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Biology

लार्वा ज़ेबराफ़िश में ऑन-टारगेट सिग्नलिंग प्रतिक्रियाओं की निगरानी - जेड-आरईएक्स अनमास्क इलेक्ट्रोफिलिक ड्रग्स और मेटाबोलाइट्स के सटीक तंत्र

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64846
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL), 2Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, University of Utah, 4University of Lausanne (UNIL)

Summary

प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफाइल ्स और ऑक्सीडेंट (जेड-आरईएक्स) को लक्षित करने वाली ज़ेबराफिश प्रतिक्रियाशील छोटे अणु सिग्नलिंग की जांच के लिए एक रासायनिक जीव विज्ञान-आधारित विधि है। इस तकनीक को विभिन्न विकास चरणों की जीवित मछलियों पर लागू किया जा सकता है। यहां, हम सिग्नलिंग मार्ग विश्लेषण के लिए जेड-आरईएक्स के साथ जेब्राफिश में मानक परख जोड़ते हैं।

Abstract

प्रतिक्रियाशील मेटाबोलाइट्स और संबंधित इलेक्ट्रोफिलिक दवाएं अध्ययन करने के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण छोटे अणुओं में से हैं। ऐसे अणुओं की क्रिया के मोड (एमओए) को अलग करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एक विशिष्ट प्रतिक्रियाशील प्रजातियों की अधिकता के साथ प्रयोगात्मक नमूनों के थोक उपचार का लाभ उठाते हैं। इस दृष्टिकोण में, इलेक्ट्रोफाइल की उच्च प्रतिक्रिया एक समय और संदर्भ-निर्भर तरीके से प्रोटिओम के गैर-भेदभाव लेबलिंग को प्रस्तुत करती है; रेडॉक्स-संवेदनशील प्रोटीन और प्रक्रियाएं अप्रत्यक्ष रूप से और अक्सर अपरिवर्तनीय रूप से प्रभावित हो सकती हैं। असंख्य संभावित लक्ष्यों और अप्रत्यक्ष माध्यमिक प्रभावों की ऐसी पृष्ठभूमि के खिलाफ, फेनोटाइप को विशिष्ट लक्ष्य सगाई से जोड़ना एक जटिल कार्य बना हुआ है। प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफाइल ्स और ऑक्सीडेंट्स (जेड-आरईएक्स) को लक्षित करने वाली ज़ेबराफिश - लार्वा ज़ेबराफिश में उपयोग के लिए अनुकूलित एक ऑन-डिमांड प्रतिक्रियाशील-इलेक्ट्रोफाइल डिलीवरी प्लेटफॉर्म - को अन्यथा अप्रभावित जीवित मछली भ्रूण में रुचि के एक विशिष्ट प्रोटीन (पीओआई) तक इलेक्ट्रोफाइल देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस तकनीक की प्रमुख विशेषताओं में खुराक-, केमोटाइप-, और स्पैटियोटेम्पोरल-नियंत्रित सटीक इलेक्ट्रोफाइल डिलीवरी के साथ-साथ इनवेसिवनेस का निम्न स्तर शामिल है। इस प्रकार, नियंत्रण के एक अद्वितीय सूट के संयोजन के साथ, यह तकनीक ऑफ-टारगेट प्रभाव और प्रणालीगत विषाक्तता को दरकिनार कर देती है, अन्यथा प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफाइल और प्लियोट्रोपिक इलेक्ट्रोफिलिक दवाओं के लिए जानवरों के अनियंत्रित थोक जोखिम के बाद देखी जाती है। जेड-आरईएक्स का लाभ उठाते हुए, शोधकर्ता इस बात की समझ में एक पैर जमा सकते हैं कि कैसे एक विशिष्ट पीओआई के साथ विशिष्ट प्रतिक्रियाशील लिगैंड जुड़ाव के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत तनाव प्रतिक्रियाओं और सिग्नलिंग आउटपुट को बदल दिया जाता है, बरकरार जीवित जानवरों में निकट-शारीरिक परिस्थितियों में।

Introduction

सेलुलर सिग्नलिंग घटनाओं के असंख्य में छोटे प्रतिक्रियाशील अणुओं (सेल या ज़ेनोबायोटिक्स / ज़ेनोमेटाबोलाइट्स में अंतर्जात रूप से उत्पादित, जैसे ड्रग्स) और उनके प्रोटीन लक्ष्य के बीच प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। कई उदाहरणों में, इस तरह के सहसंयोजक बाध्यकारी घटनाओं का एक सबस्टोइकोमेट्रिक स्तर सेलुलर प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकता है, जिससे उदाहरण के लिए, विकास, चयापचय, एपोप्टोसिस और / या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियामें परिवर्तन हो सकता है। हालांकि, विशिष्ट बाध्यकारी घटनाओं को उनके फेनोटाइपिक परिणामों से जोड़कर कार्रवाई के मोड (एमओए) का पुनर्निर्माण चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। पारंपरिक बोलस खुराक विधियों में प्रतिक्रियाशील प्रजातियों की उच्च सांद्रता की शुरूआत शामिल होती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर प्रोटीन की भीड़ को संशोधित किया जाता है, साथ ही मॉडल जीव2 के लिए अत्यधिक विषाक्तता भी होती है। ऐसी स्थितियां आदर्श से बहुत दूर हैं। एक देशी सेलुलर संदर्भ में सटीक स्थानीयकृत इलेक्ट्रोफाइल डिलीवरी का उपयोग करके सेल संस्कृति में इन मुद्दों को हल करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी, जिसका नाम टी-आरईएक्स (लक्षित प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफाइल और ऑक्सीडेंट) 3 था। बीच के वर्षों में, पूरे जीवों में प्रयोगों पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जो गैर-रूपांतरित कोशिकाओं में विशिष्ट सेलुलर संदर्भों में प्रोटीन का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं। इस प्रकार, हमने तकनीक को कई मॉडलों के साथ संगत होने के लिए विस्तारित किया है, जिसमें डेनियो रेरियो भ्रूण मॉडल शामिल हैं। यहां, हम जेड-आरईएक्स (प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफाइल और ऑक्सीडेंट को लक्षित करने वाली ज़ेब्राफिश) प्रस्तुत करते हैं (चित्रा 1)।

जेड-आरईएक्स को समझने के लिए, यह लेख पहले आरईएक्स प्रौद्योगिकियों और उनकी अंतर्निहित अवधारणाओं को प्रस्तुत करता है। उनके मूल में, ये तकनीकें अंतर्जात शारीरिक प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफिलिक प्रजातियों (आरईएस) सिग्नलिंग को मॉडल करती हैं, यह नकल करके कि कैसे प्राकृतिक इलेक्ट्रोफाइल स्थानीय रूप से विवो में स्थानिक परिशुद्धता के साथ उत्पादित होते हैं। प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट (पीओआई) को हेलो के संलयन निर्माण के रूप में व्यक्त किया जाता है; उत्तरार्द्ध ऊतक-पारगम्य और निष्क्रिय जांच को लंगर देता है जिसमें फोटोकेज्ड आरईएस को 1: 1 स्टोइकोमेट्री में रखा जाता है। ऐसा ही एक अंतर्जात आरईएस 4-हाइड्रॉक्सीनोनल (एचएनई इसके बाद) है, जिसे जांच एचटी-प्रीएचएनई में फोटोकेज्ड किया गया है। कई उदाहरणों में, हम एचएनई के एक एल्केनी-कार्यात्मक संस्करण का उपयोग करते हैं [यानी, एचएनई (एल्केन)], जिसमें अनिवार्य रूप से एचएनई के समान जैविक गुण हैं, लेकिन इसे क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा लेबल किया जा सकता है। जांच, जिसे हेलो के साथ प्रतिक्रिया के लिए क्लोरोएल्केन के साथ कार्यात्मक भी किया जाता है, को एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) के रूप में जाना जाता है। हेलो-पीओआई संलयन का परिसर और इस प्रकार गठित जांच यूवी प्रकाश के साथ विकिरण पर फ्यूज्ड पीओआई को आरईएस के समीपस्थ वितरण की अनुमति देती है। यदि पीओआई मुक्त आरईएस के साथ तेजी से प्रतिक्रिया करता है, तो आरईएस के साथ पीओआई के परिणामस्वरूप सहसंयोजक लेबलिंग हमें गतिज-विशेषाधिकार प्राप्त सिस्टीन की पहचान करने की अनुमति देती है।

जेड-आरईएक्स आरईएक्स प्रौद्योगिकियों के उपरोक्त फायदे लेता है और उन्हें जीवित मछली में विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से लागू करता है। इस प्रोटोकॉल को ज़ेबराफ़िश (डी रेरियो) के लिए अनुकूलित किया गया है, क्योंकि वे आनुवंशिक रूप से लेने योग्य कशेरुक जीव हैं जो विकास के दौरान पारदर्शी होते हैं, और इस प्रकार आरईएक्स प्रौद्योगिकियों जैसी ऑप्टो-केमिकल / -आनुवंशिक तकनीकों के लिए आदर्श होते हैं। फिर भी, एक समान रणनीति अन्य आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य मछली प्रजातियों पर भी अच्छी तरह से काम करने की संभावना है, क्योंकि विधि की व्यापक प्रयोज्यता लिपिड-व्युत्पन्न इलेक्ट्रोफाइल (एलडीई) वितरण के छद्म-इंट्रामोलेक्यूलर तंत्र के कारण है। दरअसल, प्रक्रिया अत्यधिक जैव-संगत है, क्योंकि मछली को विकास पर किसी भी ध्यान देने योग्य प्रभाव के बिना कम से कम 48 घंटे के लिए जेड-आरईएक्स फोटोकेज्ड-इलेक्ट्रोफाइल [जैसे, एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी)] के साथ इलाज किया जा सकता है। एलिगेंस 4,5 में एक समान प्रोटोकॉल कार्य करता है।

