestof undertiden anvendes, er behovet for det i mRNA-injektionsproceduren beskrevet her ikke blevet observeret.
4. Mikroinjektion
- Fyld en injektionsplade med frisk 10% Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) medium, og juster embryonerne i rillerne på pladen med stump tang.
BEMÆRK: Injektionspladen fremstilles med 2% agarose i 10% HBSS-medium; Rillerne dannes ved hjælp af en plastform. - Nedsænk kanylespidsen i 10% HBSS-medium i injektionspladen.
- Påfør to eller tre injektionsimpulser for at fjerne luftbobler i spidsen.
- For hver injektion skal du trænge ind i korionen og æggeblommesækken i et enkelt træk og anvende en injektionspuls. Denne injicerede væske kan ses lige efter injektionen som en lille sfæroid i æggeblommesækken. Denne lille sfæroid spredes relativt hurtigt. Dette trin gentages for andre embryoner, indtil der er opnået et tilstrækkeligt antal injicerede embryoner.
BEMÆRK: Overlevelsesraten for embryoner (både injicerede og ikke-injicerede) varierer typisk fra 50% -90%. Målet er at injicere dobbelt så mange embryoner, der er nødvendige for hver kontrol-/forsøgsgruppe. I biotin-pull-down-analysen kræves 100-140 levedygtige embryoner for hver tilstand. I qRT-PCR-analysen anbefales fem levedygtige embryoner til hver tilstand. Prøvestørrelsen for billeddannelse af levende fisk og helmonteret immunofluorescensfarvningsanalyse er brugerdefineret. Det anbefales at have mindst 20 levedygtige embryoner pr. tilstand for at give god statistisk styrke i analysen. - De injicerede embryoner skylles ud i en ny 10 cm petriskål, der indeholder friske 10% HBSS-medier.
BEMÆRK: Embryonerne kan let skylles ud af rillerne ved hjælp af en sprøjteflaske. - De ikke-injicerede embryoner samles i en anden plade.
BEMÆRK: De ikke-injicerede embryoner kan tjene som kvalitetskontrol for fiskens sundhed, baseline proteinekspression, baggrundsfluorescensniveauer osv. Efter behov. Hvis injektionsproceduren fungerede godt, og injiceret mRNA/morpholino ikke er dødelig for embryonerne, bør injicerede og ikke-injicerede embryoner have samme levedygtighed.
5. Z-REX
- De injicerede embryoner fordeles i 10 cm skåle i henhold til forsøgsopstillingen (dvs. antal kontrol-/forsøgsgrupper).
- I et mørkt rum med rødt lys skal mediet udskiftes med 30 ml 10% HBSS med eller uden 1 μM Ht-PreHNE (alkyn).
BEMÆRK: Ht-PreHNE (alkyn) er en lyslabil forbindelse. Embryoner bør opbevares i mørke i følgende trin. - Embryonerne inkuberes ved 28,5 °C i mørke.
- Ved 30,5 hkf, i et mørkt rum, udskiftes mediet med en frisk 30 ml 10% HBSS.
BEMÆRK: Når du udskifter mediet, skal du fjerne så meget af det gamle medium som muligt. Dette er afgørende for at fjerne den ubundne/overskydende mængde Ht-PreHNE(alkyn) fra embryonerne. - Embryonerne inkuberes ved 28,5 °C i mørke i 30 minutter.
- Gentag trin 5.4-5.5 to gange mere.
- Tænd UV-lampen (365 nm, 3 mW/cm2) i 5 minutter for at forvarme lampen.
BEMÆRK: Lampens forvarmningstrin skal udføres før trin 5.8. Lampens effekt er lavere/ustabil i de første par minutter efter tænding. Lampens effekt skal måles regelmæssigt af en UV-måler. - Ved 32 hpf udsættes embryonerne for UV-lys.
- Mulighed 1: Til nedstrøms aflæsninger, såsom levende fiskebilleddannelse, helmonteret immunfluorescensfarvning, fluorescensanalyse i gel (klikkobling med Cy5-azid), RNA-seq eller qRT-PCR, udsæt embryonerne for UV-lys i 3 minutter og hvirvler pladerne hvert 30. sekund.
- Mulighed 2: Ved nedstrøms aflæsninger, såsom biotin-pull-down-analyse, udsættes embryonerne for UV-lys i maksimalt 5 minutter (og mindst 3 minutter), pladerne hvirvles rundt hver 30. sek. og afkøles pladerne på is i 1 min.
BEMÆRK: Hvis der anvendes forskellige sonder, skal lyseksponeringstiden optimeres afhængigt af t1/2 af fotouncaging for en given fotoburet elektrofil sonde og lyskilde, der anvendes. T1/2fotouncaging kan bestemmes ved hjælp af kendte procedurer8. For Ht-PreHNE (alkyn) er t 1/2 < 1 min3; Således er den angivne tid ovenfor tilstrækkelig.
6. Downstream-assays
- Mulighed 1: Fænotypisk analyse. Live billeddannelse af transgen neutrofil / makrofagreporter
fiskelinjer, Tg(lyz:TagRFP) og Tg(mpeg1:eGFP) (figur 2)- Embryonerne bedøves ved inkubation ved 4 °C i 10 min.
BEMÆRK: Det anbefales at have mindst 20 levedygtige embryoner pr. Tilstand. - Fjern de ubefrugtede/døde embryoner fra pladen.
