Summary
このプロトコルは、マウスで下顎第一大臼歯を抽出する方法の段階的な詳細を示しています。これは、顎骨の治癒と再生に焦点を当てた研究者に代替方法を提供します。
Abstract
本研究では、マウス下顎骨の臼歯抽出モデルの開発を紹介し、歯槽骨再生と膜内骨化の研究に実用的なモデルを提供します。C57/J6マウスを用いて下顎第一大臼歯を抽出し、このモデルを確立した。彼らは安楽死させられ、両側下顎骨は術後1週間と4週間でそれぞれ収穫されました。その後の連続立体視採取、組織学的評価、および免疫蛍光染色を行い、手術の成功を実証した。手術直後、立体画像は空の抽出ソケットを表示しました。術後1週間のヘマトキシリンとエオシン(H&E)、術後4週間のマッソン染色は、元の根の領域がそれぞれ骨梁で部分的および完全に満たされていることを示しました。免疫蛍光染色の結果,術後1週間で恒常性維持側と比較してSp7発現が増加し,肺胞窩の活発な骨形成が示唆された。これらの結果はすべて、実用的なマウス抜歯ソケット治癒モデルを実証しました。顎骨欠損治癒またはソケット治癒のメカニズムを明らかにする今後の研究では、この方法を採用する可能性があります。
Introduction
抜歯後のソケット治癒は一般的な臨床シナリオであり、望ましくない治癒下でソケット出血、ドライソケット、さらには顎骨髄炎などの合併症を引き起こす可能性があります1,2,3。これらの併存疾患は、患者の生活の質を損なう可能性があり、さらに悪いことに、大量の骨量減少のために補綴リハビリテーションに極めて挑戦する可能性があります4。ソケット治癒段階は解明されていますが、さまざまな予後の課題に遭遇した場合、抜歯手術後の臨床ケアを指示するには不十分です4。
ソケット治癒過程の根底にあるメカニズムをよりよく理解し、上記の状況を回避するために、動物モデルに基づく複数の研究が行われています。Sp7は骨芽細胞分化のマスターレギュレーターであり、骨格発生、骨止血、および骨再生に重要な役割を果たしています5,6。合理的なソケット治癒モデルは、骨再生における心的外傷後のSp7の冗長性を示すことができる。加えて、長骨骨折治癒とは異なる、単一の骨形成過程のみ、膜内骨化は、抽出ソケット7の治癒過程を伴う。これにより、インプラントの骨統合は同じ骨形成規則8に従うため、動物の抜歯モデルはインプラントベースの治療法の研究に最適です。
何十年もの間、抜歯モデルはラット、ウサギ、および犬で行われてきました、なぜならこれらの種は9,10,11で操作するのに便利な大きな歯を持っているからです。しかし、遺伝子組み換えに対する需要が盛んであり、ヒトへのより適応的な遺伝的背景として、マウスは抜歯モデルを確立するためにますます使用されています。その後、研究者は、表現型を12だけ観察する代わりに、ゲノム改変マウスを使用して、ソケット治癒プロセスにおける特定の細胞集団の役割を解明することができました。マウス抜歯ソケットモデルの中で、先行研究では、マウス上顎歯および切歯抜歯ソケットの確立と治癒過程が実証されています13,14,15,16。ただし、予後の治癒パターン、および検出および観察の時点は、プロトコルによって異なる場合があります。これは、学者がマウスソケットヒーリングモデルを確立するための普遍的な基準に訴えます。
本研究は、上記の課題に対して実行可能なマウスソケットヒーリングモデルを構成することを目的とした。マウスの下顎大臼歯は、上顎大臼歯や切歯と比較して独特の形態学的特徴を持ち、独特の長所と短所をもたらします。マウス下顎骨に焦点を当てたモデルは現在真空ベースであるため、このプロトコルは、マウスで下顎第一大臼歯を抽出するための達成された方法を提供しようとしました。このプロトコルが、ソケット治癒の根底にあるメカニズムを明らかにし、臨床ケアを示すための新しいアイデアを基礎研究者に啓蒙することを願っています。
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Protocol
この研究のすべての動物の手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会によってレビューおよび承認されました(WCHSIRB-D-2017-041)。市販の供給源( 材料の表を参照)から入手した成体C57BL/6マウスを本研究に使用しました。
1.手術前の準備
- 楽器の準備
