Summary
Zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) is een op chemische biologie gebaseerde methode voor het onderzoek van reactieve signalering van kleine moleculen. Deze techniek kan worden toegepast op levende vissen van verschillende ontwikkelingsstadia. Hier koppelen we standaardtests in zebravissen aan Z-REX voor signaalrouteanalyse.
Abstract
Reactieve metabolieten en gerelateerde elektrofiele geneesmiddelen behoren tot de meest uitdagende kleine moleculen om te bestuderen. Conventionele benaderingen om het werkingsmechanisme (MOA) van dergelijke moleculen te deconstrueren, maken gebruik van bulkbehandeling van experimentele exemplaren met een overmaat van een specifieke reactieve soort. In deze benadering maakt de hoge reactiviteit van elektrofielen niet-discriminerende etikettering van het proteoom op een tijd- en contextafhankelijke manier; Redoxgevoelige eiwitten en processen kunnen ook indirect en vaak onomkeerbaar worden beïnvloed. Tegen een dergelijke achtergrond van talloze potentiële doelwitten en indirecte secundaire effecten blijft het koppelen van fenotype aan specifieke doelbetrokkenheid een complexe taak. Zebravissen gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) - een on-demand reactief-elektrofiel toedieningsplatform aangepast voor gebruik in larvale zebravissen - is ontworpen om elektrofielen af te leveren aan een specifiek eiwit van belang (POI) in anders onverstoorbare levende visembryo's. Belangrijke kenmerken van deze techniek zijn een laag niveau van invasiviteit, samen met doserings-, chemotype- en spatiotemporeel gecontroleerde precisie-elektrofiele toediening. Dus, in combinatie met een unieke reeks controles, omzeilt deze techniek off-target effecten en systemische toxiciteit, anders waargenomen na ongecontroleerde bulkblootstelling van dieren aan reactieve elektrofielen en pleiotrope elektrofiele geneesmiddelen. Door gebruik te maken van Z-REX kunnen onderzoekers een voet aan de grond krijgen in het begrijpen van hoe individuele stressreacties en signaleringsoutputs worden veranderd als gevolg van specifieke reactieve ligandbetrokkenheid met een specifieke POI, onder bijna fysiologische omstandigheden bij intacte levende dieren.
Introduction
Een groot aantal cellulaire signaleringsgebeurtenissen omvat reacties tussen kleine reactieve moleculen (endogeen geproduceerd in de cel of xenobiotica / xenometabolieten, zoals geneesmiddelen) en hun eiwitdoelwit. In veel gevallen kan een substoichiometrisch niveau van dergelijke covalente bindingsgebeurtenissen cellulaire reacties veroorzaken, wat leidt tot veranderingen in bijvoorbeeld ontwikkeling, metabolisme, apoptose en / of immuunrespons1. Het deconstrueren van het werkingsmechanisme (MOA) door specifieke bindingsgebeurtenissen te koppelen aan hun fenotypische gevolgen is echter een uitdaging gebleken. Traditionele bolusdoseringsmethoden waarbij hoge concentraties van de reactieve soorten worden geïntroduceerd, resulteren vaak in een veelheid aan eiwitten die worden gewijzigd, evenals overmatige toxiciteit voor het modelorganisme2. Dergelijke omstandigheden zijn verre van ideaal. Er werd een methode ontwikkeld om deze problemen in celcultuur op te lossen met behulp van precisie gelokaliseerde elektrofiele toediening in een native cellulaire context, genaamd T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. In de tussenliggende jaren is de focus verlegd naar experimenten in hele organismen, die de mogelijkheid bieden om eiwitten in specifieke cellulaire contexten in niet-getransformeerde cellen te bestuderen. Daarom hebben we de techniek uitgebreid om compatibel te zijn met verschillende modellen, waaronder Danio rerio embryomodellen. Hierin presenteren we Z-REX (zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten) (figuur 1).
Om Z-REX te begrijpen, presenteert dit artikel eerst REX-technologieën en hun onderliggende concepten. In de kern modelleren deze technieken endogene fysiologische reactieve elektrofiele soorten (RES) signalering door na te bootsen hoe natuurlijke elektrofielen lokaal in vivo worden geproduceerd met spatiotemporale precisie. Het eiwit van belang (POI) wordt uitgedrukt als een fusieconstruct tot Halo; de laatste verankert de weefseldoorlatende en inerte sonde met de gefotografeerde RES in een 1:1 stoichiometrie. Een van die endogene RES is 4-hydroxynonenal (HNE hierna), die is gefotografeerd in de sonde Ht-PreHNE. In veel gevallen gebruiken we een alkyne-gefunctionaliseerde versie van HNE [d.w.z. HNE (alkyne)], die in wezen identieke biologische eigenschappen heeft als HNE, maar kan worden gelabeld door klikchemie. De sonde, die ook is gefunctionaliseerd met een chlooralkaan voor reactiviteit met Halo, wordt aangeduid als Ht-PreHNE (alkyn). Het complex van de Halo-POI-fusie en de aldus gevormde sonde maakt proximale afgifte van RES aan de gesmolten POI mogelijk bij bestraling met UV-licht. Als de POI snel reageert met het vrijgekomen RES, stelt de resulterende covalente labeling van de POI met RES ons in staat om kinetisch bevoorrechte cysteïnes te identificeren.
Z-REX neemt de bovengenoemde voordelen van REX-technologieën en past ze breed toe om specifieke signaalroutes in levende vissen te bestuderen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zebravissen (D. rerio), omdat het genetisch traceerbare gewervelde organismen zijn die transparant zijn tijdens de ontwikkeling, en dus ideaal voor optochemische / genetische technieken zoals REX-technologieën. Niettemin zal een soortgelijke strategie waarschijnlijk ook goed werken bij andere genetisch verhandelbare vissoorten, aangezien de brede toepasbaarheid van de methode te wijten is aan het pseudo-intramoleculaire mechanisme van lipide-afgeleide elektrofiele (LDE) levering. De procedure is inderdaad zeer biocompatibel, omdat vissen gedurende ten minste 48 uur kunnen worden behandeld met de Z-REX-gefotografeerde elektrofiel [bijv. Ht-PreHNE (alkyne)] zonder merkbare gevolgen voor de ontwikkeling. Een soortgelijk protocol functioneert in C. elegans 4,5.
Het protocol beschrijft eerst het gebruik van mRNA-injectie om een voorbijgaande expressie van een niet-inheemse Halo-POI-fusieconstruct te produceren in embryonale zebravismodellen, 1-1,5 dagen na de bevruchting (dpf). Dit resulteert in de expressie van het ectopische eiwit in de meerderheid van de cellen in de vis (hierna 'alomtegenwoordig' genoemd), in plaats van in specifieke weefsels of locaties; uit de gegevens blijkt echter dat in bepaalde gevallen celspecifieke effecten kunnen worden waargenomen. Na injectie worden de embryo's geïncubeerd met een lage concentratie [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alkyne)] van de sonde gedurende maximaal 30,5 uur na de bevruchting (hpf). Vervolgens wordt op een door de gebruiker voorgeschreven tijdstip de levering van het RES aan de POI in vissen bereikt door fotouncaging gedurende 2-5 minuten. Na fotouncaging van de RES kan een verscheidenheid aan downstream fenotypische assays worden uitgevoerd gedurende de volgende 2-10 uur: 1) live beeldvorming van reporterlijnen (figuur 2A); 2) beoordeling van de doeletikettering door middel van western blot-analyse (figuur 3); 3) transcriptomische analyse (figuur 4); of 4) immunofluorescentie in de gehele montage (figuur 5).