BEMÆRK: De ubefrugtede/døde embryoner er uklare/uigennemsigtige og kan identificeres visuelt. Hvis der ses en høj dødelighed, skal du kontrollere tilbage til injektionsproceduren eller forsøge at reducere koncentrationen af mRNA eller morpholino. - Dechorionate embryonerne med skarpe tang. Hold korionen med et par tang uden at røre larvefisken, og brug det andet par tang til at rive korionen af. Embryoet er skrøbeligt. Rør kun ved korionen, når du udfører dechorionation.
BEMÆRK: Det er almindeligt, især hos begyndere, at beskadige nogle embryoner under dechorionation. Hav derfor altid flere embryoner end det nødvendige minimum. - Embryonerne monteres på en 2% agaroseplade (tilberedt med 10% HBSS-medium) og afbildes embryonerne med et stereomikroskop (lysfelt og respektive lysstofrør) (figur 2A, C, G).
BEMÆRK: Efter Z-REX [kombination af Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA-injektion og Ht-PreHNE(alkyn)behandling] blev udtømningen af neutrofiler (lyz:TagRFP) fundet at være mest signifikant ved 36 hpf (4 timer efter Z-REX), mens reduktionen af makrofager (mpeg1:eGFP) var mest signifikant ved 34 hpf (2 timer efter Z-REX) (figur 2E,F). Andre tidspunkter kan bruges, hvis du bruger forskellige reporterlinjer, mRNA / morpholino eller sonder. Eksponeringstiden og/eller forstærkningen skal optimeres til visualisering af enkeltceller eller de specifikke (ultra)strukturer, der ønskes. - Tæl neutrofil/makrofagnummeret for hver fisk efter ImageJ (NIH) (figur 2B, D-F, H). Brug værktøjet Frihåndsmarkering i ImageJ til at cirkulere hele fisken, og brug indstillingen Find Maxima til at tælle de fluorescerende celler.
- Embryonerne bedøves ved inkubation ved 4 °C i 10 min.
- Mulighed 2: Vurdering af målmærkning. Biotinazid-klikkobling og biotin-pull-down-assay (Figur 3)
- Embryonerne bedøves ved inkubation ved 4 °C. Dette tager normalt 10 min.
BEMÆRK: For at opnå nok fiskelysat kræves 100-140 levedygtige embryoner til hver tilstand. - Fjern de ubefrugtede/døde embryoner fra pladen.
- Udfør dechorionation og deyolking. Udfør de to manipulationer ved at holde korionen med et par skarpe tang, bruge det andet par tang til at trænge ind i æggeblommesækken og derefter adskille æggeblommesækken, mens du fjerner korionen for at tillade æggeblommeproteinerne at komme ud.
BEMÆRK: Det er afgørende at fjerne æggeblommeproteinerne i dette trin. De rigelige æggeblommeproteiner i prøven interfererer med senere analyse. - Overfør de deyolked embryoner til et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Hvirvl pladen for at centrere de deyolked embryoner, hvilket letter indsamlingen. Det lettere chorionaffald vinder væk under denne proces. - Når embryonerne har lagt sig til tubebunden, fjernes supernatanten, og der tilsættes 1 ml afkølet HEPES-bufret saltvand (pH 7,6).
- Gentag trin 6.2.5 to gange mere.
- (Valgfrit) Hvis du ikke har til hensigt at fortsætte med næste trin med det samme, skal du fjerne bufferen, flashfryse prøverne i flydende nitrogen og opbevare dem ved -80 °C.
BEMÆRK: Deyolked fiskepiller kan lynfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. Flashfrosne prøver kan opbevares ved -80 °C i op til 2 uger. - Resuspender fiskepillerne i lysisbuffer.
BEMÆRK: Lysisbuffer (pH 7,6) består af 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,3 mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini EDTA-fri proteasehæmmere og 0,1 mg / ml trypsinhæmmer fra sojabønne. Et embryo giver ca. 2 μg lysat. Brug 100 μL lysisbuffer for hver 120 embryoner. To Roche cOmplete Mini EDTA-fri proteasehæmmere og trypsinhæmmere fra sojabønner skal tilsættes lysisbufferen lige før brug. - Tilsæt 20% v/v zirconia perler til røret.
- Vortex i 20 s, lynfryses i flydende nitrogen og tøs op i et 37 °C vandbad.
- Gentag trin 6.2.10 yderligere to gange.
- Opløsningen centrifugeres ved 21.000 x g ved 4 °C i 10 min.
- Supernatanten overføres til et nyt, forkølet 1,5 ml glas.
- Mål proteinkoncentrationen ved Bradford-analyse.
- Fortynd lysatet til 1 mg/ml.
- For hver tilstand overføres 170 μg lysat til et 2 ml rør.
- Lysatet fra trin 6.2.16 blandes med 0,2 mg/ml TeV-protease(S219V), og opløsningen inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: For ikke-TeV-proteasebehandlede grupper blandes lysatet blot med en lige så stor mængde lysisbuffer som TeV-proteaseopløsningen, der anvendes i andre grupper. - Forbered en 10x masterblanding til biotin-azid-klikreaktionen: 10% w / v SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM Cu (TBTA), 1 mM biotin-azid og 20 mM TCEP.