- エレベータとして使用する使い捨て注射器(26G、25G、23G、材料 表参照)の各種針を準備します。 図1に示すように、針の頭を約20°〜40°曲げます。
- 鉗子として歯付き眼科用ピンセットを準備します。マウスの大臼歯のサイズにフィットし、大臼歯をしっかりとつかむことができることを確認してください。理想的なピンセットのサイズを 図1A、B3に示します。
- 口切りとして使用する輪ゴム(医療用ラテックス手袋から引き裂くことができる)、手術プラットフォームとしてのフォームボードまたはコルクボード、手術領域を照らすヘッドランプ、および術後復活用の加熱パッドを入手してください。乾いた綿球を細かく裂き、手術中に出血が発生した場合は手術部位に適用します。
- 麻酔の準備
- マウスは、「つま先ピンチ」法によって確認された全身麻酔を達成する任意の適切な麻酔プロトコルによって麻酔することができる。麻酔後、マウスの目に獣医用軟膏を塗ります。
注:推奨される全身麻酔プロトコルは次のとおりです:キシラジン(10 mg / kg)およびケタミン(100 mg / kg)の腹腔内(IP)による誘導と維持。
この研究では、イソフルランと1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、IP)を麻酔の導入と維持に使用し、必要に応じて追加用量を使用しました。
- マウスは、「つま先ピンチ」法によって確認された全身麻酔を達成する任意の適切な麻酔プロトコルによって麻酔することができる。麻酔後、マウスの目に獣医用軟膏を塗ります。
- 消毒と滅菌の準備
- 操作プラットフォームと屋外の頭上を75%エタノール噴霧器で消毒します。各マウスの手順の前に、新しい使い捨て針のセットを使用することをお勧めします。
注意: 歯付きピンセットは再利用可能であり、蒸気滅菌などの任意の好ましい方法を使用して滅菌できます。
- 操作プラットフォームと屋外の頭上を75%エタノール噴霧器で消毒します。各マウスの手順の前に、新しい使い捨て針のセットを使用することをお勧めします。
2.手術プロセス
- マウスとその下顎骨の固定
- 粘着テープを使用して、マウスを仰臥位で手術台に結び付けます。2本の26 G針を眼窩耳面に沿って固定し、さらに2本の26 G針を下顎骨の下に簡単に固定します。
- 針の周りに輪ゴムをかけ、切歯を交差させて口を開いたままにします。舌を少し引き出し、手術側の反対側の輪ゴムの下に固定して、視野を遮らないようにします(図1C)。
- 遠位抵抗の解消
- 臼歯をピンセットで中程度に持ち、23 Gの針を遠位根の頬側歯槽骨に押し込み、間隔を空けます。
注意: 深く埋め込まれた針は根元を折る可能性があるため、この手順は細心の注意を払って実行する必要があります。 - 次に、 25G の針に変更して間隔を広げ続け、針をゆっくりと前方および舌方向に(マウスの解剖学的位置で)回転させながら、根尖周囲領域に向かって繊細に進行し、歯槽窩の根元を押し出します。
- 臼歯をピンセットで中程度に持ち、23 Gの針を遠位根の頬側歯槽骨に押し込み、間隔を空けます。
- 近心抵抗の排除
- 十分なスペースがある場合は、23 Gの針を使用してルートフォークに挿入し、大臼歯を咬合状に持ち上げます。大臼歯をしっかりと保持した後、さらに23 Gの針を取り、舌側近心歯周膜に押し込み、間隔を作ります。
- 次に、 25 G の針で代用し、ゆっくりと前方に頬側に回転させます。いくつかの根本的な障害が大臼歯の脱臼を妨げる場合は、26 Gの針を使用して根の頂点を貫通し、操作を繰り返します。
- 最終抽出
- 歯を抜歯し、抜歯中にクラウンが咬合面から高く上昇し、2つの無傷の根がはっきりと見えることを確認します。
注:歯の脱臼(脱臼)は、手順の最も痛みを伴う苦痛な瞬間と見なされます。歯を脱臼させる前に、つま先のピンチテストを使用して麻酔の深さを再評価する必要があり、したがって、必要に応じて適度な用量の麻酔薬を投与する必要があります。
- 歯を抜歯し、抜歯中にクラウンが咬合面から高く上昇し、2つの無傷の根がはっきりと見えることを確認します。
- 術後ケア
- 抜歯後、乾いた綿を塗って出血を止め、舌の位置を変え、カルプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与し、麻酔から回復するまでマウスを恒温加熱パッドに置きます。
3.マウスの下顎骨と抽出ソケットのイメージング
- サンプルの調製