Als voorbeeld van live imaging van reporterlijnen wordt Z-REX gedemonstreerd in combinatie met live imaging van vislijnen, Tg (lyz: TagRFP) en Tg (mpeg1: eGFP), om te meten hoe RES-modificatie van een specifieke elektrofiele sensor-POI (namelijk Keap1) respectievelijk neutrofielen- en macrofaagniveaus verlaagt, zonder waarneembare effecten op andere cellen in de vis. We hebben echter eerder aangetoond dat de POI-labeling en de daaruit voortvloeiende routesignalering van T-REX-studies kunnen worden gereproduceerd met Z-REX voor verschillende eiwitten: Akt3 6, Keap17 en Ube2v26. Over het algemeen kunnen wetenschappers met Z-REX de gevolgen bestuderen van covalente modificatie van POI's door RES in de context van verschillende complexe redoxroutes. Deze techniek is klaar om doelen en hun functionele residuen te lokaliseren voor covalent medicijnontwerp en nieuwe medicijnmechanismen in een meer contextueel relevant model voor het hele dier.
Protocol
Zebravishouderij- en behandelingsprocedures aan de Cornell University (Verenigde Staten) werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Zebravishouderij en behandelingsprocedures bij de zebraviseenheid van het Zwitserse Federale Instituut voor Technologie Lausanne (EPFL, Zwitserland) werden uitgevoerd volgens de Animal Welfare Act SR 455 en Animal Welfare Ordinance SR 455.1, met kantonnale veterinaire toestemming VD-H23.
OPMERKING: In dit protocol worden Tg( lyz:TagRFP ) en Tg(mpeg1:EGFP) vislijnen die Halo-TeV-Keap1 uitdrukken gebruikt om Z-REX te demonstreren. De methode kan worden uitgebreid naar andere interessante eiwitten, transgene reporter vislijnen en stroomafwaartse biologische assays. Zie aanvullende tabel 1 voor de buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Alle reagentia, instrumenten, apparatuur, antilichamen, plasmiden, zebravisstammen en apparatuur zijn opgenomen in de materiaaltabel.
1. mRNA-preparaat
- Bereid Halo-TeV-Keap1-2xHA en Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA voor met behulp van de mMessage mMachine SP6 in vitro transcriptiekit.
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant en voer 40 μL schaalreacties uit voor elk mRNA. Los de mRNA-pellet opnieuw op in 10 μL nucleasevrij water. - Beoordeel de mRNA-kwaliteit en meet de concentratie met behulp van microvolumespectrofotometer en agarosegel-elektroforese. Een mRNA van goede kwaliteit moet een A260/A280 verhouding hebben van rond of boven de 2,0.
- Verdun het mRNA tot 1-1,5 mg/ml met nucleasevrij water.
- Aliquot de mRNA-oplossing (1-2 μL per buis) en bewaar de aliquots bij -80 °C.
2. Productie van visembryo's
- Optie 1: Het produceren van wild-type (WT) visembryo's.
- Zet 10 viskruisende paren op in 10 afzonderlijke tanks, waarbij elke tank een scheidingswand bevat tussen de mannelijke en vrouwelijke oudervissen.
OPMERKING: Een totaal van 10 kruisende paren levert doorgaans een voldoende aantal embryo's op voor de assays. Het aantal kruisingsparen kan worden aangepast aan de ontwerp/behoefte van het experiment en de vruchtbaarheid van de oudervissen. - De volgende ochtend, na het instellen van de injector, verwijdert u de verdelers in vijf van de tanks. Wacht 30 minuten tot de vis paart.
- Verplaats de oudervis naar een andere tank, verzamel embryo's door het tankwater door een zeef te laten gaan en spoel de embryo's vervolgens uit de zeef in een petrischaal van 10 cm. Deze embryo's zullen worden gebruikt voor de eerste injectieronde.
OPMERKING: Als de eikwaliteit van een bepaalde batch slecht is (bijv. Eieren zijn ondoorzichtig als gevolg van aggregatie van eiwitten), voeg ze dan niet samen met de andere embryo's. - (Optioneel) Voer soortgelijke procedures uit zoals beschreven in stap 2.1.2-2.1.3 op de andere vijf tanks voor de volgende injectieronde.
OPMERKING: Het is het beste om slechts één injectieronde uit te voeren om het leeftijdsverschil tussen embryo's te minimaliseren. Als er echter meer embryo's nodig zijn dan in één partij kunnen worden geïnjecteerd, wordt het uitvoeren van twee injectierondes aanbevolen om ervoor te zorgen dat de embryo's tijdens de mRNA-injectie in een 1-4-celstadium blijven. Het aantal injectierondes kan worden aangepast aan de injectievaardigheid en het experimentontwerp van de operator. Er wordt echter voorgesteld om de hele procedure (van het verwijderen van de eerste verdeler tot de injectie van het laatste embryo) binnen 2 uur uit te voeren. Een groot leeftijdsverschil tussen embryo's kan de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimentresultaten aantasten.
- Zet 10 viskruisende paren op in 10 afzonderlijke tanks, waarbij elke tank een scheidingswand bevat tussen de mannelijke en vrouwelijke oudervissen.
- Optie 2: Het produceren van heterozygote transgene neutrofielen/macrofaag reporter visembryo's.
- Zet 10 viskruisingsparen op in 10 afzonderlijke tanks, waarbij elke tank wordt ingevoegd met een scheidingswand tussen mannelijke en vrouwelijke oudervissen: WT-vis versus Tg (lyz: TagRFP) of WT-vis versus Tg (mpeg1: eGFP).
OPMERKING: Vermijd in-kruisingen tussen heterozygote transgene vissen, die stroomafwaarts fluorescerende uitlezingen kunnen beïnvloeden, omdat homozygote reportervissen een hoger fluorescerend signaal vertonen in vergelijking met heterozygote vissen. Transgene reporterlijnen en WT-embryo's kunnen gemakkelijk worden onderscheiden bij beeldvorming. Het hebben van een mengsel van WT en heterozygote embryo's in dezelfde pool is geen probleem. lyz:TagRFP rapporteert neutrofielen en mpeg:eGFP rapporteert macrofagen. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere reporter vislijnen. - Volg de stappen 2.1.2-2.1.4.
- Zet 10 viskruisingsparen op in 10 afzonderlijke tanks, waarbij elke tank wordt ingevoegd met een scheidingswand tussen mannelijke en vrouwelijke oudervissen: WT-vis versus Tg (lyz: TagRFP) of WT-vis versus Tg (mpeg1: eGFP).
3. Micro-injector instellen
- Schakel de luchtbron in, stel de tegendruk in op 0,2-0,5 psi en stel de injectiedruk in op 25-30 psi. Het specifieke drukbereik dat wordt weergegeven, wordt meestal aanbevolen.
OPMERKING: Het is essentieel om een stabiele tegendruk te hebben om te voorkomen dat vismedia terugstromen in de naald. Bij het kalibreren van het injectievolume in stap 3.8 moet alleen de injectietijd worden gewijzigd. Verander de injectiedruk niet in de volgende stappen; Lage injectiedruk kan leiden tot injectiefalen als gevolg van oppervlakte- en interfaciale spanning, terwijl hoge injectiedruk embryo's kan beschadigen. - Reinig de apparatuur en het injectieplatform met de RNase-ontsmettingsoplossing.
OPMERKING: RNase, dat mRNA afbreekt, kan afkomstig zijn van de operator of de apparatuur. Het is noodzakelijk om de schoonmaak vóór het experiment uit te voeren en handschoenen te dragen. - (Optioneel) Als u mRNA en morfolino co-injecteert, mengt u de twee in een buis van 0,2 ml.