प्रोटोकॉल पहले भ्रूण जेब्राफिश मॉडल में एक गैर-देशी हेलो-पीओआई संलयन निर्माण की क्षणिक अभिव्यक्ति का उत्पादन करने के लिए एमआरएनए इंजेक्शन के उपयोग का वर्णन करता है, 1-1.5 दिन बाद निषेचन (डीपीएफ)। इसके परिणामस्वरूप मछली के भीतर अधिकांश कोशिकाओं में एक्टोपिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति होती है (इसके बाद 'सर्वव्यापी' के रूप में संदर्भित), विशिष्ट ऊतकों या स्थानों के बजाय; हालांकि, डेटा से पता चलता है कि कुछ मामलों में सेल-विशिष्ट प्रभाव देखे जा सकते हैं। इंजेक्शन के बाद, भ्रूण को निषेचन (एचपीएफ) के बाद 30.5 घंटे तक जांच की कम सांद्रता [0.3-5 μM Ht-PreHNE (एल्केनी)] के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। फिर, उपयोगकर्ता-निर्धारित समय पर, मछली के भीतर पीओआई को आरईएस की डिलीवरी 2-5 मिनट के लिए फोटोनकेजिंग करके प्राप्त की जाती है। आरईएस के फोटोनकेजिंग के बाद, अगले 2-10 घंटों में विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम फेनोटाइपिक परख किए जा सकते हैं: 1) रिपोर्टर लाइनों की लाइव इमेजिंग (चित्रा 2 ए); 2) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा लक्ष्य-लेबलिंग मूल्यांकन (चित्रा 3); 3) ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण (चित्रा 4); या 4) पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 5)।

रिपोर्टर लाइनों की लाइव इमेजिंग के एक उदाहरण के रूप में, जेड-आरईएक्स को मछली लाइनों, टीजी (lyz: TagRFP) और Tg (mpeg1: eGPP) की लाइव इमेजिंग के साथ मिलकर प्रदर्शित किया जाता है, यह मापने के लिए कि एक विशिष्ट इलेक्ट्रोफाइल-सेंसर POI (अर्थात् Keap1) का आरईएस संशोधन क्रमशः न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के स्तर को कैसे कम करता है, मछली में अन्य कोशिकाओं पर कोई अवलोकन योग्य प्रभाव नहीं पड़ता है। हालांकि, हमने पहले दिखाया है कि पीओआई-लेबलिंग और टी-आरईएक्स अध्ययनों से परिणामी मार्ग सिग्नलिंग को कई प्रोटीनों के लिए जेड-आरईएक्स का उपयोग करके पुन: पेश किया जा सकता है: एकेटी 3 6, कीप 17, और यूबीई 2 वी2 6। कुल मिलाकर, जेड-आरईएक्स के साथ, वैज्ञानिक कई जटिल रेडॉक्स मार्गों के संदर्भ में आरईएस द्वारा पीओआई के सहसंयोजक संशोधन के परिणाम (ओं) का अध्ययन कर सकते हैं। यह तकनीक अधिक प्रासंगिक रूप से प्रासंगिक पूरे पशु मॉडल में सहसंयोजक दवा डिजाइन और नवीन दवा तंत्र के लिए लक्ष्यों और उनके कार्यात्मक अवशेषों को इंगित करने के लिए प्रमुख है।

Protocol

कॉर्नेल विश्वविद्यालय (संयुक्त राज्य अमेरिका) में जेब्राफिश पालन और हैंडलिंग प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए किया गया था और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। स्विस फेडरल इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी लॉज़ेन (ईपीएफएल, स्विट्जरलैंड) की ज़ेबराफ़िश इकाई में ज़ेबराफिश पालन और हैंडलिंग प्रक्रियाओं को पशु कल्याण अधिनियम एसआर 455 और पशु कल्याण अध्यादेश एसआर 455.1 के बाद कैंटोनल पशु चिकित्सा प्राधिकरण वीडी-एच 23 के साथ किया गया था।

नोट: इस प्रोटोकॉल में, Z-REX को प्रदर्शित करने के लिए हेलो-TeV-Keap1 को व्यक्त करने वाली Tg (lyz: TagRFP ) और Tg (mpeg1: EGFP) मछली लाइनों का उपयोग किया जाता है। विधि को रुचि के अन्य प्रोटीनों, ट्रांसजेनिक रिपोर्टर मछली लाइनों और डाउनस्ट्रीम जैविक परख तक बढ़ाया जा सकता है। इस अध्ययन में उपयोग किए गए बफर के लिए पूरक तालिका 1 देखें। सभी अभिकर्मकों, उपकरणों, उपकरणों, एंटीबॉडी, प्लास्मिड, ज़ेबराफ़िश उपभेदों और उपकरणों को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।

1. एमआरएनए तैयारी

  1. एममैसेज एममशीन एसपी 6 इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके हेलो-टीईवी-कीप 1-2एक्सएचए और हेलो-2एक्सएचए-पी 2 ए-कीप 1-2 एक्सएचए एमआरएनए तैयार करें।
    नोट: निर्माता के निर्देशों का पालन करें और प्रत्येक एमआरएनए के लिए 40 μL स्केल प्रतिक्रियाएं करें। एमआरएनए गोली को न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 10 μL में फिर से घोलें।
  2. एमआरएनए गुणवत्ता का आकलन करें और माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा एकाग्रता को मापें। अच्छी गुणवत्ता वाले एमआरएनए में ए260/ए280 अनुपात होना चाहिए जो लगभग 2.0 या उससे ऊपर हो।
  3. न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ एमआरएनए को 1-1.5 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करें।
  4. एमआरएनए समाधान (1-2 μL प्रति ट्यूब) को एलिकोट करें, और एलिकोट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. मछली भ्रूण का उत्पादन

  1. विकल्प 1: जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) मछली भ्रूण का उत्पादन।
    1. 10 अलग-अलग टैंकों में 10 मछली पार करने वाले जोड़े स्थापित करें, प्रत्येक टैंक में नर और मादा मूल मछली के बीच एक विभाजक होता है।
      नोट: कुल 10 क्रॉसिंग जोड़े आमतौर पर परख के लिए पर्याप्त संख्या में भ्रूण प्रदान करते हैं। क्रॉसिंग जोड़े की संख्या को प्रयोग डिजाइन / आवश्यकता और मूल मछली की उर्वरता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
    2. अगली सुबह, इंजेक्टर स्थापित करने के बाद, टैंकों में से पांच में डिवाइडर को हटा दें। मछली के संभोग के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. माता-पिता की मछली को दूसरे टैंक में ले जाएं, एक छन्नी के माध्यम से टैंक के पानी को पारित करके भ्रूण एकत्र करें, और फिर छन्नी से भ्रूण को 10 सेमी पेट्री डिश में कुल्ला करें। इन भ्रूणों का उपयोग इंजेक्शन के पहले दौर के लिए किया जाएगा।
      नोट: यदि एक निश्चित बैच से अंडे की गुणवत्ता खराब है (उदाहरण के लिए, प्रोटीन के एकत्रीकरण के कारण अंडे अपारदर्शी हैं), तो उन्हें अन्य भ्रूणों के साथ पूल न करें।
    4. (वैकल्पिक) इंजेक्शन के अगले दौर के लिए अन्य पांच टैंकों पर चरण 2.1.2-2.1.3 में वर्णित समान प्रक्रियाएं करें।
      नोट: भ्रूण के बीच उम्र के अंतर को कम करने के लिए, इंजेक्शन का केवल एक दौर करना सबसे अच्छा है। हालांकि, यदि एक लॉट में इंजेक्शन की तुलना में अधिक भ्रूण की आवश्यकता होती है, तो एमआरएनए इंजेक्शन के दौरान भ्रूण 1-4-सेल चरण में रहने के लिए इंजेक्शन के दो दौर करने की सिफारिश की जाती है। इंजेक्शन राउंड की संख्या ऑपरेटर के इंजेक्शन कौशल और प्रयोग डिजाइन के अनुसार समायोजित की जा सकती है। हालांकि, 2 घंटे के भीतर पूरी प्रक्रिया (पहले विभाजक को हटाने से लेकर अंतिम भ्रूण के इंजेक्शन तक) करने का सुझाव दिया जाता है। भ्रूण में एक बड़ा उम्र का अंतर प्रयोग के परिणामों की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता को खराब कर सकता है।
  2. विकल्प 2: विषम ट्रांसजेनिक न्यूट्रोफिल / मैक्रोफेज रिपोर्टर मछली भ्रूण का उत्पादन।
    1. 10 अलग-अलग टैंकों में 10 मछली पार करने वाले जोड़े स्थापित करें, जिसमें प्रत्येक टैंक को नर और मादा मूल मछली के बीच एक विभाजक के साथ डाला गया है: डब्ल्यूटी मछली बनाम टीजी (lyz: TagRFP), या WT मछली बनाम Tg (mpeg1: eGFP)।
      नोट: विषम ट्रांसजेनिक मछली के बीच इन-क्रॉस से बचें, जो डाउनस्ट्रीम फ्लोरोसेंट रीडआउट को प्रभावित कर सकता है क्योंकि होमोजीगस रिपोर्टर मछली विषम मछली की तुलना में उच्च फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाती है। इमेजिंग करते समय ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों और डब्ल्यूटी भ्रूण को आसानी से पहचाना जा सकता है। एक ही पूल में डब्ल्यूटी और विषम भ्रूण का मिश्रण होना कोई समस्या नहीं है। टैगआरएफपी न्यूट्रोफिल की रिपोर्ट करता है, और एमपीईजी: ईजीएफपी मैक्रोफेज की रिपोर्ट करता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य रिपोर्टर मछली लाइनों पर भी लागू किया जा सकता है।
    2. चरण 2.1.2-2.1.4 का पालन करें।