BEMÆRK: Tilføj TCEP til blandingen lige før trin 6.2.19. - Der tilsættes 8,5 μL t-BuOH og 17 μL 10x klikreaktionsmasterblanding til (TeV-proteasefordøjet) lysat fra trin 6.2.17. Hvirvelstrømmen, centrifuger og inkuber opløsningen ved 37 °C i 15 minutter.
- Der tilsættes yderligere 1 mM TCEP til opløsningen, hvorefter hvirvelstrømmen hvirvelstrømmes, centrifugeres og inkuberes ved 37 °C i yderligere 15 minutter. Inkubationstiden for trin 6.2.19-6.2.20 er i alt 30 min.
BEMÆRK: Dette supplement af TCEP, et reducerende reagens til generering af Cu (I), forbedrer klikreaktionseffektiviteten. - Der tilsættes 600 μL -20 °C ethanol til hvert rør, hvirvler opløsningen og inkuberes ved -80 °C natten over.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -80 °C i 1 uge; Hvis ikke, skal du straks fortsætte med det næste trin. - Opløsningen centrifugeres ved 21.000 x g ved 4 °C i 1 time.
BEMÆRK: Der skal dannes en pille i bunden af røret efter centrifugering, hvilket er den ønskede fraktion. - Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml ethanol eller hvirvel ved -20 °C, og opløsningen centrifugeres ved 21.000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
- Gentag trin 6.2.23.
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml -20 °C acetone, hvirvelstrøm, og opløsningen centrifugeres ved 21.000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
- Supernatanten fjernes. Lad overskydende resterende acetone fordampe, men ikke helt til tørhed.
- Resuspender pellet i 100 μL resuspensionsbuffer (8% w / v lithiumdodecylsulfat [LDS], 1 mM EDTA i 50 mM HEPES saltvand, pH 7,6), hvirvel i 15 s og soniker, indtil pellet er opløst.
- Opløsningen centrifugeres ved 21.000 x g ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Supernatanten overføres til et nyt 2 ml glas, og der tilsættes 1,5 ml 50 mM HEPES-saltvand, pH 7,6.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af LDS i dette trin er 0,5%. Højere LDS-koncentrationer kan underminere pull-down-effektiviteten. Selvom en forøgelse af LDS-koncentrationen således kan hjælpe med at reducere ikke-specifik binding, kan det også reducere effektiviteten af pulldown. Derfor anbefales det ikke at ændre LDS-koncentrationen på dette trin. - Opsaml "inputprøven" (figur 3): Overfør 30 μL 1 mg/ml lysat til et nyt 1,5 ml rør, og tilsæt 10 μL 4x Laemmli prøvebuffer indeholdende 6% β-Mercaptoethanol (BME). Flashfryse opløsningen og opbevare den ved -80 °C.
- Overfør 100 μL bed-volume streptavidin højkapacitetsharpiks til et nyt 2 ml rør. Der tilsættes 1 ml 0,5 % LDS i 50 mM HEPES-saltvand (pH 7,6), centrifugeres ved 1.500 x g ved RT i 2 min, og supernatanten fjernes. Gentag vasken med yderligere 1 ml 0,5% LDS i 50 mM HEPES saltvand (pH 7,6).
- Opløsningen overføres fra trin 6.2.29 til røret indeholdende forvasket streptavidinharpiks med høj kapacitet fra trin 6.2.31, og opløsningen inkuberes på en ende-over-ende-mixer ved RT i 4-6 timer.
- Blandingen centrifugeres ved 1.500 x g ved RT i 2 min., der udtages 30 μl supernatant, og den blandes med 10 μL 4x Laemmli prøvebuffer indeholdende 6 % BME til gennemstrømningsprøven. Derefter fjernes den resterende supernatant.
BEMÆRK: "Gennemstrømningsprøver" kan analyseres ved western blotting for at kontrollere streptavidin pull-down effektiviteten. Det er vigtigt at fjerne så meget af supernatanten som muligt for at udvaske de ubundne proteiner. Først fjernes det meste af supernatanten med en P-1000-pipette, og derefter fjernes den resterende supernatant med en P-20-pipette med en gelpåfyldningsspids. - Tilsæt 1 ml 0,5% LDS i 50 mM HEPES-saltvand (pH 7,6) til harpiksen, og inkuber blandingen i 30 minutter ved RT med ende-over-ende-rotation.
- Blandingen centrifugeres ved 1 500 x g ved RT i 2 minutter, og supernatanten fjernes.
BEMÆRK: Typisk er 0,5% LDS nok til at fjerne de fleste ikke-specifikke bindingsproteiner. Hvis der stadig ses ikke-specifikke bindingssignaler i den senere analyse, kan LDS-koncentrationen i vaskebufferen øges. - Gentag trin 6.2.34-6.2.35 to gange mere.
- Der tilsættes 40 μL 2x Laemmli prøvebuffer indeholdende 6% BME til harpiksen.
- De bundne proteiner elueres ved at inkubere blandingen ved 98 °C i 5 min.
- Centrifuger blandingen ved 21.000 x g ved RT i 5 min., og overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml glas. Dette er "elu" -prøven.
BEMÆRK: Direkte påfyldning af opløsning indeholdende harpiks fra trin 6.2.38 i gelen kan påvirke SDS-PAGE-analysen. - Fyld 20 μL i hver brønd med 10-lane 10% polyacrylamidgel, og kør gelelektroforese.