OPMERKING: Z-REX werkt goed met behulp van Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA-oplossing met een concentratie van 250-1500 ng / μL. Verschillende morfolino's zijn ook gebruikt in zebravissen en de optimale concentraties zijn gemeld7. Bij gebruik van een morfolino met een niet-gepubliceerde sequentie moet de operator eerst de toxiciteit en genafbraakefficiëntie van het morfolino beoordelen voordat het in Z-REX wordt gebruikt. - Breng 1-2 μL mRNA (en/of morfolino indien van toepassing7) over in een injectienaald met een pipetpunt van de microlader.
OPMERKING: Als u naalden bereidt met een Flaming/Brown micropipettrekker, is de opstelling als volgt. Warmte: 520 eenheden; trekkracht: 60 eenheden; snelheid: 70 eenheden; vertraging: 155 eenheden; druk: 550 eenheden; Oprit: 530 eenheden. - Installeer de naald op de microinjectiemanipulator.
OPMERKING: De tegendruk van de luchtbron moet de mRNA(/morpholino)-oplossing naar de naaldpunt duwen. - Gebruik een scherpe tang of een scheermesje om de naaldpunt te breken, waardoor een geschikte opening voor injectie ontstaat.
- Dompel de naaldpunt onder in minerale olie op een podiummicrometer.
- Breng twee of drie injectiepulsen aan om luchtbellen in de punt te verwijderen.
- Kalibreer de druppelgrootte tot 2 nL door de injectietijd te wijzigen.
OPMERKING: Dit kan het beste worden uitgevoerd door te injecteren in minerale olie (die de viscositeit van de dooierzak nabootst) die op een hemocytometer wordt gelegd. Gebruik met behulp van een microscoop de rasterlijnen van de hemocytometer om de grootte van de druppel die tijdens de injectie wordt gevormd te schatten en pas de injectietijd dienovereenkomstig aan. Hoewel fenolrode kleurstof soms wordt gebruikt, is de noodzaak ervan in de hier beschreven mRNA-injectieprocedure niet waargenomen.
4. Micro-injectie
- Vul een injectieplaat met vers 10% Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) medium en lijn de embryo's in de groeven van de plaat uit met een stompe tang.
OPMERKING: De injectieplaat wordt bereid met 2% agarose in 10% HBSS-medium; De groeven worden gevormd met behulp van een plastic mal. - Dompel de naaldpunt onder in 10% HBSS-medium in de injectieplaat.
- Breng twee of drie injectiepulsen aan om luchtbellen in de punt te verwijderen.
- Prik voor elke injectie in één beweging door het chorion en de dooierzak en breng een injectiepuls aan. Deze geïnjecteerde vloeistof kan direct na de injectie worden gezien als een kleine sferoïde in de dooierzak. Deze kleine sferoïde verdwijnt relatief snel. Herhaal deze stap voor andere embryo's, totdat een voldoende aantal geïnjecteerde embryo's is verkregen.
OPMERKING: De overlevingskans van embryo's (zowel geïnjecteerd als niet-geïnjecteerd) varieert meestal van 50% -90%. Streef ernaar om het dubbele aantal embryo's te injecteren dat nodig is voor elke controle/ experimentele groep. In de biotine pull-down assay zijn 100-140 levensvatbare embryo's nodig voor elke aandoening. In de qRT-PCR-test worden vijf levensvatbare embryo's aanbevolen voor elke aandoening. De steekproefgrootte voor beeldvorming van levende vissen en immunofluorescentiekleuringstest met hele montage is door de gebruiker gedefinieerd; Het hebben van ten minste 20 levensvatbare embryo's per aandoening wordt aanbevolen om een goede statistische kracht in de analyse op te leveren. - Spoel de geïnjecteerde embryo's uit tot een nieuwe petrischaal van 10 cm met verse 10% HBSS-media.
OPMERKING: De embryo's kunnen gemakkelijk uit de groeven worden gespoeld met behulp van een spuitfles. - Bundel de niet-geïnjecteerde embryo's in een andere plaat.
OPMERKING: De niet-geïnjecteerde embryo's kunnen dienen als kwaliteitscontroles voor de gezondheid van de vis, baseline eiwitexpressie, achtergrondfluorescentieniveaus, enz., Indien nodig. Als de injectieprocedure goed werkte en geïnjecteerd mRNA/morfolino niet dodelijk is voor de embryo's, moeten geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde embryo's een vergelijkbare levensvatbaarheid hebben.
5. Z-REX
- Verdeel de geïnjecteerde embryo's in schalen van 10 cm, volgens de opstelling van het experiment (d.w.z. aantallen controle- / experimentgroepen).
- Vervang in een donkere kamer met roodlichtverlichting de media door 30 ml 10% HBSS met of zonder 1 μM Ht-PreHNE (alkyn).
OPMERKING: Ht-PreHNE (alkyn) is een licht-labiele verbinding. Embryo's moeten in de volgende stappen in het donker worden gehouden. - Incubeer de embryo's bij 28,5 °C in het donker.
- Vervang bij 30,5 hpf in een donkere kamer de media door een verse 30 ml 10% HBSS.
OPMERKING: Verwijder bij het vervangen van het medium zoveel mogelijk van het oude medium. Dit is van cruciaal belang voor het verwijderen van de ongebonden/overtollige hoeveelheid Ht-PreHNE (alkyn) uit de embryo's. - Incubeer de embryo's bij 28,5 °C in het donker gedurende 30 minuten.
- Herhaal stap 5.4-5.5 nog twee keer.
- Zet de UV-lamp (365 nm, 3 mW/cm2) gedurende 5 minuten aan om de lamp voor te verwarmen.
OPMERKING: De voorverwarmingsstap van de lamp moet vóór stap 5.8 worden uitgevoerd. Het lampvermogen is lager/onstabiel in de eerste paar minuten nadat het is ingeschakeld. Het lampvermogen moet regelmatig worden gemeten door een UV-meter. - Bij 32 hpf stellen de embryo's bloot aan UV-licht.
- Optie 1: Voor stroomafwaartse uitlezingen, zoals beeldvorming van levende vissen, immunofluorescentiekleuring met hele montage, fluorescentieanalyse in de gel (klikkoppeling met Cy5-azide), RNA-seq of qRT-PCR, stelt u de embryo's gedurende 3 minuten bloot aan UV-licht, waarbij de platen om de 30 s worden gedraaid.
- Optie 2: Voor stroomafwaartse uitlezingen, zoals biotine pull-down assay, stelt u de embryo's maximaal 5 minuten (en minimaal 3 minuten) bloot aan UV-licht, draait u de platen om de 30 s en koelt u de platen gedurende 1 minuut op ijs.
OPMERKING: Als u verschillende sondes gebruikt, moet de belichtingstijd van het licht worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de t1/2 van de foto-uncaging voor een bepaalde gefotografeerde elektrofiele sonde en lichtbron die wordt ingezet. t1/2fotouncaging kan worden bepaald met behulp van bekende procedures8. Voor Ht-PreHNE (alkyne) is t 1/2 < 1 min3; De hierboven aangegeven tijd is dus voldoende.
6. Downstream-assays
- Optie 1: Fenotypische assay. Live beeldvorming van transgene neutrofielen/macrofaag reporter
vislijnen, Tg(lyz:TagRFP) en Tg(mpeg1:eGFP) (Figuur 2)- Verdoof de embryo's door incubatie bij 4 °C gedurende 10 min.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste 20 levensvatbare embryo's per aandoening te hebben. - Verwijder de onbevruchte/dode embryo's van de plaat.