3. माइक्रोइंजेक्टर सेटअप

  1. वायु स्रोत चालू करें, पीठ के दबाव को 0.2-0.5 पीएसआई पर सेट करें, और इंजेक्शन दबाव को 25-30 पीएसआई पर सेट करें। दिखाए गए दबाव की विशिष्ट सीमा आमतौर पर अनुशंसित होती है।
    नोट: सुई में मछली मीडिया बैकफ्लो को रोकने के लिए एक स्थिर पीठ दबाव होना आवश्यक है। चरण 3.8 में इंजेक्शन की मात्रा को कैलिब्रेट करते समय, केवल इंजेक्शन का समय बदला जाना चाहिए। निम्नलिखित चरणों में इंजेक्शन दबाव न बदलें; कम इंजेक्शन दबाव सतह और इंटरफेशियल तनाव के कारण इंजेक्शन विफलता का कारण बन सकता है, जबकि उच्च इंजेक्शन दबाव भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है।
  2. RNase परिशोधन समाधान के साथ उपकरण और इंजेक्शन प्लेटफ़ॉर्म को साफ करें।
    नोट: RNase, जो एमआरएनए को नीचा दिखाता है, ऑपरेटर या उपकरण से आ सकता है। प्रयोग से पहले सफाई करना और दस्ताने पहनना आवश्यक है।
  3. (वैकल्पिक) यदि एमआरएनए और मोर्फोलिनो को सह-इंजेक्शन दिया जाता है, तो दोनों को 0.2 एमएल ट्यूब में प्रीमिक्स करें।
    नोट: जेड-आरईएक्स 250-1500 एनजी / μL की एकाग्रता के साथ हेलो-टीईवी-कीप 1-2एक्सएचए एमआरएनए समाधान का उपयोग करके अच्छी तरह से काम करता है। जेब्राफिश में कई मोर्फोलिनोस का भी उपयोग किया गया है, और इष्टतमसांद्रता 7 बताई गई है। यदि एक अप्रकाशित अनुक्रम के साथ मोर्फोलिनो का उपयोग कर रहा है, तो ऑपरेटर को जेड-आरईएक्स में इसका उपयोग करने से पहले मोर्फोलिनो की विषाक्तता और जीन वध दक्षता का आकलन करना चाहिए।
  4. एमआरएनए के 1-2 μL (और / या मोर्फोलिनो जहां लागू7) को माइक्रो-लोडर पिपेट टिप के साथ एक इंजेक्शन सुई में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि फ्लेमिंग / ब्राउन माइक्रोपिपेट पुलर के साथ सुई तैयार की जाती है, तो सेटअप निम्नानुसार है। गर्मी: 520 इकाइयाँ; पुल की ताकत: 60 इकाइयां; वेग: 70 इकाइयाँ; देरी: 155 इकाइयां; दबाव: 550 इकाइयाँ; रैंप: 530 इकाइयां।
  5. माइक्रोइंजेक्शन मैनिपुलेटर पर सुई स्थापित करें।
    नोट: वायु स्रोत से पीठ के दबाव को एमआरएनए (/मोर्फोलिनो) समाधान को सुई की नोक पर धकेलना चाहिए।
  6. सुई की नोक को तोड़ने के लिए तेज बल या रेजर ब्लेड का उपयोग करें, जिससे इंजेक्शन के लिए एक उपयुक्त उद्घाटन बन सके।
  7. एक स्टेज माइक्रोमीटर पर खनिज तेल में सुई की नोक को डुबोएं।
  8. नोक में हवा के बुलबुले को हटाने के लिए दो या तीन इंजेक्शन दालें लगाएं।
  9. इंजेक्शन के समय को बदलकर ड्रॉप आकार को 2 एनएल तक कैलिब्रेट करें।
    नोट: यह हेमोसाइटोमीटर पर रखे खनिज तेल (जो जर्दी थैली की चिपचिपाहट की नकल करता है) में इंजेक्ट करके सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, इंजेक्शन के दौरान बनने वाली बूंद के आकार का अनुमान लगाने के लिए हेमोसाइटोमीटर की ग्रिडलाइन का उपयोग करें, और तदनुसार इंजेक्शन समय को समायोजित करें। हालांकि फिनोल लाल डाई का उपयोग कभी-कभी किया जाता है, यहां वर्णित एमआरएनए इंजेक्शन प्रक्रिया में इसकी आवश्यकता नहीं देखी गई है।

4. माइक्रोइंजेक्शन

  1. ताजा 10% हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) माध्यम के साथ एक इंजेक्शन प्लेट भरें, और प्लेट के खांचे में भ्रूण को कुंद बल के साथ संरेखित करें।
    नोट: इंजेक्शन प्लेट 10% एचबीएसएस माध्यम में 2% अगारोस के साथ तैयार की जाती है; खांचे एक प्लास्टिक मोल्ड का उपयोग करके बनाए जाते हैं।
  2. इंजेक्शन प्लेट में 10% एचबीएसएस माध्यम में सुई की नोक को डुबोएं।
  3. नोक में हवा के बुलबुले को हटाने के लिए दो या तीन इंजेक्शन दालें लगाएं।
  4. प्रत्येक इंजेक्शन के लिए, एक ही चाल में कोरियन और जर्दी थैली में प्रवेश करें और एक इंजेक्शन पल्स लागू करें। इस इंजेक्शन तरल को इंजेक्शन के ठीक बाद जर्दी थैली के भीतर एक छोटे से स्फेरॉइड के रूप में देखा जा सकता है। यह छोटा स्फेरॉइड अपेक्षाकृत तेजी से फैलता है। अन्य भ्रूणों के लिए इस चरण को दोहराएं, जब तक कि इंजेक्शन वाले भ्रूण की पर्याप्त संख्या प्राप्त न हो जाए।
    नोट: भ्रूण की जीवित रहने की दर (इंजेक्शन और गैर-इंजेक्शन दोनों) आमतौर पर 50% -90% से भिन्न होती है। प्रयोगात्मक समूह के लिए आवश्यक भ्रूण की संख्या को दोगुना करने का लक्ष्य रखें। बायोटिन पुल-डाउन परख में, प्रत्येक स्थिति के लिए 100-140 व्यवहार्य भ्रूण की आवश्यकता होती है। क्यूआरटी-पीसीआर परख में, प्रत्येक स्थिति के लिए पांच व्यवहार्य भ्रूण की सिफारिश की जाती है। लाइव मछली इमेजिंग और पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परख के लिए नमूना आकार उपयोगकर्ता-परिभाषित है; विश्लेषण में अच्छी सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करने के लिए प्रति स्थिति कम से कम 20 व्यवहार्य भ्रूण होने की सिफारिश की जाती है।
  5. इंजेक्शन वाले भ्रूण को एक नए 10 सेमी पेट्री डिश में कुल्ला करें जिसमें ताजा 10% एचबीएसएस मीडिया होता है।
    नोट: भ्रूण को आसानी से एक धारा की बोतल का उपयोग करके खांचे से बाहर निकाला जा सकता है।
  6. गैर-इंजेक्शन भ्रूण को दूसरी प्लेट में पूल करें।
    नोट: गैर-इंजेक्शन भ्रूण आवश्यकतानुसार मछली के स्वास्थ्य, बेसलाइन प्रोटीन अभिव्यक्ति, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर आदि के लिए गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं। यदि इंजेक्शन प्रक्रिया अच्छी तरह से काम करती है, और इंजेक्शन एमआरएनए / मोर्फोलिनो भ्रूण के लिए घातक नहीं है, तो इंजेक्शन और गैर-इंजेक्शन भ्रूण में समान व्यवहार्यता होनी चाहिए।

5. जेड-आरईएक्स

  1. प्रयोग सेटअप (यानी, नियंत्रण / प्रयोग समूहों की संख्या) के अनुसार, इंजेक्शन भ्रूण को 10 सेमी व्यंजनों में वितरित करें।
  2. लाल-प्रकाश रोशनी वाले अंधेरे कमरे में, मीडिया को 10% HBSS के 30 मिलीलीटर के साथ या उसके बिना 1 μM Ht-PreHNE (alkyne) के साथ बदलें।
    नोट: एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) एक हल्का-लेबिल यौगिक है। भ्रूण को निम्नलिखित चरणों में अंधेरे में रखा जाना चाहिए।
  3. अंधेरे में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को सेने दें।
  4. 30.5 एचपीएफ पर, एक अंधेरे कमरे में, मीडिया को 10% एचबीएसएस के ताजा 30 एमएल के साथ बदलें।
    नोट: माध्यम को प्रतिस्थापित करते समय, जितना संभव हो उतना पुराने माध्यम को हटा दें। यह भ्रूण से एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) की अनबाउंड / अतिरिक्त मात्रा को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. 30 मिनट के लिए अंधेरे में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इनक्यूबेट करें।
  6. चरण 5.4-5.5 को दो बार दोहराएं।
  7. दीपक को गर्म करने के लिए 5 मिनट के लिए यूवी लैंप (365 एनएम, 3 एमडब्ल्यू / सेमी2) चालू करें।
    नोट: लैंप प्रीवार्मिंग चरण चरण चरण 5.8 से पहले किया जाना चाहिए। चालू होने के बाद पहले कुछ मिनटों में लैंप की शक्ति कम / अस्थिर होती है। लैंप पावर को नियमित रूप से यूवी मीटर द्वारा मापा जाना चाहिए।
  8. 32 एचपीएफ पर, भ्रूण को यूवी प्रकाश में उजागर करें।
    1. विकल्प 1: लाइव फिश इमेजिंग, होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग, इन-जेल फ्लोरेसेंस एनालिसिस (साइ 5 एज़ाइड के साथ युग्मन पर क्लिक करें), आरएनए-सेक, या क्यूआरटी-पीसीआर जैसे डाउनस्ट्रीम रीडआउट के लिए, भ्रूण को 3 मिनट के लिए यूवी प्रकाश में उजागर करते हैं, प्लेटों को हर 30 सेकंड में घुमाते हैं।
    2. विकल्प 2: डाउनस्ट्रीम रीडआउट के लिए, जैसे कि बायोटिन पुल-डाउन परख, भ्रूण को अधिकतम 5 मिनट (और न्यूनतम 3 मिनट) के लिए यूवी प्रकाश में उजागर करें, हर 30 सेकंड में प्लेटों को घुमाएं, और प्लेटों को 1 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें।
      नोट: यदि विभिन्न जांचों का उपयोग किया जाता है, तो प्रकाश एक्सपोजर समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है, जो किसी दिए गए फोटोकेज्ड इलेक्ट्रोफाइल जांच और प्रकाश स्रोत के लिए फोटोनकिंग के टी1/2 पर निर्भर करता है। टी1/2फोटोनकेजिंग ज्ञात प्रक्रियाओं का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है8. एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) के लिए, टी 1/2 < 1 मिनट3 है; इस प्रकार, ऊपर दिया गया समय पर्याप्त है।