BEMÆRK: Kør gelen ved en lavere spænding (120 V), indtil farvefronten når opløsningsgelen, og skift spændingen til 170 V. Stop programmet, når farvefronten kommer ud. - Udfør western blotting med anti-HA, anti-Halo eller andre antistoffer, der detekterer husholdningsproteiner (figur 3).
- Embryonerne bedøves ved inkubation ved 4 °C. Dette tager normalt 10 min.
- Mulighed 3: Transskriptomisk analyse. RNA-seq og qRT-PCR (figur 4)
BEMÆRK: Det anbefales kraftigt at bruge embryoner lagt inden for 15 minutter efter hinanden til denne analyse. Aldersforskellen mellem embryonerne påvirker signifikant analyseresultaterne.- Bedøv embryonerne ved at inkubere dem ved 4 °C i 10 min, 2 timer efter Z-REX.
- Udfør dechorionation med skarpe tang (trin 6.1.3).
- (Valgfrit) Udfør segmentering med pincet (f.eks. Adskil hovedet fra halen), hvis forskellige segmenter skal analyseres separat.
- Hvis der ekstraheres RNA fra et helt embryo, overføres tre til fem embryoner til et 1,5 ml rør. Hvis du ekstraherer RNA fra hoved eller hale, overføres 10-12 dissekerede segmenter til et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Det anbefales at udføre eksperimentet med tre til fem biologiske replikater. - Tilsæt 1 ml TRIzol-reagens og glasperler til røret.
BEMÆRK: Det blev konstateret, at glasperler fungerer bedre end zirconia perler til RNA-ekstraktion. - Vortex blandingen i 30 s.
BEMÆRK: Hvis du ikke fortsætter med næste trin med det samme, kan opløsningen opbevares ved -80 °C i 1-3 uger. - Uddrag RNA'et i henhold til producentens anvisninger.
- Vurder RNA-kvalitet og koncentration ved mikrovolumenspektrofotometer og agarosegelelektroforese.
BEMÆRK: RNA af god kvalitet skal have et A260 / A 280-forhold på omkring eller over 2,0. - Indsend enten RNA'et til sekventering, eller behandl 1 μg RNA med amplifikationskvalitet DNase I, og omvendt transskribere ved hjælp af hævet III revers transkriptase og oligo-(dT)20. Udfør dette trin i henhold til producentens anvisninger.
- Udfør qRT-PCR og analyser dataene ved hjælp af ΔΔCT-metoden9 (figur 4B-D).
- Mulighed 4: POI-udtryk og colokaliseringsanalyse. Helmonteret immunofluorescensfarvningsassay (figur 5)
BEMÆRK: Formaldehydfikserede embryoner er skrøbelige. Undgå kraftige rystelser, og håndter forsigtigt.- Embryonerne dechorioneres ved at følge trin 6.1.1-6.1.3.
- Overfør embryonerne til et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Hvert rør skal have lige mange embryoner og ikke mere end 40 embryoner. - Når embryonerne har lagt sig til bunden af glasset, fjernes supernatanten, og der tilsættes 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS) (pH 7,6).
- Gentag trin 6.4.3 endnu en gang.
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml 4% formaldehyd i PBS (pH 7,6), og glasset inkuberes ved 4 °C natten over med let vuggen.
BEMÆRK: Prøverne i formaldehydopløsning kan opbevares ved 4 °C i 1 uge. - Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml -20 °C methanol, og glasset inkuberes på siden ved -20 °C i mindst 18 timer.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -20 °C i 1 måned eller mere. - Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml PDT-buffer (0,3 % v/v Triton X-100, 0,1 % v/v Tween-20 og 1 % v/v dimethylsulfoxid [DMSO] i PBS-bufferen).
- Gentag trin 6.4.7, og inkuber røret ved RT i 30 minutter med let rokken.
- Supernatanten fjernes, tilsættes 1 ml blokerende buffer (10 % v/v varmeinaktiveret føtalt bovint serum [FBS], 2 % w/v bovint serumalbumin [BSA] og 0,1 % v/v Tween-20 i PBS-buffer), og rekuber glasset ved RT i 1 time med let vuggen.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 200 μl primær antistofopløsning (fortyndet i blokerende buffer).
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 500 μl primær antistofopløsning (fortyndet i blokerende buffer), og glasset inkuberes ved 4 °C natten over med let vuggen.
BEMÆRK: Hvis du bruger et nyt primært antistof, er det værd at inkludere nogle prøver uden primær antistoffarvning for at tjene som negative kontroller. Men ideelt set er morpholino-knockdown eller konstruerede gen-knockout-embryoner eller embryoner, hvor ekspression af målproteinet er blevet stimuleret, mere pålidelige midler til at validere antistoffet. - Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml PDT-buffer, og reagensglasset inkuberes ved RT i 30 minutter med let vuggen.
- Gentag trin 6.4.12.
- Supernatanten fjernes, tilsættes 1 ml blokerende buffer, og glasset inkuberes ved RT i 1 time med let vuggen.
BEMÆRK: Prøverne skal beskyttes mod lys efter dette trin for at forhindre fotoblegning af fluoroforen konjugeret på det sekundære antistof. - Supernatanten fjernes, og der tilsættes 200 μl sekundær antistofopløsning (fortyndet i blokerende buffer).
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 500 μl sekundær antistofopløsning (fortyndet i blokerende buffer), og glasset inkuberes ved RT i 1,5 timer med let vuggen.