OPMERKING: De onbevruchte/dode embryo's zijn troebel/niet-transparant en kunnen visueel worden geïdentificeerd. Als een hoog sterftecijfer wordt gezien, controleer dan de injectieprocedure of probeer de concentratie van mRNA of morfolino te verminderen. - Dechorioneer de embryo's met een scherpe tang. Houd het chorion vast met één paar tangen, zonder de larvale vis aan te raken, en gebruik het andere paar tangen om het chorion af te scheuren. Het embryo is fragiel. Raak het chorion alleen aan bij het uitvoeren van dechorionatie.
OPMERKING: Het is gebruikelijk, vooral bij beginners, om sommige embryo's te beschadigen tijdens dechorionatie. Zorg daarom altijd voor meer embryo's dan het minimaal benodigde embryo's. - Monteer de embryo's op een 2% agarose plaat (bereid met 10% HBSS medium) en beeld de embryo's af met een stereomicroscoop (helder veld en respectievelijke fluorescerende kanalen) (Figuur 2A, C, G).
OPMERKING: Na Z-REX [combinatie van Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA-injectie en Ht-PreHNE(alkyne)-behandeling] bleek de depletie van neutrofielen (lyz:TagRFP) het meest significant te zijn bij 36 hpf (4 h na Z-REX), terwijl de reductie van macrofagen (mpeg1:eGFP) het meest significant was bij 34 hpf (2 h na Z-REX) (figuur 2E,F). Andere tijdstippen kunnen worden gebruikt als verschillende reporterlijnen, mRNA / morpholino of sondes worden gebruikt. De belichtingstijd en/of -versterking moet worden geoptimaliseerd voor het visualiseren van afzonderlijke cellen of de gewenste specifieke (ultra)structuren. - Tel het neutrofielen/macrofaagnummer van elke vis door ImageJ (NIH) (Figuur 2B, D-F, H). Gebruik het gereedschap Selectie uit de vrije hand in ImageJ om de hele vis te omcirkelen en gebruik de optie Maxima zoeken om de fluorescerende cellen te tellen.
- Verdoof de embryo's door incubatie bij 4 °C gedurende 10 min.
- Optie 2: Beoordeling van doeletikettering. Biotine azide-klikkoppeling en biotine pull-down assay (Figuur 3)
- Verdoof de embryo's door incubatie bij 4 °C. Dit duurt meestal 10 min.
OPMERKING: Om voldoende vislysaat te verkrijgen, zijn 100-140 levensvatbare embryo's nodig voor elke aandoening. - Verwijder de onbevruchte/dode embryo's van de plaat.
- Voer dechorionatie en deyolking uit. Voer de twee manipulaties uit door het chorion vast te houden met een paar scherpe tangen, het andere paar tangen te gebruiken om de dooierzak te penetreren en vervolgens de dooierzak te scheiden terwijl het chorion wordt verwijderd om de dooiereiwitten naar buiten te laten komen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de dooiereiwitten in deze stap te verwijderen. De overvloedige dooiereiwitten in het monster interfereren met latere analyse. - Breng de ontdooierde embryo's over in een buis van 1,5 ml.
OPMERKING: Draai de plaat om de ontdooierde embryo's te centreren, wat het verzamelen vergemakkelijkt. Het lichtere chorionpuin verdwijnt tijdens dit proces. - Nadat de embryo's op de bodem van de buis zijn neergedaald, verwijdert u het supernatant en voegt u 1 ml gekoelde HEPES-gebufferde zoutoplossing (pH 7,6) toe.
- Herhaal stap 6.2.5 nog twee keer.
- (Optioneel) Als u niet van plan bent om onmiddellijk door te gaan met de volgende stap, verwijdert u de buffer, vriest u de monsters in vloeibare stikstof en bewaart u ze bij -80 °C.
OPMERKING: Ontdooierde viskorrels kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij -80 °C. Flash-ingevroren monsters kunnen tot 2 weken bij -80 °C worden bewaard. - Resuspendeer de viskorrels in lysisbuffer.
OPMERKING: Lysisbuffer (pH 7,6) bestaat uit 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,3 mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini EDTA-vrije proteaseremmers en 0,1 mg / ml trypsineremmer uit sojabonen. Eén embryo geeft ongeveer 2 μg lysaat. Gebruik 100 μL lysisbuffer voor elke 120 embryo's. Twee Roche cOmplete Mini EDTA-vrije proteaseremmers en trypsineremmers uit sojabonen moeten vlak voor gebruik aan de lysisbuffer worden toegevoegd. - Voeg 20% v/v zirkoniakralen toe aan de tube.
- Vortex gedurende 20 s, flash bevriezen in vloeibare stikstof en ontdooien in een waterbad van 37 °C.
- Herhaal stap 6.2.10 nog twee keer.
- Centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min.
- Breng het supernatant over in een nieuwe, voorgekoelde buis van 1,5 ml.
- Meet de eiwitconcentratie met bradford-assay.
- Verdun het lysaat tot 1 mg/ml.
- Breng voor elke aandoening 170 μg lysaat over in een buis van 2 ml.
- Meng het lysaat uit stap 6.2.16 met 0,2 mg/ml TeV-protease (S219V) en incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Voor niet-TeV protease-behandelde groepen, meng eenvoudig het lysaat met een gelijke voloume van lysisbuffer tot de TeV-proteaseoplossing die in andere groepen wordt gebruikt. - Bereid een 10x mastermix voor de biotine-azide klikreactie: 10% w/v SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM Cu(TBTA), 1 mM biotine-azide en 20 mM TCEP.
OPMERKING: Voeg TCEP toe aan de mix net voor stap 6.2.19. - Voeg 8,5 μL t-BuOH en 17 μL 10x klikreactiemastermix toe aan het (TeV-protease-verteerde) lysaat uit stap 6.2.17. Vortex, centrifugeer en incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende 15 minuten.
- Voeg nog eens 1 mM TCEP toe aan de oplossing en vervolgens vortex, centrifugeer en incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende nog eens 15 minuten. De incubatietijd voor stappen 6.2.19-6.2.20 is in totaal 30 minuten.
OPMERKING: Dit supplement van TCEP, een reducerend reagens voor het genereren van Cu(I), verbetert de klikreactie-efficiëntie. - Voeg 600 μL -20 °C ethanol toe aan elke buis, draai de oplossing en incubeer deze 's nachts bij -80 °C.
OPMERKING: De monsters kunnen gedurende 1 week bij -80 °C worden bewaard; Zo niet, ga dan onmiddellijk verder met de volgende stap. - Centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Een pellet moet zich vormen in de bodem van de buis na het centrifugeren, wat de gewenste fractie is. - Verwijder het supernatant, voeg 1 ml -20 °C ethanol, vortex toe en centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Herhaal stap 6.2.23.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml aceton -20 °C toe, vortex en centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant. Laat overtollige resterende aceton verdampen, maar niet volledig uitdrogen.
- Resuspendeer de pellet in 100 μL resuspensiebuffer (8% m/v lithiumdodecylsulfaat [LDS], 1 mM EDTA in 50 mM HEPES-zoutoplossing, pH 7,6), vortex gedurende 15 s en soniceer totdat de pellet is opgelost.
- Centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 2 ml en voeg 1,5 ml 50 ml HEPES-zoutoplossing toe, pH 7,6.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van LDS in deze stap is 0,5%. Hogere LDS-concentraties kunnen de pull-down-efficiëntie ondermijnen. Dus, hoewel het verhogen van de LDS-concentratie kan helpen bij het verminderen van niet-specifieke binding, kan het ook de efficiëntie van de pulldown verminderen. Daarom wordt aanbevolen om de LDS-concentratie bij deze stap niet te wijzigen. - Verzamel het "input"-monster (figuur 3): breng 30 μL 1 mg/ml lysaat over in een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 10 μl 4x Laemmli-monsterbuffer toe met 6% β-Mercaptoethanol (BME). Bevries de oplossing in en bewaar deze bij -80 °C.