6. डाउनस्ट्रीम परख

  1. विकल्प 1: फेनोटाइपिक परख। मैक्रोफेज रिपोर्टर की लाइव इमेजिंग
    मछली लाइनें, Tg (lyz: TagRFP) और Tg (mpeg1: eGFP) (चित्रा 2)।
    1. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन से भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें।
      नोट: प्रति स्थिति कम से कम 20 व्यवहार्य भ्रूण होने की सिफारिश की जाती है।
    2. प्लेट से अनफर्टिलाइज्ड /मृत भ्रूण को हटा दें।
      नोट: अनिषेचित / मृत भ्रूण बादल / गैर-पारदर्शी होते हैं, और उन्हें नेत्रहीन रूप से पहचाना जा सकता है। यदि उच्च मृत्यु दर देखी जाती है, तो इंजेक्शन प्रक्रिया पर वापस जांच ें या एमआरएनए या मोर्फोलिनो की एकाग्रता को कम करने का प्रयास करें।
    3. भ्रूण को तेज बल के साथ डिकोरियोनेट करें। लार्वा मछली को छुए बिना, कोरियन को एक जोड़ी बल के साथ पकड़ें, और कोरियन को चीरने के लिए बल की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। भ्रूण नाजुक है। डिकोरियोनेशन करते समय केवल कोरियन को स्पर्श करें।
      नोट: यह आम है, विशेष रूप से शुरुआती लोगों में, डिकोरियोनेशन के दौरान कुछ भ्रूणों को नुकसान पहुंचाना। इसलिए, हमेशा न्यूनतम आवश्यक से अधिक भ्रूण रखें।
    4. भ्रूण को 2% अगारोस प्लेट (10% एचबीएसएस माध्यम के साथ तैयार) पर माउंट करें और भ्रूण को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (उज्ज्वल क्षेत्र और संबंधित फ्लोरोसेंट चैनल) (चित्रा 2 ए, सी, जी) के साथ चित्रित करें।
      नोट: Z-REX [हेलो-TeV-Keap1-2xHA MRNA इंजेक्शन और Ht-PreHNE (एल्केनी) उपचार के संयोजन के बाद, न्यूट्रोफिल (lyz: TagRFP) की कमी 36 hpf (4 h पोस्ट Z-REX) पर सबसे महत्वपूर्ण पाई गई, जबकि मैक्रोफेज (mpeg1: eGFP) की कमी 34 hpf (2 h पोस्ट Z-REX) पर सबसे महत्वपूर्ण थी। विभिन्न रिपोर्टर लाइनों, एमआरएनए / मोर्फोलिनो, या जांच का उपयोग करते समय अन्य समय बिंदुओं का उपयोग किया जा सकता है। एक्सपोज़र समय और / या लाभ को एकल कोशिकाओं या वांछित विशिष्ट (अल्ट्रा) संरचनाओं को देखने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    5. इमेजजे (एनआईएच) (चित्रा 2 बी, डी-एफ, एच) द्वारा प्रत्येक मछली के न्यूट्रोफिल / मैक्रोफेज संख्या की गणना करें। पूरी मछली को घेरने के लिए इमेजजे में फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें, और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की गणना करने के लिए फाइंड मैक्सिमा विकल्प का उपयोग करें।
  2. विकल्प 2: लक्ष्य-लेबलिंग मूल्यांकन। बायोटिन एजाइड-क्लिक युग्मन और बायोटिन पुल-डाउन परख (चित्र 3)
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करके भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें। यह आमतौर पर 10 मिनट लगते हैं।
      नोट: पर्याप्त मछली लाइसेट प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक स्थिति के लिए 100-140 व्यवहार्य भ्रूण की आवश्यकता होती है।
    2. प्लेट से अनफर्टिलाइज्ड /मृत भ्रूण को हटा दें।
    3. डिकोरियोनेशन और डियोलकिंग करें। कोरियन को तेज बल की एक जोड़ी के साथ पकड़कर, जर्दी थैली में प्रवेश करने के लिए बल की दूसरी जोड़ी का उपयोग करके, और फिर जर्दी प्रोटीन को बाहर आने की अनुमति देने के लिए कोरियन को हटाते हुए जर्दी थैली को अलग करके दो जोड़तोड़ करें।
      नोट: इस चरण में जर्दी प्रोटीन को हटाना महत्वपूर्ण है। नमूने में प्रचुर मात्रा में जर्दी प्रोटीन बाद के विश्लेषण में हस्तक्षेप करते हैं।
    4. 1.5 एमएल ट्यूब में जर्दी भ्रूण को स्थानांतरित करें।
      नोट: प्लेट को जर्दी भ्रूण को केंद्र में रखने के लिए घुमाएं, जो संग्रह की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रक्रिया के दौरान हल्का कोरियन मलबा दूर चला जाता है।
    5. भ्रूण के ट्यूब तल तक व्यवस्थित होने के बाद, सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और 1 मिलीलीटर ठंडा एचईपीईएस-बफर्ड खारा (पीएच 7.6) जोड़ें।
    6. चरण 6.2.5 को दो बार दोहराएँ।
    7. (वैकल्पिक) यदि तुरंत अगले चरण के साथ आगे बढ़ने का इरादा नहीं है, तो बफर को हटा दें, तरल नाइट्रोजन में नमूनों को फ्लैश फ्रीज करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: डेयोल्केड मछली के छर्रों को तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। फ्लैश-जमे हुए नमूने 2 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    8. लाइसिस बफर में मछली के छर्रों को फिर से निलंबित करें।
      नोट: लाइसिस बफर (पीएच 7.6) सोयाबीन से 50 एमएम एचईपीएस, 100 एमएम एनएसीएल, 1% ट्राइटन एक्स -100, 0.3 एमएम टीसीईपी, 2 एक्स रोश कोम्पलेट मिनी ईडीटीए-मुक्त प्रोटीज इनहिबिटर और 0.1 मिलीग्राम / एमएल ट्रिप्सिन अवरोधक से बना है। एक भ्रूण लगभग 2 μg लाइसेट देता है। प्रत्येक 120 भ्रूण के लिए 100 μL लाइसिस बफर का उपयोग करें। उपयोग से ठीक पहले लाइसिस बफर में सोयाबीन से दो रोश कोम्पलेट मिनी ईडीटीए-मुक्त प्रोटीज इनहिबिटर और ट्रिप्सिन इनहिबिटर जोड़े जाने चाहिए।
    9. ट्यूब में 20% वी / वी ज़िरकोनिया मोती जोड़ें।
    10. 20 सेकंड के लिए भंवर, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज, और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलना।
    11. चरण 6.2.10 को दो बार दोहराएँ।
    12. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
    13. सतह पर तैरनेवाला को एक नए, प्रीचिल्ड 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    14. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
    15. लाइसेट को 1 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करें।
    16. प्रत्येक स्थिति के लिए, लाइसेट के 170 μg को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    17. चरण 6.2.16 से लाइसेट को 0.2 मिलीग्राम / एमएल टीईवी प्रोटीज (एस 21 9 वी) के साथ मिलाएं, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
      नोट: गैर-टीईवी प्रोटीज-उपचारित समूहों के लिए, बस लाइसेट को अन्य समूहों में उपयोग किए जाने वाले टीईवी प्रोटीज समाधान के लिए लाइसिस बफर के बराबर वॉल्यूम के साथ मिलाएं।
    18. बायोटिन-एज़ाइड क्लिक प्रतिक्रिया के लिए 10x मास्टर मिश्रण तैयार करें: 10% w / v SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM Cu (TBTA), 1 mM बायोटिन-एज़ाइड और 20 mM TCEP।
      नोट: चरण 6.2.19 से ठीक पहले मिश्रण में TCEP जोड़ें।
    19. चरण 6.2.17 से (टीईवी प्रोटीज-पचे हुए) लाइसेट में टी-ब्यूओएच के 8.5 μL और 10x क्लिक प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण के 17 μL जोड़ें। भंवर, सेंट्रीफ्यूज, और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
    20. समाधान में एक और 1 एमएम टीसीईपी जोड़ें, और फिर भंवर, सेंट्रीफ्यूज, और समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। चरण 6.2.19-6.2.20 के लिए इनक्यूबेशन समय कुल मिलाकर 30 मिनट है।
      नोट: टीसीईपी का यह पूरक, क्यू (आई) उत्पन्न करने के लिए एक कम करने वाला अभिकर्मक, क्लिक प्रतिक्रिया दक्षता में सुधार करता है।
    21. प्रत्येक ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस इथेनॉल के 600 μL जोड़ें, घोल को भंवर करें, और इसे रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: नमूने 1 सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; यदि नहीं, तो तुरंत अगले चरण के साथ आगे बढ़ें।
    22. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद ट्यूब के तल में एक गोली बननी चाहिए, जो वांछित अंश है।
    23. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, -20 डिग्री सेल्सियस इथेनॉल, भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x g पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें।
    24. चरण 6.2.23 दोहराएँ।
    25. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, -20 डिग्री सेल्सियस एसीटोन, भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
    26. सतह पर तैरने वाले को हटा दें। अतिरिक्त अवशिष्ट एसीटोन को वाष्पित होने दें, हालांकि पूरी तरह से सूखापन के लिए नहीं।
    27. गोली को 100 μL रिसस्पेंशन बफर (8% w/v लिथियम डोडेसिल सल्फेट [LDS], 1 mM EDTA में 50 mM HEPES खारा, pH 7.6), भंवर 15 s के लिए और सोनिकेट में तब तक पुन: निलंबित करें जब तक कि गोली भंग न हो जाए।
    28. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 21,000 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
    29. सतह पर तैरनेवाला को एक नई 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 50 एमएम एचईपीईएस खारा, पीएच 7.6 के 1.5 एमएल जोड़ें।
      नोट: इस चरण में एलडीएस की अंतिम एकाग्रता 0.5% है। उच्च एलडीएस सांद्रता पुल-डाउन दक्षता को कम कर सकती है। इस प्रकार, हालांकि एलडीएस एकाग्रता बढ़ाने से गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने में सहायता मिल सकती है, यह पुलडाउन की दक्षता को भी कम कर सकती है। तदनुसार, इस चरण में एलडीएस एकाग्रता को नहीं बदलने की सिफारिश की जाती है।
    30. "इनपुट" नमूना एकत्र करें (चित्रा 3): 1 मिलीग्राम / एमएल लाइसेट के 30 μL को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 6% β-मर्कैप्टोइथेनॉल (बीएमई) युक्त 4x लेम्मली नमूना बफर के 10 μL जोड़ें। समाधान को फ़्लैश फ्रीज करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    31. बेड-वॉल्यूम स्ट्रेप्टाविडिन उच्च क्षमता राल के 100 μL को एक नई 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 50 mM HEPES खारा (pH 7.6) में 0.5% LDS का 1 mL जोड़ें, 2 मिनट के लिए RT पर 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 50 mM HEPES खारा (pH 7.6) में 0.5% LDS के एक और 1 मिलीलीटर के साथ धोने को दोहराएं।