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml PDT-buffer, og reagensglasset inkuberes ved RT i 30 minutter med let vuggen.
- Gentag trin 6.4.17.
- Monter embryonerne på en 2% agaroseplade (lavet med PBS, pH 7,6) og tag billeder af embryonerne med et stereomikroskop (lysfelt og respektive fluorescerende kanaler) (figur 5A, B, D, F).
BEMÆRK: Hvis du bruger Leica M165 FC fluorescensstereomikroskop, skal du bruge en forstørrelse på 25x for at få billeder med god opløsning. - Kvantificer/analyser intensiteten af fluorescerende signaler ved hjælp af ImageJ (NIH). Brug værktøjet Frihåndsmarkering i ImageJ til at kvantificere signalet i det relevante område.
Representative Results
Live imaging af Z-REX-behandlede transgene neutrofile / makrofag reporter fisk, Tg (lyz: TagRFP) og Tg (mpeg1: EGFP). Induktion af neutrofil/makrofagapoptose gennem Keap1 HNEylering. (Se også figur 2). Effekten af elektrofil mærkning af Keap1 på neutrofil- og makrofagniveauer blev vurderet ved at injicere heterozygote transgene embryoner afledt af Tg (lyz: TagRFP) eller Tg (mpeg1: EGFP) med mRNA, der koder for Halo-Keap1, og derefter behandle med Ht-PreHNE (alkyn). Efter procedurerne for trin 6.1-downstream-assay blev mulighed 1-HNE (alkyn) frigjort, og Keap1 blev mærket. Neutrofile og makrofagniveauer blev vurderet ved live imaging af reporterlinjer, henholdsvis Tg (lyz: TagRFP) og Tg (mpeg1: eGFP). Niveauet af begge celletyper faldt med 30%-40% efter Z-REX-behandling, hvor HNE blev leveret til Keap1. Tværtimod blev der ikke set tab af neutrofiler eller makrofager i Z-REX tekniske kontrolgrupper [uden lys og Ht-PreHNE (alkyn), lys alene eller Ht-PreHNE (alkyn) alene] (figur 1D og figur 2A-D).
Induktionen af neutrofil/makrofagapoptose indikerede vellykket HNE levering til Keap1 gennem Z-REX. Detaljer for vejanalyse og apoptosemekanisme er blevet offentliggjort5. For at tage højde for off-target effekter af HNE (alkyn), flere kontroller blev brugt. (1) Under de samme eksperimentelle betingelser blev embryoner injiceret med Halo-P2A-Keap1 mRNA i stedet for Halo-TeV-Keap1 mRNA. P2A-linker gjorde det muligt at udtrykke Halo- og Keap1-proteinerne uafhængigt. I dette scenarie kunne HNE (alkyn) frigivet fra Halo ikke mærke Keap1, da det ikke længere var proksimalt til Halo (figur 1D); Derfor blev apoptosesignalvejen ikke udløst. Der blev ikke observeret ændringer i makrofag- eller neutrofilniveauer i denne gruppe (figur 2A,B). (2) De samme eksperimentelle betingelser blev udført under anvendelse af mRNA-kodning af Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), en mutant af Keap1, der ikke reagerer på HNE (alkyn) (figur 1D). Der blev ikke observeret ændringer i makrofag- eller neutrofilniveauer (figur 2G,H).
Biotinazid-klikkobling og biotin pull-down assay. Vurdering af målmærkning. (Se også figur 3). Målmærkningsvurderingen blev udført ved hjælp af WT-embryoner, injiceret med mRNA, der koder for enten Halo-TeV-Keap1-2xHA (Halo-POI-fusionskonstruktion) eller Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (P2A-splitkonstruktion, hvor Halo og Keap1 ikke smeltes sammen; Figur 1D). Mærket Keap1-protein blev kun trukket ned i gruppen, der udtrykte fusionsprotein og behandlet med Z-REX (anden bane i den øverste anti-HA-blot), men ikke i andre kontrolgrupper (ingen mRNA-injektion, fusionskonstruktion uden Z-REX eller P2A-splitkonstruktion). Resultaterne indikerer, at HNE (alkyn) med succes blev leveret til Keap1, og den modificerede Keap1 blev efterfølgende konjugeret med biotin gennem klikreaktion, og den biotinmærkede Keap1 blev trukket ned af streptavidinharpiks.
Transskriptionel analyse. RNA-seq og qRT-PCR. (Se også figur 4). Den transkriptionelle ændring efter Z-REX-behandling blev vurderet ved RNA-seq og qRT-PCR. I RNA-seq blev flere immunrelaterede gener nedreguleret efter Z-REX. I modsætning hertil blev mange antioxidantrespons (AR) -relaterede gener opreguleret efter Z-REX, hvilket skyldtes induktion af Keap1-Nrf2-AR-vejen ved HNEylering på Keap110 (figur 4A). I qRT-PCR-analyse blev lignende resultater fundet ved analyse af tre immunrelaterede gener (lyz, mpeg1.1 og coro1a) (figur 4B). Op- og nedreguleringen af de respektive gener viste den vellykkede induktion af veje medieret af Keap1 HNEylering.