- Breng 100 μL bedvolume streptavidin hars met hoge capaciteit over in een nieuwe buis van 2 ml. Voeg 1 ml 0,5% LDS toe in 50 mM HEPES-zoutoplossing (pH 7,6), centrifugeer bij 1.500 x g bij RT gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal de was met nog eens 1 ml 0,5% LDS in 50 mM HEPES zoutoplossing (pH 7,6).
- Breng de oplossing van stap 6.2.29 over in de buis met voorgewassen streptavidinehars met hoge capaciteit uit stap 6.2.31 en incubeer de oplossing gedurende 4-6 uur op een end-over-end mixer bij RT.
- Centrifugeer het mengsel bij 1.500 x g bij RT gedurende 2 minuten, neem 30 μL van het supernatant en meng het met 10 μL 4x Laemmli monsterbuffer met 6% BME voor het "doorstroom" monster. Verwijder vervolgens het resterende supernatant.
OPMERKING: "Flowthrough" -monsters kunnen worden geanalyseerd door western blotting om de streptavidin pull-down efficiëntie te controleren. Het is essentieel om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen om de ongebonden eiwitten weg te spoelen. Verwijder eerst het grootste deel van het supernatant met een P-1000-pipet en verwijder vervolgens het resterende supernatant met een P-20-pipet met een gel-laadpunt. - Voeg 1 ml 0,5% LDS in 50 mM HEPES-zoutoplossing (pH 7,6) toe aan de hars en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij RT met end-over-end rotatie.
- Centrifugeer het mengsel op 1.500 x g bij RT gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant.
OPMERKING: Meestal is 0,5% LDS voldoende voor het verwijderen van de meeste niet-specifieke bindende eiwitten. Als in de latere analyse nog niet-specifieke bindingssignalen worden gezien, kan de LDS-concentratie in de wasbuffer worden verhoogd. - Herhaal stap 6.2.34-6.2.35 nog twee keer.
- Voeg 40 μL 2x Laemmli monsterbuffer met 6% BME toe aan de hars.
- Elueer de gebonden eiwitten door het mengsel gedurende 5 minuten bij 98 °C te incuberen.
- Centrifugeer het mengsel op 21.000 x g bij RT gedurende 5 minuten en breng het supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Dit is het "elute" monster.
OPMERKING: Het direct laden van een oplossing met hars uit stap 6.2.38 in de gel kan de SDS-PAGE-analyse beïnvloeden. - Laad 20 μL in elke put van 10-baans 10% polyacrylamidegel en voer gelelektroforese uit.
OPMERKING: Laat de gel op een lagere spanning (120 V) lopen totdat het kleurstoffront de oplossende gel bereikt en verander de spanning in 170 V. Stop het programma nadat het kleurstoffront eruit komt. - Voer western blotting uit met anti-HA, anti-Halo of andere antilichamen die huishoudeiwitten detecteren (figuur 3).
- Verdoof de embryo's door incubatie bij 4 °C. Dit duurt meestal 10 min.
- Optie 3: Transcriptomische analyse. RNA-seq en qRT-PCR (figuur 4)
OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om embryo's te gebruiken die binnen 15 minuten van elkaar zijn gelegd voor deze test. Het leeftijdsverschil van de embryo's heeft een aanzienlijke invloed op de testresultaten.- Verdoof de embryo's door ze te incuberen bij 4 °C gedurende 10 min, 2 uur na Z-REX.
- Voer dechorionatie uit met een scherpe tang (stap 6.1.3).
- (Optioneel) Voer segmentatie uit met een tang (bijvoorbeeld de kop van de staart scheiden) als verschillende segmenten afzonderlijk moeten worden geanalyseerd.
- Als u RNA uit een heel embryo haalt, breng dan drie tot vijf embryo's over in een buis van 1,5 ml. Als u RNA uit de kop of staart haalt, breng dan 10-12 ontlede segmenten over in een buis van 1,5 ml.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het experiment uit te voeren met drie tot vijf biologische replicaties. - Voeg 1 ml TRIzol-reagens en glasparels toe aan de buis.
OPMERKING: Het bleek dat glaskralen beter werken dan zirkonia-kralen voor RNA-extractie. - Vortex het mengsel gedurende 30 s.
OPMERKING: Als u niet onmiddellijk doorgaat met de volgende stap, kan de oplossing gedurende 1-3 weken bij -80 °C worden bewaard. - Extraheer het RNA volgens de instructies van de fabrikant.
- Beoordeel de RNA-kwaliteit en -concentratie door microvolumespectrofotometer en agarosegel-elektroforese.
OPMERKING: RNA van goede kwaliteit moet een A260/A 280-verhouding hebben van ongeveer of boven 2,0. - Dien het RNA in voor sequencing, of behandel 1 μg RNA met DNase I van amplificatiekwaliteit en reverse transcribeer met behulp van superscript III reverse transcriptase en oligo-(dT)20. Voer deze stap uit volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer qRT-PCR uit en analyseer de gegevens volgens de ΔΔCT-methode9 (figuur 4B-D).
- Optie 4: POI-expressie en colokalisatieanalyse. Immunofluorescentiekleuringstest met gehele montage (figuur 5)
OPMERKING: Formaldehyde-gefixeerde embryo's zijn kwetsbaar. Vermijd krachtig schudden en ga voorzichtig om.- Dechorioneer de embryo's door de stappen 6.1.1-6.1.3 te volgen.
- Breng de embryo's over in een buis van 1,5 ml.
OPMERKING: Elke buis moet een gelijk aantal embryo's hebben en niet meer dan 40 embryo's. - Nadat de embryo's zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, verwijdert u het supernatant en voegt u 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,6) toe.
- Herhaal stap 6.4.3 nog een keer.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml 4% formaldehyde toe in PBS (pH 7,6) en incubeer de buis bij 4 °C gedurende een nacht met zacht schommelen.
OPMERKING: De monsters in formaldehyde-oplossing kunnen gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard. - Verwijder het supernatant, voeg 1 ml methanol van -20 °C toe en incubeer de buis op zijn kant bij -20 °C gedurende ten minste 18 uur.
OPMERKING: De monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C gedurende 1 maand of langer. - Verwijder het supernatant en voeg 1 ml PDT-buffer toe (0,3% v/v Triton X-100, 0,1% v/v Tween-20 en 1% v/v dimethylsulfoxide [DMSO] in PBS-buffer).
- Herhaal stap 6.4.7 en incubeer de buis bij RT gedurende 30 minuten met zacht wiegen.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml blokkeringsbuffer toe (10% v/v warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum [FBS], 2% w/v runderserumalbumine [BSA] en 0,1% v/v Tween-20 in PBS-buffer) en incubeer de buis bij RT gedurende 1 uur met zacht schommelen.
- Verwijder het supernatant en voeg 200 μL primaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer).
- Verwijder het supernatant, voeg 500 μL primaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer) en incubeer de buis bij 4 °C gedurende een nacht met zacht schommelen.
OPMERKING: Als u een nieuw primair antilichaam gebruikt, is het de moeite waard om enkele monsters zonder primaire antilichaamkleuring op te nemen om als negatieve controles te dienen. Idealiter zijn morfolino-knockdown- of gemanipuleerde gen-knock-outembryo's, of embryo's waarin de expressie van het doeleiwit is gestimuleerd, echter betrouwbaardere middelen om het antilichaam te valideren. - Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PDT-buffer toe en incubeer de buis op RT gedurende 30 minuten met zacht wiegen.
- Herhaal stap 6.4.12.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml blokkeringsbuffer toe en incubeer de buis bij RT gedurende 1 uur met zacht schommelen.