    32. चरण 6.2.29 से समाधान को चरण 6.2.31 से प्रीवाशकिए गए स्ट्रेप्टाविडिन उच्च क्षमता वाले राल युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 4-6 घंटे के लिए आरटी पर एंड-ओवर-एंड मिक्सर पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
    33. 2 मिनट के लिए आरटी पर 1,500 x g पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले का 30 μL लें, और इसे "फ्लोथ्रू" नमूने के लिए 6% BME युक्त 4x Laemmli नमूना बफर के 10 μL के साथ मिलाएं। फिर, शेष सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
      नोट: स्ट्रेप्टाविडिन पुल-डाउन दक्षता की जांच के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा "फ्लोथ्रू" नमूनों का विश्लेषण किया जा सकता है। अनबाउंड प्रोटीन को धोने के लिए जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को हटाना आवश्यक है। सबसे पहले, पी -1000 पिपेट का उपयोग करके अधिकांश सुपरनैटेंट को हटा दें, और फिर जेल लोडिंग टिप के साथ पी -20 पिपेट का उपयोग करके शेष सुपरनैटेंट को हटा दें।
    34. राल में 50 एमएम एचईपीईएस खारा (पीएच 7.6) में 0.5% एलडीएस का 1 एमएल जोड़ें, और मिश्रण को 30 मिनट के लिए आरटी पर एंड-ओवर-एंड रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें।
    35. 2 मिनट के लिए आरटी पर 1,500 x g पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाला को हटा दें।
      नोट: आमतौर पर, 0.5% एलडीएस अधिकांश गैर-विशिष्ट बाध्यकारी प्रोटीन को हटाने के लिए पर्याप्त है। यदि बाद के विश्लेषण में गैर-विशिष्ट बाध्यकारी संकेत अभी भी देखे जाते हैं, तो वॉश बफर में एलडीएस एकाग्रता को बढ़ाया जा सकता है।
    36. चरण 6.2.34-6.2.35 को दो बार दोहराएँ।
    37. राल में 6% बीएमई युक्त 2x Laemmli नमूना बफर के 40 μL जोड़ें।
    38. 5 मिनट के लिए मिश्रण को 98 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट करके बंधे प्रोटीन को पिघलाएं।
    39. 5 मिनट के लिए आरटी पर 21,000 x g पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह "इल्यूट" नमूना है।
      नोट: जेल में चरण 6.2.38 से राल युक्त समाधान सीधे लोड करना एसडीएस-पेज विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है।
    40. 10-लेन 10% पॉलीक्रिलामाइड जेल के प्रत्येक कुएं में 20 μL लोड करें, और जेल वैद्युतकणसंचलन चलाएं।
      नोट: जेल को कम वोल्टेज (120 वी) पर चलाएं जब तक कि डाई फ्रंट रिसॉल्विंग जेल तक न पहुंच जाए, और वोल्टेज को 170 वी तक बदल दें।
    41. एंटी-एचए, एंटी-हेलो, या हाउसकीपिंग प्रोटीन का पता लगाने वाले अन्य एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता करें (चित्रा 3)।
  3. विकल्प 3: ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण। आरएनए-सेक और क्यूआरटी-पीसीआर (चित्रा 4)।
    नोट: इस परख के लिए एक दूसरे के 15 मिनट के भीतर रखे गए भ्रूण का उपयोग करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। भ्रूण की उम्र का अंतर परख परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है।
    1. जेड-आरईएक्स के 2 घंटे बाद 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें।
    2. तेज बल (चरण 6.1.3) के साथ डिकोरियोनेशन करें।
    3. (वैकल्पिक) यदि विभिन्न खंडों का अलग-अलग विश्लेषण किया जाना है, तो बल के साथ विभाजन करें (उदाहरण के लिए, पूंछ से सिर को अलग करें)।
    4. यदि पूरे भ्रूण से आरएनए निकाल रहे हैं, तो तीन से पांच भ्रूण को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि सिर या पूंछ से आरएनए निकालते हैं, तो 10-12 विच्छेदित खंडों को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: तीन से पांच जैविक प्रतिकृति के साथ प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    5. ट्यूब में 1 एमएल टीआरआईज़ोल अभिकर्मक और ग्लास बीड्स जोड़ें।
      नोट: यह पाया गया कि आरएनए निष्कर्षण के लिए ग्लास मोती ज़िरकोनिया मोतियों से बेहतर काम करते हैं।
    6. मिश्रण को 30 सेकंड के लिए भंवर करें।
      नोट: यदि तुरंत अगले चरण के साथ आगे नहीं बढ़ रहा है, तो समाधान को 1-3 सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए निकालें।
    8. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा आरएनए गुणवत्ता और एकाग्रता का आकलन करें।
      नोट: अच्छी गुणवत्ता के आरएनए में2.0 के आसपास या उससे ऊपर का ए260/ए 280 अनुपात होना चाहिए।
    9. या तो अनुक्रमण के लिए आरएनए जमा करें, या प्रवर्धन-ग्रेड DNase I के साथ आरएनए के 1 μg का इलाज करें, और सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस और ऑलिगो-(डीटी) 20 का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्राइब करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस चरण का पालन करें।
    10. QRT-PCR निष्पादित करें और त्रिभुज विधि9 (चित्रा 4B-D) द्वारा डेटा का विश्लेषण करें।
  4. विकल्प 4: पीओआई अभिव्यक्ति और कोलोकलाइजेशन विश्लेषण। पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परख (चित्रा 5)।
    नोट: फॉर्मलाडेहाइड-निश्चित भ्रूण नाजुक हैं। जोरदार झटकों से बचें, और देखभाल के साथ संभालें।
    1. चरण 6.1.1-6.1.3 का पालन करके भ्रूण को डिकोरियोनेट करें।
    2. भ्रूण को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रत्येक ट्यूब में भ्रूण की एक समान संख्या होनी चाहिए, और 40 से अधिक भ्रूण नहीं होना चाहिए।
    3. भ्रूण ट्यूब के तल पर बसने के बाद, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और 1 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (पीएच 7.6) जोड़ें।
    4. चरण 6.4.3 को एक और बार दोहराएँ।
    5. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, पीबीएस (पीएच 7.6) में 4% फॉर्मलाडेहाइड के 1 एमएल जोड़ें, और ट्यूब को कोमल रॉकिंग के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: फॉर्मलाडेहाइड समाधान में नमूने 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    6. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, -20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल के 1 एमएल जोड़ें, और ट्यूब को कम से कम 18 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: नमूने 1 महीने या उससे अधिक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. सुपरनैटेंट को हटा दें, और पीडीटी बफर के 1 एमएल (0.3% वी / वी ट्राइटन एक्स -100, 0.1% वी / वी ट्वीन -20, और पीबीएस बफर में 1% वी / वी डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ] जोड़ें)।
    8. चरण 6.4.7 दोहराएं, और कोमल रॉकिंग के साथ 30 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    9. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, ब्लॉकिंग बफर के 1 एमएल (10% वी / वी हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 2% डब्ल्यू / वी बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन [बीएसए], और पीबीएस बफर में 0.1% वी / वी ट्वीन -20) जोड़ें, और ट्यूब को आरटी पर 1 घंटे के लिए कोमल रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट करें।
    10. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL जोड़ें (बफर को अवरुद्ध करने में पतला)।
    11. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 500 μL जोड़ें (बफर को अवरुद्ध करने में पतला), और ट्यूब को कोमल रॉकिंग के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि एक नए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, तो यह नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला किए बिना कुछ नमूने शामिल करने के लायक है। हालांकि, आदर्श रूप से, मोर्फोलिनो-वध या इंजीनियर जीन-नॉकआउट भ्रूण, या भ्रूण जिसमें लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति को उत्तेजित किया गया है, एंटीबॉडी को मान्य करने के लिए अधिक विश्वसनीय साधन हैं।
    12. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, पीडीटी बफर के 1 एमएल जोड़ें, और कोमल रॉकिंग के साथ 30 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    13. चरण 6.4.12 दोहराएँ।
    14. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, ब्लॉकिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें, और ट्यूब को आरटी पर 1 घंटे के लिए कोमल रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट करें।
      नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी पर संयुग्मित फ्लोरोफोरे के फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए, इस चरण के बाद नमूने को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    15. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL जोड़ें (बफर को अवरुद्ध करने में पतला)।
    16. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 500 μL जोड़ें (बफर को अवरुद्ध करने में पतला), और कोमल रॉकिंग के साथ 1.5 घंटे के लिए आरटी पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    17. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, पीडीटी बफर के 1 एमएल जोड़ें, और कोमल रॉकिंग के साथ 30 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    18. चरण 6.4.17 दोहराएँ।
    19. भ्रूण को 2% एगरोज प्लेट (पीबीएस, पीएच 7.6 के साथ बनाया गया) पर माउंट करें और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (उज्ज्वल क्षेत्र और संबंधित फ्लोरोसेंट चैनल) (चित्रा 5 ए, बी, डी, एफ) के साथ भ्रूण की छवि बनाएं।
      नोट: यदि लीका एम 165 एफसी फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो अच्छे रिज़ॉल्यूशन के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए 25x के आवर्धन का उपयोग करें।
    20. इमेजजे (एनआईएच) द्वारा फ्लोरोसेंट सिग्नल तीव्रता की मात्रा / विश्लेषण करें। रुचि के क्षेत्र में सिग्नल को निर्धारित करने के लिए इमेजजे में फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें।