Helmonteret (co-) immunofluorescensfarvningsanalyse og colokaliseringsanalyse. (Se også figur 5). Den eksogene Halo-TeV-Keap1-2xHA og Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA ekspression blev vurderet ved helmonteret immunfluorescens (IF) farvning (figur 5A,B). P2A-split-konstruktionen havde to gange så mange HA-tags som TeV-fusionskonstruktionen, hvilket svarer til et dobbelt højere anti-HA-signal i P2A-split-construct-mRNA-injiceret gruppe end den anden, hvilket indikerer, at ekspressionsniveauet for de to konstruktioner var ens (figur 5C). Ekspressionsniveauerne for Halo-TeV-Keap1 (wt) og Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) blev også fundet ens, når der blev sonderet med anti-Halo (figur 5D, E). Colokalisering af neutrofiler og aktiv caspase 3 i Z-REX-behandlet Tg(lyz:TagRFP) blev observeret ved co-immunfarvning med anti-RFP og anti-aktiv-Caspase 3 (figur 5F). Active Caspase 3 er en indikator for apoptose hændelser.
Figur 1: Z-REX-arbejdsgang . (A,B) Et zebrafiskembryo på 1-4-cellestadiet injiceres med (morpholino og) mRNA, der koder for Halo-POI (f.eks. Halo-Keap1). Injicerede embryoner behandles derefter med en sonde sammensat af en HaloTag-ligand og en fotocaged elektrofil tilsat en alkynfunktionel gruppe, såsom Ht-PreHNE (alkyn) i B. Efter fjernelse af den overskydende mængde sonde udsættes embryoet for lys for at frigive elektrofilen af interesse [f.eks. HNE eller dens analog, HNE (alkyn)]. Downstream-analysen udføres på et givent/brugerdefineret tidspunkt. (C) Design og mekanisme af Ht-PreLDE-sonden, som kan anvendes på forskellige lipidafledte elektrofiler (LDE). D) negative/tekniske kontrolgrupper for Z-REX. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Live imaging af transgene neutrofile / makrofag reporter fisk udsat for Z-REX. Z-REX-medieret Keap1 HNEylering inducerer neutrofil / makrofag apoptose. (A) Repræsentative billeder af Tg(lyz:TagRFP )-fisk, der udtrykker enten Halo-TeV-Keap1 (fusionskonstruktion) eller Halo-P2A-Keap1 (delt konstruktion), og som udsættes for negative kontrolbetingelser [ingen behandling, lys alene eller Ht-PreHNE(alkyn) alene eller Z-REX]. Embryoalder: 36 hpf. (B) Kvantificering af neutrofile niveauer i A. (C) Repræsentative billeder af Tg(mpeg1:eGFP) -fisk, der udtrykker Halo-TeV-Keap1 med eller uden Z-REX-behandling. Embryoalder: 34 hpf. D) Kvantificering af makrofagniveauer i C. (E,F) Tidsforløbsmåling af (E) neutrofile og (F) makrofagniveauer efter Z-REX-behandling. G) Lignende forsøg som i A i fisk, der udtrykker enten Halo-TeV-Keap1 (WT) eller Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), en mutant, der ikke har HNE-sensorevne. (H) Kvantificering af neutrofilniveauer i G. Skalastænger: 500 μm. Alle graferne er præsenteret med gennemsnitlige ± SEM. p-værdier blev beregnet med envejs ANOVA (blå) og tosidet Student's t-test (sort). Dette tal er blevet ændret fra Poganik et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Biotin pull-down assay. WT-embryoner, der udtrykte Halo-TeV-Keap1-2XHA eller Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA, blev behandlet med Z-REX eller respektive negative kontroltilstande (ingen sondebehandling i dette tilfælde). Efter høst blev embryoner lyseret og behandlet med TeV-protease før biotin-pull-down-assayet. Resultaterne blev analyseret ved western blotting. Denne figur er blevet ændret fra Huang et al. Z-REX: hyrde reaktive elektrofiler til specifikke proteiner udtrykt enten vævsspecifikt eller allestedsnærværende og registrere de resulterende funktionelle elektrofilinducerede redoxresponser i larvefisk. Denne figur er blevet ændret fra Huang et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Transskriptionel analyse. (A) RNA-seq-resultater af Z-REX-behandlede versus ikke-behandlede embryoner. Statistisk signifikante differentialt udtrykte (SDE) gener fremhæves. Immunitetsrelaterede SDE-gener er farvet røde. Antioxidantrespons (AR)-relaterede gener er farvet grønne. Andre SDE-gener er farvet blå. Alle p-værdier blev beregnet med CuffDiff. (B-D) Tre immunitetsrelaterede SDE-gener fra A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 og (D) coro1a blev yderligere analyseret med qRT-PCR, og kun de Z-REX-behandlede embryoner viste undertrykkelsen af disse transkripter. Alle graferne er præsenteret med gennemsnitlige ± SEM. p-værdier blev beregnet med envejs ANOVA (blå) og tosidet Student's t-test (sort). Dette tal er blevet ændret fra Poganik et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Helmonteret immunfluorescensfarvningsassay . (A,B) Repræsentative billeder af embryoner, der udtrykker enten (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA eller (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA immunfarvet med anti-HA og sekundært antistof konjugeret med AlexaFluor568. mRNA-injicerede fisk blev sammenlignet med aldersmatchede ikke-injicerede fisk. C) Kvantificering af anti-HA-signal i (A,B). (D) Repræsentative billeder af embryoner, der udtrykker Halo-TeV-Keap1 (WT) eller Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) immunfarvet med anti-Halo og sekundært antistof konjugeret med AlexaFluor647. mRNA-injicerede fisk blev sammenlignet med aldersmatchede ikke-injicerede fisk. (E) Kvantificering af anti-halo-signal i D. p-værdier blev beregnet med tosidet elevs t-test. (F) Tg (lyz: TagRFP) embryoner udsat for Z-REX blev co-immunfarvet med anti-RFP og antiaktiv Caspase 3 og respektive fluoroforkonjugerede sekundære antistoffer. Den hvide boks markerer det forstørrede område. Hvide pile angiver colokaliseringer af neutrofiler og aktive Caspase 3. Skalastænger: 500 μm. Alle graferne er præsenteret med gennemsnitlig ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Poganik et al.7. og Huang et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Liste over buffere, der er anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Z-REX beskrevet i denne protokol demonstrerer en robust strategi for elektrofil-målpar-undersøgelse og dekonvolution af signalveje i levende fisk. Den nærhedsstyrede levering muliggør dosering og rumlig kontrol af den elektrofile forbindelsesbehandling. I modsætning til konventionelle bolusdoseringsmetoder, hvor de suprafysiologiske koncentrationer af elektrofil, der anvendes, ofte fører til problemer uden for målet, gør den relativt lille mængde elektrofil, der frigives til systemet, Z-REX stort set ikke-invasiv. Vi har brugt 0,1-6 μM Ht-PreHNE(alkyn) i zebrafiskembryoner, og resultaterne viste, at behandlingen ikke er skadelig for embryoudviklingen11.