OPMERKING: De monsters moeten na deze stap worden beschermd tegen licht om fotobleking van de fluorofoor geconjugeerd op het secundaire antilichaam te voorkomen. - Verwijder het supernatant en voeg 200 μL secundaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer).
- Verwijder het supernatant, voeg 500 μL secundaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer) en incubeer de buis bij RT gedurende 1,5 uur met zacht schommelen.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PDT-buffer toe en incubeer de buis op RT gedurende 30 minuten met zacht wiegen.
- Herhaal stap 6.4.17.
- Monteer de embryo's op een 2% agaroseplaat (gemaakt met PBS, pH 7,6) en beeld de embryo's af met een stereomicroscoop (helder veld en respectievelijke fluorescerende kanalen) (figuur 5A, B, D, F).
OPMERKING: Als u de Leica M165 FC fluorescentiestereomicroscoop gebruikt, gebruik dan een vergroting van 25x om beelden met een goede resolutie te verkrijgen. - Kwantificeer/analyseer de intensiteit van het fluorescerende signaal door ImageJ (NIH). Gebruik het gereedschap Freehand Selection in ImageJ om het signaal in de betreffende regio te kwantificeren.
Representative Results
Live beeldvorming van met Z-REX behandelde transgene neutrofielen/macrofaag reporter vissen, Tg(lyz:TagRFP) en Tg(mpeg1:EGFP). Inductie van neutrofielen/macrofaag apoptose door Keap1 HNEylatie. (Zie ook figuur 2). Het effect van elektrofiele etikettering van Keap1 op neutrofielen- en macrofaagniveaus werd beoordeeld door heterozygote transgene embryo's afgeleid van Tg (lyz: TagRFP) of Tg (mpeg1: EGFP) te injecteren met mRNA dat codeert voor Halo-Keap1 en vervolgens te behandelen met Ht-PreHNE (alkyn). Volgens de procedures voor stap 6.1-downstream assay werd optie 1-HNE(alkyn) vrijgegeven en werd Keap1 gelabeld. Neutrofielen- en macrofaagniveaus werden beoordeeld door live beeldvorming van reporterlijnen, respectievelijk Tg (lyz: TagRFP) en Tg (mpeg1: eGFP). Het niveau van beide celtypen daalde met 30%-40% na Z-REX-behandeling, waarbij HNE aan Keap1 werd geleverd. Integendeel, er werd geen verlies van neutrofielen of macrofagen waargenomen in de technische controlegroepen van Z-REX [zonder licht en Ht-PreHNE (alkyn), licht alleen, of Ht-PreHNE (alkyn) alleen] (figuur 1D en figuur 2A-D).
De inductie van neutrofielen/macrofaag apoptose duidde op een succesvolle HNE-toediening aan Keap1 via Z-REX. Details voor de routeanalyse en het apoptosemechanisme zijn gepubliceerd5. Om rekening te houden met off-target effecten van HNE(alkyne) werden verschillende controles gebruikt. (1) Onder dezelfde experimentele omstandigheden werden embryo's in plaats van Halo-TeV-Keap1-mRNA geïnjecteerd met Halo-P2A-Keap1-mRNA. P2A linker maakte het mogelijk om de Halo en Keap1 eiwitten onafhankelijk van elkaar tot expressie te brengen. In dit scenario kon HNE(alkyne) vrijgegeven uit Halo Keap1 niet labelen, omdat het niet langer proximaal was aan Halo (Figuur 1D); vandaar dat de apoptose-signaleringsroute niet werd geactiveerd. In deze groep werden geen veranderingen in macrofaag- of neutrofielenspiegels waargenomen (figuur 2A,B). (2) Dezelfde experimentele omstandigheden werden uitgevoerd met behulp van mRNA-codering halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), een mutant van Keap1 die niet reageert op HNE (alkyn) (figuur 1D). Er werden geen veranderingen in macrofaag- of neutrofielenspiegels waargenomen (figuur 2G,H).
Biotine azide-klik koppeling en biotine pull-down assay. Beoordeling van doeletikettering. (Zie ook figuur 3). De beoordeling van de doeletikettering werd uitgevoerd met behulp van WT-embryo's, geïnjecteerd met mRNA-codering van Halo-TeV-Keap1-2xHA (Halo-POI-fusieconstruct) of Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (P2A-gesplitste constructie, waarin Halo en Keap1 niet zijn gefuseerd; Figuur 1D). Gelabeld Keap1-eiwit werd alleen naar beneden getrokken in de groep die fusie-eiwit tot expressie bracht en behandeld met Z-REX (tweede rijstrook in de bovenste anti-HA-vlek), maar niet in andere controlegroepen (geen mRNA-injectie, fusieconstruct zonder Z-REX of P2A-gesplitst construct). De resultaten geven aan dat de HNE (alkyn) met succes aan Keap1 werd geleverd, en de gemodificeerde Keap1 werd vervolgens geconjugeerd met biotine door klikreactie, en de biotine-gelabelde Keap1 werd naar beneden getrokken door streptavidinehars.
Transcriptionele analyse. RNA-seq en qRT-PCR. (Zie ook figuur 4). De transcriptionele verandering na behandeling met Z-REX werd beoordeeld met RNA-seq en qRT-PCR. In RNA-seq werden verschillende immuungerelateerde genen na Z-REX gedownreguleerd. Daarentegen werden veel antioxidantrespons (AR) -gerelateerde genen geupreguleerd na Z-REX, wat het gevolg was van de inductie van de Keap1-Nrf2-AR-route bij HNEylatie op Keap110 (figuur 4A). In qRT-PCR-analyse werden vergelijkbare resultaten gevonden bij het analyseren van drie immuungerelateerde genen (lyz, mpeg1.1 en coro1a) (figuur 4B). De op- en neergaande regulatie van de respectievelijke genen toonde de succesvolle inductie van routes gemedieerd door Keap1 HNEylatie.
Whole-mount (co-)immunofluorescentie kleuringstest en colokalisatieanalyse. (Zie ook figuur 5). De exogene Halo-TeV-Keap1-2xHA en Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA expressie werden beoordeeld door middel van whole-mount immunofluorescence (IF) kleuring (Figuur 5A,B). De P2A-split-construct had twee keer het aantal HA-tags dan de TeV-fusion-construct, wat overeenkomt met een tweevoudig hoger anti-HA-signaal in de P2A-split-construct-mRNA-geïnjecteerde groep dan de andere, wat aangeeft dat het expressieniveau van de twee constructen vergelijkbaar was (figuur 5C). De expressieniveaus van de Halo-TeV-Keap1 (wt) en Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) werden ook vergelijkbaar gevonden bij het onderzoeken met anti-Halo (Figuur 5D, E). Colocalisatie van neutrofielen en actief caspase 3 in met Z-REX behandelde Tg(lyz:TagRFP) werd waargenomen door co-immunostaining met anti-RFP en anti-actief-Caspase 3 (figuur 5F). Active Caspase 3 is een indicator van apoptosegebeurtenissen.