Representative Results

मैक्रोफेज रिपोर्टर मछली, टीजी (लाइज़: टैगआरएफपी) और टीजी (एमपीईजी 1: ईजीएफपी) की लाइव इमेजिंग।मैक्रोफेज एपोप्टोसिस का प्रेरण कीप 1 एचएनईनाइलेशन के माध्यम से। (चित्र 2 भी देखें)। न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज स्तरों पर कीप 1 के इलेक्ट्रोफाइल लेबलिंग के प्रभाव का मूल्यांकन टीजी (lyz: TagRFP) या Tg (mpeg1: EGFP) से प्राप्त विषम ट्रांसजेनिक भ्रूण को एमआरएनए एन्कोडिंग हेलो-कीप 1 के साथ इंजेक्ट करके किया गया था, और फिर एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) के साथ इलाज किया गया था। चरण 6.1-डाउनस्ट्रीम परख के लिए प्रक्रियाओं के बाद विकल्प 1-एचएनई (एल्केनी) को मुक्त कर दिया गया था और कीप 1 को लेबल किया गया था। न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के स्तर का मूल्यांकन क्रमशः रिपोर्टर लाइनों, टीजी (lyz: TagRFP) और Tg (mpeg1: eGFP) की लाइव इमेजिंग द्वारा किया गया था। जेड-आरईएक्स उपचार के बाद दोनों सेल प्रकारों का स्तर 30% -40% कम हो गया, जिसमें एचएनई को कीप 1 तक पहुंचाया गया। इसके विपरीत, जेड-आरईएक्स तकनीकी नियंत्रण समूहों में न्यूट्रोफिल या मैक्रोफेज का कोई नुकसान नहीं देखा गया था [प्रकाश और एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी के बिना), अकेले प्रकाश, या अकेले एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) ) (चित्रा 1 डी और चित्रा 2 ए-डी)।

मैक्रोफेज एपोप्टोसिस के प्रेरण ने जेड-आरईएक्स के माध्यम से कीप 1 को सफल एचएनई वितरण का संकेत दिया। मार्ग विश्लेषण और एपोप्टोसिस तंत्र के लिए विवरण प्रकाशित किया गयाहै। एचएनई (एल्केनी) के ऑफ-टारगेट प्रभावों के लिए, कई नियंत्रणों का उपयोग किया गया था। (1) उसी प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत, हेलो-टीईवी-कीप 1 एमआरएनए के बजाय, भ्रूण को हेलो-पी 2 ए-कीप 1 एमआरएनए के साथ इंजेक्ट किया गया था। पी 2 ए लिंकर ने हेलो और कीप 1 प्रोटीन को स्वतंत्र रूप से व्यक्त करने की अनुमति दी। इस परिदृश्य में, हेलो से जारी एचएनई (एल्केनी) कीप 1 को लेबल नहीं कर सका, क्योंकि यह अब हेलो (चित्रा 1 डी) के समीपस्थ नहीं था; इसलिए, एपोप्टोसिस सिग्नलिंग मार्ग को ट्रिगर नहीं किया गया था। इस समूह में मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल के स्तर में कोई बदलाव नहीं देखा गया (चित्रा 2 ए, बी)। (2) वही प्रयोगात्मक स्थितियां एमआरएनए एन्कोडिंग हेलो-टीईवी-कीप 1 (सी 151 एस, सी 273 डब्ल्यू, सी 288 ई) का उपयोग करके की गई थीं, जो कीप 1 का एक उत्परिवर्ती है जो एचएनई (एल्केनी) (चित्रा 1 डी) का जवाब नहीं देता है। मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल के स्तर में कोई बदलाव नहीं देखा गया (चित्रा 2 जी, एच)।

बायोटिन एजाइड-क्लिक युग्मन और बायोटिन पुल-डाउन परख। लक्ष्य-लेबलिंग मूल्यांकन। ( चित्र 3 भी देखें)। लक्ष्य-लेबलिंग मूल्यांकन डब्ल्यूटी भ्रूण का उपयोग करके किया गया था, जिसे एमआरएनए एन्कोडिंग के साथ या तो हेलो-टीईवी-कीप 1-2एक्सएचए (हेलो-पीओआई फ्यूजन कंस्ट्रक्ट) या हेलो-2एक्सएचए-पी 2 ए-कीप 1-2एक्सएचए (पी 2 ए-स्प्लिट कंस्ट्रक्ट, जिसमें हेलो और कीप 1 जुड़े हुए नहीं हैं) के साथ इंजेक्ट किया गया था; चित्रा 1 डी)। लेबल किए गए कीप 1 प्रोटीन को केवल संलयन प्रोटीन व्यक्त करने वाले समूह में नीचे खींचा गया था और जेड-आरईएक्स (शीर्ष एंटी-एचए ब्लॉट में दूसरी लेन) के साथ इलाज किया गया था, लेकिन अन्य नियंत्रण समूहों में नहीं (कोई एमआरएनए इंजेक्शन नहीं, जेड-आरईएक्स के बिना संलयन निर्माण, या पी 2 ए-विभाजित निर्माण)। परिणामों से संकेत मिलता है कि एचएनई (एल्केनी) को सफलतापूर्वक कीप 1 में वितरित किया गया था, और संशोधित कीप 1 को बाद में क्लिक प्रतिक्रिया के माध्यम से बायोटिन के साथ संयुग्मित किया गया था, और बायोटिन-लेबल कीप 1 को स्ट्रेप्टाविडिन राल द्वारा नीचे खींच लिया गया था।

ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण। आरएनए-सेक और क्यूआरटी-पीसीआर। ( चित्र 4 भी देखें)। जेड-आरईएक्स उपचार के बाद ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन का मूल्यांकन आरएनए-सेक और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा किया गया था। आरएनए-सेक में, जेड-आरईएक्स के बाद कई प्रतिरक्षा-संबंधी जीन ों को डाउनरेगुलेट किया गया था। इसके विपरीत, जेड-आरईएक्स के बाद कई एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया (एआर) से संबंधित जीनों को विनियमित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप कीप 110 (चित्रा 4 ए) पर एचएनईनाइलेशन पर कीप 1-एनआरएफ 2-एआर मार्ग के प्रेरण के परिणामस्वरूप। QRT-PCR विश्लेषण में, तीन प्रतिरक्षा-संबंधी जीनों (lyz, mpeg1.1, और coro1a) का विश्लेषण करते समय समान परिणाम पाए गए (चित्रा 4B)। संबंधित जीनों के ऊपर और नीचे-विनियमन ने कीप 1 एचएनईनाइलेशन द्वारा मध्यस्थता वाले मार्गों के सफल प्रेरण को दिखाया।

होल-माउंट (सह-) इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग परख और कोलोकलाइजेशन विश्लेषण। (चित्र 5 भी देखें)। बहिर्जात हेलो-टीईवी-कीप 1-2एक्सएचए और हेलो-2एक्सएचए-पी2ए-कीप 1-2एक्सएचए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) स्टेनिंग (चित्रा 5 ए, बी) द्वारा किया गया था। पी 2 ए-स्प्लिट-कंस्ट्रक्ट में टीईवी-फ्यूजन-कंस्ट्रक्ट की तुलना में एचए टैग की संख्या दो गुना अधिक थी, जो पी 2 ए-स्प्लिट-कंस्ट्रक्ट-एमआरएनए-इंजेक्शन समूह में दूसरे की तुलना में दो गुना अधिक एंटी-एचए सिग्नल से मेल खाती है, यह दर्शाता है कि दोनों संरचनाओं का अभिव्यक्ति स्तर समान था (चित्रा 5 सी)। एंटी-हेलो (चित्रा 5 डी, ई) के साथ जांच करते समय हेलो-टीईवी-कीप 1 (डब्ल्यूटी) और हेलो-टीईवी-कीप 1 (सी 151 एस, सी 273 डब्ल्यू, सी 288 ई) के अभिव्यक्ति स्तर भी समान पाए गए। जेड-आरईएक्स-उपचारित टीजी (lyz: TagRFP) में न्यूट्रोफिल और सक्रिय कैसपेज़ 3 का सह-स्थानीयकरण एंटी-आरएफपी और एंटी-एक्टिव-कैसपेज़ 3 (चित्रा 5 एफ) के साथ सह-इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा देखा गया था। सक्रिय कैसपेज़ 3 एपोप्टोसिस घटनाओं का एक संकेतक है।