Z-REX-proceduren er generelt længere end T-REX, en teknik til screening / undersøgelse af elektrofile sensing proteiner i dyrkede celler. Antag, at eksperimentets formål er at screene for elektrofile målinteraktioner; Vi foreslår, at der først udføres omfattende screening med T-REX i dyrkede celler og anvendes Z-REX til in vivo-validering og fænotypisk analyse af veje. Sammenlignet med cellekultur er kravene til udførelse af Z-REX grundlæggende fiskeopdrætsteknikker ud over biokemiske eksperimentelle færdigheder, der kræves af T-REX. En typisk tidsramme for Z-REX (fra fiskekrydsning til lysinducerbar elektrofil levering) er 2-3 dage, hvilket ikke er mere end 1 dag længere end den typiske tid for et T-REX-eksperiment på transfekterede levende celler. Live imaging til fænotypisk analyse kan udføres 2-10 timer efter lysbelysning; klikkobling med biotin-azid til pull-down assay tager 3 dage; qRT-PCR til analyse af transkriptionsrespons tager 3 dage; IF farvning tager 5 dage. Disse trin svarer stort set til deres cellekulturækvivalenter, selvom fortolkningen af data kræver en forståelse af fiskefysiologi og reporterstammer.
Som en procedure med flere variabler12 er flere kontrolgrupper nødvendige for, at Z-REX kan udelukke usikkerheder i resultaterne (figur 1D). Almindelige kontrolgrupper er: (1) DMSO/køretøjsbehandling alene; (2) sondebehandling, men uden lysbelysning; (3) lysbelysning, men uden sondebehandling; (4) P2A-opdelt konstruktion, hvor Halo og POI udtrykkes separat, så nærhedsleveringen ableres; og (5) hypomorfe mutanter, hvis elektrofil-sensing rest(er) er/er muteret, såsom Akt3 (C119S)6 og Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, som vi har brugt i tidligere undersøgelser.
Hvis nedstrøms assays involverer western blot-analyse, skal deyolking udføres før høst. Æggeblommeproteinerne reducerer nøjagtigheden af lysatkoncentrationsvurderinger og kan binde ikke-specifikt til antistoffer. Når vi udfører levende fiskebilleder eller helmonteret IF-farvning, har vi også observeret ikke-specifikke fluorescerende signaler i æggeblommesækken, sandsynligvis som følge af autofluorescerende proteiner i æggeblommesækken eller ikke-specifik binding af antistofferne selv. Hvis autofluorescenssignalet forstyrrer signalet, foreslår vi, at æggeblommesækken udelukkes fra kvantificering eller kvantificeres forskellige regioner separat. Dechorination er nødvendig for levende fisk billeddannelse og helmonteret IF-farvningsanalyse. Korionen kan forstyrre billeddannelse og senere kvantificering / celletælling. Dechorination gælder dog kun for embryoner, der er ældre end 1 dpf; Yngre embryoner i blastulerings-/gastrulations-/segmenteringsstadier er for skrøbelige til at blive dechorioneret.
Z-REX-protokollen beskrevet her er baseret på mRNA-drevet ektopisk POI-ekspression. Proceduren er hurtig sammenlignet med at bruge / generere transgene fiskelinjer. mRNA-drevet ekspression er allestedsnærværende og forbigående og varer i mindst 2 dage for mRNA'er, der anvendes i denne protokol. Ekspressionsvarigheden vil dog sandsynligvis variere i andre tilfælde. Således giver denne tilgang et hurtigt og mere globalt undersøgelsesvindue til virkningerne af en specifik elektrofil mærkningsbegivenhed, kompatibel med flere assays med høj gennemstrømning / højt indhold. Transgene linjer med stabil Halo-POI-ekspression i specifikke væv er også kompatible med Z-REX11. Sådanne linjer bruges bedst, når der skal stilles et mere præcist spørgsmål, for eksempel når en fænotype i et bestemt organ forudsiges ud fra cellekulturdata, eller når screening fra mRNA-injektionseksperimenter forudsiger, at et specifikt organ er følsomt over for en elektrofil mærkningshændelse. En hjertespecifik antioxidantresponsinduktion gennem Z-REX blev demonstreret ved hjælp af Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) fisk i vores tidligere publikation11. Det kan også være muligt at udføre Z-REX på transgene fisk, der er ældre end 2 dpf.