Figuur 1: Z-REX workflow. (A,B) Een 1-4 celstadium zebravis embryo wordt geïnjecteerd met (morfolino en) mRNA dat codeert voor Halo-POI (bijv. Halo-Keap1). Geïnjecteerde embryo's worden vervolgens behandeld met een sonde bestaande uit een HaloTag-ligand en een gefotocaged elektrofiel aangevuld met een alkyn-functionele groep, zoals Ht-PreHNE (alkyn) in B. Na het verwijderen van de overtollige hoeveelheid sonde, wordt het embryo blootgesteld aan licht om de elektrofiel van belang vrij te maken [bijv. HNE of zijn analoog, HNE (alkyne)]. De downstream-analyse wordt uitgevoerd op een bepaald/door de gebruiker gedefinieerd tijdstip. (C) Ontwerp en mechanisme van de Ht-PreLDE-sonde, die van toepassing is op verschillende lipide-afgeleide elektrofielen (LDE). (D) Negatieve/technische controlegroepen voor Z-REX. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Live beeldvorming van transgene neutrofielen/macrofaag reporter vissen onderworpen aan Z-REX. Z-REX-gemedieerde Keap1 HNEylatie induceert neutrofielen/macrofaag apoptose. (A) Representatieve beelden van Tg(lyz:TagRFP )-vissen die ofwel Halo-TeV-Keap1 (fusieconstruct) of Halo-P2A-Keap1 (gesplitste constructie) tot expressie brengen, en onderworpen zijn aan negatieve controleomstandigheden [geen behandeling, licht alleen, of Ht-PreHNE(alkyn) alleen of Z-REX]. Embryo leeftijd: 36 hpf. (B) Kwantificering van neutrofielenniveaus in A. (C) Representatieve beelden van Tg(mpeg1:eGFP) -vissen die Halo-TeV-Keap1 met of zonder Z-REX-behandeling tot expressie brengen. Embryo leeftijd: 34 hpf. (D) Kwantificering van macrofaagniveaus in C. (E,F) Tijdsverloopmeting van (E) neutrofielen en (F) macrofaagniveaus na behandeling met Z-REX. (G) Vergelijkbaar experiment als in A bij vissen die ofwel Halo-TeV-Keap1 (WT) ofwel Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) tot expressie brengen, een mutant die geen HNE-detectievermogen heeft. (H) Kwantificering van neutrofielenniveaus in G. Schaalstaven: 500 μm. Alle grafieken worden gepresenteerd met gemiddelde ± SEM. p-waarden werden berekend met eenrichtings-ANOVA (blauw) en tweezijdige Student's t-test (zwart). Dit cijfer is aangepast van Poganik et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Biotine pull-down assay. WT-embryo's die Halo-TeV-Keap1-2XHA of Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA tot expressie brengen, werden behandeld met Z-REX of respectievelijke negatieve controleomstandigheden (in dit geval geen sondebehandeling). Na de oogst werden embryo's gelyseerd en behandeld met TeV-protease vóór de biotine pull-down assay. De resultaten werden geanalyseerd door western blotting. Dit cijfer is aangepast van Huang et al. Z-REX: het begeleiden van reactieve elektrofielen naar specifieke eiwitten die weefselspecifiek of alomtegenwoordig tot expressie komen, en het registreren van de resulterende functionele elektrofiele geïnduceerde redoxreacties bij larvale vissen. Dit cijfer is aangepast van Huang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Transcriptionele analyse. (A) RNA-seq resultaten van Z-REX-behandelde versus niet-behandelde embryo's. Statistisch significante differentieel tot expressie gebrachte (SDE) genen worden gemarkeerd. Immuniteitsgerelateerde SDE-genen zijn rood gekleurd. Antioxidant response (AR)-gerelateerde genen zijn groen gekleurd. Andere SDE-genen zijn blauw gekleurd. Alle p-waarden werden berekend met CuffDiff. (B-D) Drie immuniteitsgerelateerde SDE-genen van A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 en (D) coro1a werden verder geanalyseerd met qRT-PCR, en alleen de met Z-REX behandelde embryo's toonden de onderdrukking van deze transcripten. Alle grafieken worden gepresenteerd met gemiddelde ± SEM. p-waarden werden berekend met eenrichtings-ANOVA (blauw) en tweezijdige Student's t-test (zwart). Dit cijfer is aangepast van Poganik et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Whole-mount immunofluorescentie kleuringstest . (A,B) Representatieve beelden van embryo's die ofwel (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA of (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA immunogekleurd met anti-HA en secundair antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor568 tot expressie brengen. mRNA-geïnjecteerde vissen werden vergeleken met leeftijdsgematchte niet-geïnjecteerde vissen. (C) Kwantificering van het anti-HA-signaal in (A,B). D) Representatieve beelden van embryo's die Halo-TeV-Keap1 (WT) of Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) immunogekleurd met anti-Halo en secundair antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor647 tot expressie brengen. mRNA-geïnjecteerde vissen werden vergeleken met leeftijdsgematchte niet-geïnjecteerde vissen. (E) Kwantificering van het anti-halosignaal in D. p-waarden werden berekend met de tweezijdige Student's t-test. f) Tg(lyz:TagRFP) -embryo's die aan Z-REX werden onderworpen, werden co-immunogekleurd met anti-RFP en anti-actief Caspase 3 en respectievelijke fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen. Het witte vak markeert het vergrote gebied. Witte pijlen duiden op colocalisaties van neutrofielen en actieve Caspase 3. Schaalstaven: 500 μm. Alle grafieken worden weergegeven met gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is aangepast van Poganik et al.7. en Huang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Lijst van buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Z-REX beschreven in dit protocol demonstreert een robuuste strategie voor elektrofiel-doelpaaronderzoek en signaalwegdeconvolutie in levende vissen. De op nabijheid gerichte toediening maakt dosering en ruimtelijke controle van de elektrofiele samengestelde behandeling mogelijk. In tegenstelling tot conventionele bolusdoseringsmethoden, waarbij de suprafysiologische concentraties van elektrofiel die worden ingezet vaak leiden tot off-target problemen, maakt de relatief kleine hoeveelheid elektrofiel die aan het systeem wordt vrijgegeven Z-REX grotendeels niet-invasief. We hebben 0,1-6 μM Ht-PreHNE (alkyn) gebruikt in zebravisembryo's en de resultaten toonden aan dat de behandeling niet schadelijk is voor de embryo-ontwikkeling11.
De Z-REX-procedure is over het algemeen langer dan T-REX, een techniek voor het screenen/bestuderen van elektrofiele sensoreiwitten in gekweekte cellen. Stel dat het doel van het experiment is om te screenen op elektrofiele-doelinteracties; we raden aan om eerst een uitgebreide screening door T-REX in gekweekte cellen uit te voeren en Z-REX te gebruiken voor in vivo validatie en fenotypische / pathway-analyse. In vergelijking met celkweek zijn de vereisten voor het uitvoeren van Z-REX basistechnieken voor het houden van vissen naast biochemische experimentele vaardigheden die door T-REX worden vereist. Een typisch tijdsbestek voor Z-REX (van viskruising tot licht-induceerbare elektrofiele levering) is 2-3 dagen, wat niet meer dan 1 dag langer is dan de typische tijd voor een T-REX-experiment op getransfecteerde levende cellen. Live beeldvorming voor fenotypische analyse kan 2-10 uur na lichtverlichting worden uitgevoerd; klikkoppeling met biotine-azide voor pull-down assay duurt 3 dagen; qRT-PCR voor het testen van transcriptionele respons duurt 3 dagen; ALS het kleuren duurt 5 dagen. Deze stappen zijn ongeveer vergelijkbaar met hun celkweekequivalenten, hoewel de interpretatie van gegevens een goed begrip van visfysiologie en reporterstammen vereist.
Als meervoudig variabele procedure12 zijn voor Z-REX verschillende controlegroepen nodig om onzekerheden in de resultaten uit te sluiten (figuur 1D). Veel voorkomende controlegroepen zijn: (1) alleen DMSO/voertuigbehandeling; (2) sondebehandeling, maar zonder lichtverlichting; (3) lichtverlichting, maar zonder sondebehandeling; (4) P2A-gesplitste constructie, waarbij Halo en de POI afzonderlijk worden uitgedrukt, zodat de nabijheidslevering wordt verbroken; en (5) hypomorfe mutanten, waarvan de elektrofiele detectieresidu(en) gemuteerd is/zijn, zoals Akt3 (C119S)6 en Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, die we in eerdere studies hebben gebruikt.