Figure 1
चित्र 1: Z-REX वर्कफ़्लो. (ए, बी) एक 1-4 सेल चरण जेब्राफिश भ्रूण को (मोर्फोलिनो और) एमआरएनए एन्कोडिंग हेलो-पीओआई (जैसे, हेलो-कीप 1) के साथ इंजेक्ट किया जाता है। इंजेक्शन भ्रूण को तब एक हेलोटैग लिगैंड और एक फोटोकेज्ड इलेक्ट्रोफाइल से बना एक जांच के साथ इलाज किया जाता है, जो बी में एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) जैसे एल्काइन कार्यात्मक समूह के साथ जुड़ा होता है। जांच की अतिरिक्त मात्रा को हटाने के बाद, भ्रूण को रुचि के इलेक्ट्रोफाइल को जारी करने के लिए प्रकाश के संपर्क में लाया जाता है [जैसे, एचएनई या इसके एनालॉग, एचएनई (एल्केनी)]। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण दिए गए / उपयोगकर्ता-परिभाषित समय बिंदु पर किया जाता है। (सी) एचटी-प्रीएलडीई जांच का डिजाइन और तंत्र, जो विभिन्न लिपिड-व्युत्पन्न इलेक्ट्रोफाइल (एलडीई) पर लागू होता है। (डी) जेड-आरईएक्स के लिए नकारात्मक/तकनीकी नियंत्रण समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जेड-आरईएक्स के अधीन ट्रांसजेनिक न्यूट्रोफिल / मैक्रोफेज रिपोर्टर मछली की लाइव इमेजिंग। जेड-आरईएक्स-मध्यस्थता कीप 1 एचएनईनाइलेशन न्यूट्रोफिल / मैक्रोफेज एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है। (ए) टीजी (lyz: TagRFP ) मछली की प्रतिनिधि छवियां या तो हेलो-टीईवी-कीप 1 (संलयन निर्माण) या हेलो-पी 2 ए-कीप 1 (विभाजित निर्माण) को व्यक्त करती हैं, और नकारात्मक नियंत्रण स्थितियों के अधीन होती हैं [कोई उपचार नहीं, अकेले प्रकाश, या एचटी-प्रीएचएनई (एल्केनी) अकेले या जेड-आरईएक्स]। भ्रूण की उम्र: 36 एचपीएफ। (बी) ए में न्यूट्रोफिल स्तरों की मात्रा। (सी) जेड-आरईएक्स उपचार के साथ या उसके बिना हेलो-टीईवी-कीप 1 को व्यक्त करने वाली टीजी (एमपीईजी 1: ईजीएफपी) मछली की प्रतिनिधि छवियां। भ्रूण की उम्र: 34 एचपीएफ। (डी) सी में मैक्रोफेज स्तरों की मात्रा। (E, F) जेड-आरईएक्स उपचार के बाद (ई) न्यूट्रोफिल और (एफ) मैक्रोफेज स्तरों का समय-पाठ्यक्रम माप। (छ) इसी प्रकार का प्रयोग ए में हेलो-टीईवी-कीप 1 (डब्ल्यूटी) या हेलो-टीईवी-कीप 1 (सी151एस, सी273डब्ल्यू, सी288ई) को व्यक्त करने वाली मछलियों में किया जाता है, एक उत्परिवर्ती जिसमें एचएनई-सेंसिंग क्षमता नहीं होती है। (एच) जी में न्यूट्रोफिल स्तरों की मात्रा। स्केल बार: 500 μm. सभी ग्राफ़ को औसत ± एसईएम के साथ प्रस्तुत किया गया है। पी मानों की गणना एक-तरफा एनोवा (नीले) और दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट (काले) के साथ की गई थी। इस आंकड़े को पोगानिक एट अल.7 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बायोटिन पुल-डाउन परख। हेलो-टीईवी-कीप 1-2एक्सएचए या हेलो-2एक्सएचए-पी2ए-कीप 1-2एक्सएचए को व्यक्त करने वाले डब्ल्यूटी भ्रूण का इलाज जेड-आरईएक्स या संबंधित नकारात्मक नियंत्रण स्थितियों (इस मामले में कोई जांच उपचार नहीं) के साथ किया गया था। फसल के बाद, बायोटिन पुल-डाउन परख से पहले भ्रूण को टीईवी प्रोटीज के साथ लाइसिस और इलाज किया गया था। परिणामों का विश्लेषण पश्चिमी सोख्ता द्वारा किया गया था। इस आंकड़े को हुआंग एट अल से संशोधित किया गया है। जेड-आरईएक्स: विशिष्ट प्रोटीन के लिए प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफाइल ्स को चरवाहा करना या तो ऊतक-विशेष रूप से या सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जाता है, और लार्वा मछली में परिणामी कार्यात्मक इलेक्ट्रोफाइल-प्रेरित रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड किया जाता है। इस आंकड़े को हुआंग एट अल से संशोधित किया गया है।11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण। (ए) जेड-आरईएक्स-उपचारित बनाम गैर-उपचारित भ्रूण के आरएनए-सेक परिणाम। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर-व्यक्त (एसडीई) जीन पर प्रकाश डाला गया है। प्रतिरक्षा से संबंधित एसडीई जीन लाल रंग के होते हैं। एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया (एआर) से संबंधित जीन हरे रंग के होते हैं। अन्य एसडीई जीन नीले रंग के होते हैं। सभी पी मानों की गणना कफडिफ के साथ की गई थी। (B-D) ए से तीन प्रतिरक्षा-संबंधी एसडीई जीन: (बी) लाइज़, (सी) एमपीईजी 1.1, और (डी) कोरो 1 ए को क्यूआरटी-पीसीआर के साथ आगे विश्लेषण किया गया था, और केवल जेड-आरईएक्स-उपचारित भ्रूण ने इन प्रतिलिपियों के दमन को दिखाया। सभी ग्राफ़ को औसत ± एसईएम के साथ प्रस्तुत किया गया है। पी मानों की गणना एक-तरफ़ा एनोवा (नीला) और दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट (काले) के साथ की गई थी। इस आंकड़े को पोगानिक एट अल.7 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग परख। (ए, बी) भ्रूण की प्रतिनिधि छवियां जो (ए) हेलो-टीईवी-कीप 1-2एक्सएचए या (बी) हेलो-2एक्सएचए-पी 2 ए-कीप 1-2एक्सएचए इम्यूनोस्टेन्ड एंटी-एचए के साथ और द्वितीयक एंटीबॉडी एलेक्साफ्लुर 568 के साथ संयुग्मित हैं। एमआरएनए-इंजेक्शन वाली मछली की तुलना उम्र से मेल खाने वाली गैर-इंजेक्शन वाली मछली से की गई थी। (सी) (ए, बी) में एंटी-एचए सिग्नल का परिमाणीकरण। (डी) हेलो-टीईवी-कीप 1 (डब्ल्यूटी) या हेलो-टीईवी-कीप 1 (सी 151 एस, सी 273 डब्ल्यू, सी 288 ई) को व्यक्त करने वाले भ्रूण ों की प्रतिनिधि छवियां एंटी-हेलो के साथ इम्यूनोस्टेन्ड और एलेक्साफ्लुर 647 के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी हैं। एमआरएनए-इंजेक्शन वाली मछली की तुलना उम्र से मेल खाने वाली गैर-इंजेक्शन वाली मछली से की गई थी। (ई) डी में एंटी-हेलो सिग्नल का परिमाणीकरण। पी मानों की गणना दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट के साथ की गई थी। (च) जेड-आरईएक्स के अधीन टीजी (लाइज़: टैगआरएफपी) भ्रूण एंटी-आरएफपी और एंटी-एक्टिव कैसपेज़ 3, और संबंधित फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सह-इम्यूनोस्टेन्ड थे। सफेद बॉक्स आवर्धित क्षेत्र को चिह्नित करता है। सफेद तीर न्यूट्रोफिल और सक्रिय कैसपेस 3 के सह-स्थानीयकरण का संकेत देते हैं। स्केल बार: 500 μm. सभी रेखांकन माध्य ± एसईएम के साथ प्रस्तुत किए गए हैं। इस आंकड़े को पोगानिक एट अल.7 से संशोधित किया गया है। और हुआंग एट अल।11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए गए बफर की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित जेड-आरईएक्स जीवित मछली में इलेक्ट्रोफाइल-लक्ष्य जोड़ी जांच और सिग्नलिंग मार्ग डीकन्वोल्यूशन के लिए एक मजबूत रणनीति प्रदर्शित करता है। निकटता-निर्देशित वितरण इलेक्ट्रोफिलिक यौगिक उपचार की खुराक और स्थानिक नियंत्रण को सक्षम बनाता है। पारंपरिक बोलस खुराक विधियों के विपरीत, जिसमें तैनात इलेक्ट्रोफाइल की सुपरफिजियोलॉजिकल सांद्रता अक्सर ऑफ-टारगेट मुद्दों को जन्म देती है, सिस्टम में जारी इलेक्ट्रोफाइल की अपेक्षाकृत मामूली मात्रा जेड-आरईएक्स को काफी हद तक गैर-आक्रामक बनाती है। हमने जेब्राफिश भ्रूण में 0.1-6 μM Ht-PreHNE (एल्केनी) का उपयोग किया है, और परिणामों से पता चला है कि उपचार भ्रूणके विकास के लिए हानिकारक नहीं है।

जेड-आरईएक्स प्रक्रिया आम तौर पर टी-आरईएक्स की तुलना में लंबी होती है, जो सुसंस्कृत कोशिकाओं में इलेक्ट्रोफाइल-सेंसिंग प्रोटीन की स्क्रीनिंग / अध्ययन करने के लिए एक तकनीक है। मान लीजिए कि प्रयोग का उद्देश्य इलेक्ट्रोफाइल-लक्ष्य इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करना है; हम पहले सुसंस्कृत कोशिकाओं में टी-आरईएक्स द्वारा व्यापक स्क्रीनिंग करने और विवो सत्यापन और फेनोटाइपिक / मार्ग विश्लेषण के लिए जेड-आरईएक्स का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। सेल कल्चर की तुलना में, जेड-आरईएक्स प्रदर्शन के लिए आवश्यकताएं टी-आरईएक्स द्वारा आवश्यक जैव रासायनिक प्रयोगात्मक कौशल के अलावा बुनियादी मछली पालन तकनीक हैं। जेड-आरईएक्स (मछली पार करने से प्रकाश-इंड्यूसेबल इलेक्ट्रोफाइल डिलीवरी तक) के लिए एक विशिष्ट समय सीमा 2-3 दिन है, जो संक्रमित जीवित कोशिकाओं पर टी-आरईएक्स प्रयोग के लिए सामान्य समय से 1 दिन से अधिक नहीं है। फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए लाइव इमेजिंग प्रकाश रोशनी के 2-10 घंटे बाद किया जा सकता है; पुल-डाउन परख के लिए बायोटिन-एज़ाइड के साथ क्लिक युग्मन में 3 दिन लगते हैं; ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की जांच के लिए क्यूआरटी-पीसीआर में 3 दिन लगते हैं; यदि धुंधला होने में 5 दिन लगते हैं। ये चरण मोटे तौर पर उनके सेल संस्कृति समकक्षों के समान हैं, हालांकि डेटा की व्याख्या के लिए मछली शरीर विज्ञान और रिपोर्टर उपभेदों की समझ की आवश्यकता होती है।