Disclosures
Isoformspecifikke småmolekylekinasehæmmere, hvis opdagelse blev muliggjort af REX-teknologier, er blevet indgivet til patentansøgning
Acknowledgments
Finansiering: Novartis FreeNovation, NCCR og EPFL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 10-cm Petri dishes | Celltreat | 229692 | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C-S | |
| 30% Acrylamide and bis-acrylamide solution | BioRad | 1610154 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229506 | |
| Acetone | Fisher | A/0600/15 | |
| Agarose | GoldBio | A201-100 | |
| All Blue Prestained Protein Standards | BioRad | 1610373 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Biotin-dPEG11-azide | Quanta Biodesign | 102856-142 | |
| Bradford Dye | BioRad | 5000205 | |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | |
| Capillary tubes | VWR | HARV30-00200 | |
| Chloroform | Supelco, Inc | 1.02445.1000 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cu(TBTA) | Lumiprobe | 21050 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| DMSO | Fisher | D128-500 | |
| Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150107 | 1:800 (IF) |
| Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150075 | 1:1000 (IF) |
| Donkey anti-rat-AlexaFluor 568 | Abcam | ab175475 | 1:1000 (IF) |
| ECL substrate | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| ECL-Plus substrate | Thermo Fisher Scientific | 32132 | |
| End-to-end rotator | FinePCR | Rotator AG | |
| Ethanol | Fisher | E/0650DF/15 | |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Forceps (blunt) | self made | self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40) | |
| Forceps (sharp) | Fine Science Tools | Dumont #5, 11252-40 | |
| Gel loading tip | Fisher | 02-707-181 | |
| Gel/blot imager | Vilber | Fusion FX imager | |
| Glass beads | Sigma | 45-G1145 | |
| Glass stage micrometer | Meiji Techno. | MA285 | |
| Heat inactivated FBS | Sigma | F2442 | |
| Heated ultrasonic bath | VWR | 89375-470 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| High capacity streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20359 | |
| Ht-PreHNE alkyne probe | self-made | - | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
| Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
| Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS | ||
| Injection plate | Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
| LDS | Apollo | APOBI3331 | |
| Methanol | VWR | 20864.32 | |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Microscope for micro-injection | Olympus | SZ61 | |
| Microscope light source | Olympus | KL 1600 LED | |
| Mineral oil | Sigma | M3516 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| Mouse anti- β-actin-HRP | Sigma | A3854 | 1:20000 (WB) |
| Mouse anti-HaloTag | Promega | G921A | 1:500 (IF) |
| Multi-mode reader | BioTek Instruments | Cytation 5 | |
| Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus | Biorad | Mini-Sub Cell GT Systems | |
| Oligo(dT)20 | Integrated DNA Technologies | customized: (dT)20 | |
| Orange G | Sigma | O3756 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 14190144 | |
| pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | - | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
| pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | - | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
| Pneumatic PicoPump | WPI | SYS-PV820 | |
| Protein electrophoresis equipment and supplies | Biorad | Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis | |
| Rabbit anti-active Caspase-3 | BD Pharmingen | 559565 | 1:800 (IF) |
| Rat anti-HA-HRP | Sigma | H3663 | 1:500 (IF and WB) |
| Rat anti-RFP | ChromoTek | 5F8 | 1:800 (IF) |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| RnaseZap RNA decontamination solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
| Rocking Shaker | DLAB | SK-R1807-S | |
| SDS | Teknova | S9974 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080085 | |
| t-Butanol | Sigma | 471712 | |
| TCEP-HCl | Gold Biotechnology | TCEP1 | |
| TeV protease (S219V) | self-made | - | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
| Tg(lyz:TagRFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | uwm11Tg (ZFIN) | - |
| Tg(mpeg1:eGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | gl22Tg (ZFIN) | - |
| Thermal cycler | Analytik Jana | 846-x-070-280 | |
| TMEDA | Sigma | T7024 | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-9D | |
| Tris | Apollo | APOBI2888 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T9003 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| UV lamp with 365-nm light | Spectroline | ENF 240C | |
| UV meter | Spectroline | XS-365 | |
| Vortexer | Scientific Industries, Inc. | Vortex-Genie 2 | |
| Western Blotting Transfer equipment and supplies | Biorad | Mini Trans-Blot or Criterion Blotter | |
| Zebrafish husbandry and breeding equipment | in house | ||
| Zirconia beads | BioSpec | 11079107zx |
References
- Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design. RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).
- Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants. Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).
- Parvez, S., et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).
- Long, M. J. C., et al. Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).
- Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans. Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43 (2018).
- Long, M. J. C., et al. Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response. Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).
- Poganik, J. R., et al. Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera. Nature Communications. 12 (1), 5736 (2021).
- Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling. Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Wakabayashi, N., et al. Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation. Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).
- Huang, K. -T., et al. Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish. Nature Protocols. , (2023).
- Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. Hiding in plain sight: The issue of hidden variables. ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).