Als downstream-assays western blot-analyse omvatten, moet deyolking vóór de oogst worden uitgevoerd. De dooiereiwitten verminderen de betrouwbaarheid van lysaatconcentratiebeoordelingen en kunnen niet-specifiek binden aan antilichamen. Bij het uitvoeren van levende visbeeldvorming of whole-mount IF-kleuring hebben we ook niet-specifieke fluorescerende signalen in de dooierzak waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van autofluorescerende eiwitten in de dooierzak, of niet-specifieke binding van de antilichamen zelf. Als het autofluorescentiesignaal het signaal verstoort, raden we aan de dooierzak uit te sluiten van kwantificering of verschillende regio's afzonderlijk te kwantificeren. Dechorinatie is noodzakelijk voor het beeldvorming van levende vissen en de if-kleuringstest voor de hele montage. Het chorion kan interfereren met beeldvorming en later met kwantificering / celtelling. Dechorinatie is echter alleen van toepassing op embryo's ouder dan 1 dpf; Jongere embryo's in de blastulatie-/gastrulatie-/segmentatiestadia zijn te kwetsbaar om te worden gedechorioneerd.
Het hier beschreven Z-REX-protocol is gebaseerd op mRNA-gestuurde ectopische POI-expressie. De procedure is snel in vergelijking met het gebruik / genereren van transgene vislijnen. mRNA-gedreven expressie is alomtegenwoordig en van voorbijgaande aard en duurt ten minste 2 dagen voor mRNA's die in dit protocol worden gebruikt. De duur van de expressie zal echter waarschijnlijk in andere gevallen variëren. Deze aanpak biedt dus een snel en meer globaal onderzoeksvenster naar de effecten van een specifieke elektrofiele etiketteringsgebeurtenis, compatibel met verschillende high-throughput / high-content assays. Transgene lijnen met stabiele Halo-POI-expressie in specifieke weefsels zijn ook compatibel met Z-REX11. Dergelijke lijnen worden het best gebruikt wanneer een preciezere vraag moet worden gesteld, bijvoorbeeld wanneer een fenotype in een specifiek orgaan wordt voorspeld op basis van celkweekgegevens, of wanneer screening van mRNA-injectie-experimenten voorspelt dat een specifiek orgaan gevoelig is voor een elektrofiele etiketteringsgebeurtenis. Een hartspecifieke antioxidantresponsinductie via Z-REX werd aangetoond met behulp van Tg (gstp1: GFP; DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) vis in onze vorige publicatie11. Het kan ook mogelijk zijn om Z-REX uit te voeren op transgene vissen ouder dan 2 dpf.
Disclosures
Isoform-specifieke klein-molecuul kinaseremmers, waarvan de ontdekking mogelijk werd gemaakt door REX-technologieën, zijn ingediend voor octrooiaanvraag
Acknowledgments
Financiering: Novartis FreeNovation, NCCR en EPFL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 10-cm Petri dishes | Celltreat | 229692 | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C-S | |
| 30% Acrylamide and bis-acrylamide solution | BioRad | 1610154 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229506 | |
| Acetone | Fisher | A/0600/15 | |
| Agarose | GoldBio | A201-100 | |
| All Blue Prestained Protein Standards | BioRad | 1610373 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Biotin-dPEG11-azide | Quanta Biodesign | 102856-142 | |
| Bradford Dye | BioRad | 5000205 | |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | |
| Capillary tubes | VWR | HARV30-00200 | |
| Chloroform | Supelco, Inc | 1.02445.1000 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cu(TBTA) | Lumiprobe | 21050 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| DMSO | Fisher | D128-500 | |
| Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150107 | 1:800 (IF) |
| Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150075 | 1:1000 (IF) |
| Donkey anti-rat-AlexaFluor 568 | Abcam | ab175475 | 1:1000 (IF) |
| ECL substrate | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| ECL-Plus substrate | Thermo Fisher Scientific | 32132 | |
| End-to-end rotator | FinePCR | Rotator AG | |
| Ethanol | Fisher | E/0650DF/15 | |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Forceps (blunt) | self made | self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40) | |
| Forceps (sharp) | Fine Science Tools | Dumont #5, 11252-40 | |
| Gel loading tip | Fisher | 02-707-181 | |
| Gel/blot imager | Vilber | Fusion FX imager | |
| Glass beads | Sigma | 45-G1145 | |
| Glass stage micrometer | Meiji Techno. | MA285 | |
| Heat inactivated FBS | Sigma | F2442 | |
| Heated ultrasonic bath | VWR | 89375-470 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| High capacity streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20359 | |
| Ht-PreHNE alkyne probe | self-made | - | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
| Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
| Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS | ||
| Injection plate | Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
| LDS | Apollo | APOBI3331 | |
| Methanol | VWR | 20864.32 | |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Microscope for micro-injection | Olympus | SZ61 | |
| Microscope light source | Olympus | KL 1600 LED | |
| Mineral oil | Sigma | M3516 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| Mouse anti- β-actin-HRP | Sigma | A3854 | 1:20000 (WB) |
| Mouse anti-HaloTag | Promega | G921A | 1:500 (IF) |
| Multi-mode reader | BioTek Instruments | Cytation 5 | |
| Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus | Biorad | Mini-Sub Cell GT Systems | |
| Oligo(dT)20 | Integrated DNA Technologies | customized: (dT)20 | |
| Orange G | Sigma | O3756 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 14190144 | |
| pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | - | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
| pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | - | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
| Pneumatic PicoPump | WPI | SYS-PV820 | |
| Protein electrophoresis equipment and supplies | Biorad | Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis | |
| Rabbit anti-active Caspase-3 | BD Pharmingen | 559565 | 1:800 (IF) |
| Rat anti-HA-HRP | Sigma | H3663 | 1:500 (IF and WB) |
| Rat anti-RFP | ChromoTek | 5F8 | 1:800 (IF) |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| RnaseZap RNA decontamination solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
| Rocking Shaker | DLAB | SK-R1807-S | |
| SDS | Teknova | S9974 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080085 | |
| t-Butanol | Sigma | 471712 | |
| TCEP-HCl | Gold Biotechnology | TCEP1 | |
| TeV protease (S219V) | self-made | - | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
| Tg(lyz:TagRFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | uwm11Tg (ZFIN) | - |
| Tg(mpeg1:eGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | gl22Tg (ZFIN) | - |
| Thermal cycler | Analytik Jana | 846-x-070-280 | |
| TMEDA | Sigma | T7024 | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-9D | |
| Tris | Apollo | APOBI2888 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T9003 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| UV lamp with 365-nm light | Spectroline | ENF 240C | |
| UV meter | Spectroline | XS-365 | |
| Vortexer | Scientific Industries, Inc. | Vortex-Genie 2 | |
| Western Blotting Transfer equipment and supplies | Biorad | Mini Trans-Blot or Criterion Blotter | |
| Zebrafish husbandry and breeding equipment | in house | ||
| Zirconia beads | BioSpec | 11079107zx |
References
- Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design. RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).
- Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants. Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).
- Parvez, S., et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).
- Long, M. J. C., et al. Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).
- Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans. Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43 (2018).
- Long, M. J. C., et al. Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response. Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).
- Poganik, J. R., et al. Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera. Nature Communications. 12 (1), 5736 (2021).
- Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling. Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Wakabayashi, N., et al. Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation. Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).
- Huang, K. -T., et al. Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish. Nature Protocols. , (2023).
- Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. Hiding in plain sight: The issue of hidden variables. ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).