एक एकाधिक परिवर्तनीय प्रक्रिया12 के रूप में, परिणामों में अनिश्चितताओं को बाहर करने के लिए जेड-आरईएक्स के लिए कई नियंत्रण समूह आवश्यक हैं (चित्रा 1 डी)। सामान्य नियंत्रण समूह हैं: (1) डीएमएसओ / वाहन उपचार केवल; (2) जांच उपचार, लेकिन प्रकाश रोशनी के बिना; (3) हल्की रोशनी, लेकिन जांच उपचार के बिना; (4) पी 2 ए-स्प्लिट निर्माण, जिसमें हेलो और पीओआई को अलग-अलग व्यक्त किया जाता है, इसलिए निकटता वितरण को हटा दिया जाता है; और (5) हाइपोमॉर्फिक उत्परिवर्ती, जिनके इलेक्ट्रोफाइल-सेंसिंग अवशेष (ओं) उत्परिवर्तित हैं, जैसे कि एकेटी 3 (सी 11 9 एस) 6 और कीप 1 (सी 151 एस, सी 273 डब्ल्यू, सी 288 ई) 5, जिसका उपयोग हमने पिछले अध्ययनों में किया है।

यदि डाउनस्ट्रीम परख में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण शामिल है, तो फसल से पहले डेयोल्किंग किया जाना चाहिए। जर्दी प्रोटीन लाइसेट-एकाग्रता आकलन की निष्ठा को कम करते हैं और गैर-विशेष रूप से एंटीबॉडी से बंध सकते हैं। लाइव फिश इमेजिंग या होल-माउंट आईएफ धुंधला करते समय, हमने जर्दी थैली में गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेतों को भी देखा है, जो संभवतः जर्दी थैली में ऑटोफ्लोरोसेंट प्रोटीन, या एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन के परिणामस्वरूप होता है। यदि ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल सिग्नल के साथ हस्तक्षेप करता है, तो हम जर्दी थैली को परिमाणीकरण से बाहर करने या विभिन्न क्षेत्रों को अलग-अलग मात्रा निर्धारित करने का सुझाव देते हैं। लाइव मछली इमेजिंग और पूरे-माउंट आईएफ धुंधला परख के लिए डिकोरिनेशन आवश्यक है। कोरियन इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है, और बाद में परिमाणीकरण / सेल गिनती के साथ। हालांकि, डिकोरिनेशन केवल 1 डीपीएफ से पुराने भ्रूण पर लागू होता है; ब्लास्टुलेशन/गैस्ट्रुलेशन/सेगमेंटेशन चरणों में छोटे भ्रूण इतने नाजुक होते हैं कि उन्हें डिकोरियोनेटेड नहीं किया जा सकता है।

यहां वर्णित जेड-आरईएक्स प्रोटोकॉल एमआरएनए-संचालित अस्थानिक पीओआई अभिव्यक्ति पर आधारित है। ट्रांसजेनिक मछली लाइनों का उपयोग / उत्पन्न करने की तुलना में प्रक्रिया तेज है। एमआरएनए-संचालित अभिव्यक्ति सर्वव्यापी और क्षणिक है, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एमआरएनए के लिए कम से कम 2 दिनों तक रहती है। हालांकि, अभिव्यक्ति की अवधि अन्य मामलों में भिन्न होने की संभावना है। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण एक विशिष्ट इलेक्ट्रोफाइल-लेबलिंग घटना के प्रभावों में एक तेज, और अधिक वैश्विक जांच खिड़की प्रदान करता है, जो कई उच्च-थ्रूपुट / उच्च-सामग्री परख के साथ संगत है। विशिष्ट ऊतकों में स्थिर हेलो-पीओआई अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक लाइनें भी जेड-आरईएक्स11 के साथ संगत हैं। ऐसी लाइनों का सबसे अच्छा उपयोग तब किया जाता है जब एक अधिक सटीक प्रश्न पूछे जाने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, जब किसी विशिष्ट अंग में फेनोटाइप की भविष्यवाणी सेल-कल्चर डेटा से की जाती है, या जब एमआरएनए-इंजेक्शन प्रयोगों से स्क्रीनिंग भविष्यवाणी करती है कि एक विशिष्ट अंग इलेक्ट्रोफाइल-लेबलिंग घटना के प्रति संवेदनशील है। जेड-आरईएक्स के माध्यम से एक हृदय-विशिष्ट एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया प्रेरण हमारे पिछले प्रकाशन11 में टीजी (जीएसटीपी 1: जीएफपी; डीएसरेड-पी 2 ए-माइल 7: हेलो-टीईवी-कीप 1) मछली का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। 2 डीपीएफ से अधिक पुरानी ट्रांसजेनिक मछली पर जेड-आरईएक्स करना भी संभव हो सकता है।

Disclosures

आइसोफॉर्म-विशिष्ट छोटे-अणु काइनेज इनहिबिटर, जिनकी खोज आरईएक्स प्रौद्योगिकियों द्वारा सक्षम की गई थी, पेटेंट आवेदन के लिए दायर की गई है।

Acknowledgments

फंडिंग: नोवार्टिस फ्रीनोवेशन, एनसीसीआर और ईपीएफएल।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
1.5-mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C-S
10-cm Petri dishes Celltreat 229692
2-mL microcentrifuge tube Axygen MCT-200-C-S
30% Acrylamide and bis-acrylamide solution BioRad 1610154
6-well plate Celltreat 229506
Acetone Fisher A/0600/15
Agarose GoldBio A201-100
All Blue Prestained Protein Standards BioRad 1610373
Ammonium persulfate Sigma A3678
Biotin-dPEG11-azide Quanta Biodesign 102856-142
Bradford Dye BioRad 5000205
BSA Fisher BP1600-100
Capillary tubes VWR HARV30-00200
Chloroform Supelco, Inc 1.02445.1000
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cu(TBTA) Lumiprobe 21050
CuSO4 Sigma 209198
DMSO Fisher D128-500
Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647 Abcam ab150107 1:800 (IF)
Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647 Abcam ab150075 1:1000 (IF)
Donkey anti-rat-AlexaFluor 568 Abcam ab175475 1:1000 (IF)
ECL substrate Thermo Fisher Scientific 32106
ECL-Plus substrate Thermo Fisher Scientific 32132
End-to-end rotator FinePCR Rotator AG
Ethanol Fisher E/0650DF/15
Ethidium bromide Sigma E1510
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Fluorescence stereomicroscope Leica M165 FC
Forceps (blunt) self made self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)
Forceps (sharp) Fine Science Tools Dumont #5, 11252-40
Gel loading tip Fisher 02-707-181
Gel/blot imager Vilber Fusion FX imager
Glass beads Sigma 45-G1145
Glass stage micrometer Meiji Techno. MA285
Heat inactivated FBS Sigma F2442
Heated ultrasonic bath VWR 89375-470
HEPES Fisher BP310-1
High capacity streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20359
Ht-PreHNE alkyne probe self-made - Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos) Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer
Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos) Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS
Injection plate Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer
LDS Apollo APOBI3331
Methanol VWR 20864.32
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1
Microloader tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Narishige MN-153
Microscope for micro-injection Olympus SZ61
Microscope light source Olympus  KL 1600 LED
Mineral oil Sigma M3516
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
Mouse anti- β-actin-HRP Sigma A3854 1:20000 (WB)
Mouse anti-HaloTag Promega G921A 1:500 (IF)
Multi-mode reader BioTek Instruments Cytation 5
Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus Biorad Mini-Sub Cell GT Systems
Oligo(dT)20 Integrated DNA Technologies customized: (dT)20
Orange G Sigma O3756
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBS Gibco 14190144
pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA  self-cloned - Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL
pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA self-cloned - Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL
Pneumatic PicoPump WPI SYS-PV820
Protein electrophoresis equipment and supplies Biorad Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis
Rabbit anti-active Caspase-3 BD Pharmingen  559565 1:800 (IF)
Rat anti-HA-HRP Sigma H3663 1:500 (IF and WB)
Rat anti-RFP ChromoTek 5F8 1:800 (IF)
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R
RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
RnaseZap RNA decontamination solution ThermoFisher Scientific AM9780
Rocking Shaker DLAB SK-R1807-S
SDS Teknova S9974
SuperScript III reverse transcriptase ThermoFisher Scientific 18080085
t-Butanol Sigma 471712
TCEP-HCl Gold Biotechnology TCEP1
TeV protease (S219V) self-made - Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Tg(lyz:TagRFP) Zebrafish International Resource Center (ZIRC) uwm11Tg (ZFIN) -
Tg(mpeg1:eGFP) Zebrafish International Resource Center (ZIRC) gl22Tg (ZFIN) -
Thermal cycler Analytik Jana 846-x-070-280
TMEDA Sigma T7024
Transfer pipets Fisher 13-711-9D
Tris Apollo APOBI2888
Triton X-100 Fisher BP151-100
TRIzol reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) Sigma T9003
Tween 20 Fisher BP337-500
UV lamp with 365-nm light Spectroline ENF 240C
UV meter  Spectroline XS-365
Vortexer Scientific Industries, Inc. Vortex-Genie 2
Western Blotting Transfer equipment and supplies Biorad Mini Trans-Blot or Criterion Blotter 
Zebrafish husbandry and breeding equipment in house
Zirconia beads BioSpec 11079107zx

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References

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जीव विज्ञान अंक 196
लार्वा ज़ेबराफ़िश में ऑन-टारगेट सिग्नलिंग प्रतिक्रियाओं की निगरानी - जेड-आरईएक्स अनमास्क इलेक्ट्रोफिलिक ड्रग्स और मेटाबोलाइट्स के सटीक तंत्र
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Huang, K. T., Ly, P., Poganik, J.… More

Huang, K. T., Ly, P., Poganik, J. R., Parvez, S., Long, M. J. C., Aye, Y. Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites. J. Vis. Exp. (196), e64846, doi:10.3791/64846 (2023).

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