- 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。眼科用ハサミを使用して、下顎骨と頬骨弓に取り付けられた骨格筋を切断します。下顎骨の下端に沿って喉から上行枝まで、次に顆の裏側まで切り取り、次に下顎骨を引き下げて下顎切歯の正中線に沿って切ります。このようにして、2つの別々の下顎骨が収穫されます。
- 固定、脱灰、脱水は、標準的な手順17に従って行います。17を埋め込むときは、咬合面がカセットの端と平行であることを確認してください( 材料の表を参照)。下顎骨を下端をコックした状態で、カセットの下部に固定します(図2)。
注:このプロトコルは、下顎骨領域の矢状面を提供します。
- ミクロトームへのサンプルの固定
- ミクロトームの標本クランプを調整して顆とクラウン側を5°〜20°さらに突き出し、根髄に付随するクラウンパルプの統合画像を取得します(図2)。
- セクションの準備
注意: 顆は常に最初に切断される解剖学的構造です。それが消えたら、大臼歯領域をいくつかのスライスにカットすることができます。- ミクロトームの範囲を5μmにシフトし、8スライスごとに収集し、最後のスライスで象牙質を探します。歯冠象牙質が根尖象牙質なしで最初に現れる場合は、試験片クランプを調整して根尖部を突き出すようにし、その逆も同様です。
- セクションの収集
注意: 象牙質がクラウンと頂端領域の両方で均等に到達するまで、切断角度は適切です。- この方向に沿ってカットし、歯髄が歯冠と根の両方に現れるまで顕微鏡下でスライスを観察します。パラフィン試料17の表面に臼歯の不明瞭な輪郭が現れたら切片を採取する。
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Representative Results
この方法の実用化を解明するため,健常C57BL/6マウス2匹(生後3ヶ月,いずれも雌)の右下顎第一大臼歯を抽出し,それぞれ1週間,4週間追跡した。損傷を受けていない左下顎骨を健康な対照として使用しました。 図1A は、26〜23Gの針および歯付き眼科用ピンセットを含む手術器具の特定の特徴を示す。26Gの針はピンポイントで取り外して曲げます。25Gの針は、ピンポイントで約25°曲げられています。23Gの針は手術の要であり、ピンポイントでそれぞれ約25°と35°に曲げられます(図1B1、B2)。ピンセットには、マウス大臼歯の形状に合う長さ1mmの歯があります(図1B3)。 図1C は、手術前のマウスの状態を示す。ポイントは、頭の周りの4本のピンの位置と、左側の輪ゴムの下に舌を固定することです。
図3A は、右下顎第一大臼歯の位置と形態を示す。 図3B は、抜歯後すぐに血餅で満たされた歯のソケットを示しています。1週間および2週間で、マウスを安楽死させ、下顎骨を脱灰し、パラフィン17に包埋し、スライスに分割した。 図4A は、1週間後のソケットの修復プロセスを示しています。いくつかのスポンジのような骨梁が形成されましたが、血餅は残りました。2週間後の治癒過程(図4B)では、ソケットはスポンジの骨で完全に満たされており、再生はほぼ完了したことを意味します。免疫蛍光(IF)染色も組織病理学染色の結果を支持した。 図5では、Sp7は骨髄細胞、特に骨形成前部である縁部に広く発現していた。恒常性状態では、骨梁は一貫しており、骨梁は一貫しており、骨髄細胞ブロックが島のように散らばっていました。しかし、術後1週間で多数のSp7発現細胞が抽出ソケットを満たし、新たに形成された骨梁が散らばっていました。術後4週で状態は逆転し、再び大部分が融合した骨梁に変わり、Sp7発現細胞の活性は恒常性状態に近いレベルまで低下しました。
図1:手術器具と手術用マウスの物体像 。 (A)手術器具は、主に26、25、23Gの針と歯付きピンセットで構成されていました。(B)針は20°-40°のピンポイントで曲げられました(B1,2)。ピンセットの歯のサイズは約1mm(B3)でなければなりません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:抜歯から切片作成までの手順のフローチャート。 この画像は、抜歯から切片作成までの概略的な流れを示しています。右下顎第一大臼歯をプロトコルに従って抽出し、次いでマウスを安楽死させ、下顎骨を採取した。収穫時に、下顎骨を4%POMに24時間浸した後、10%EDTAに再度浸しました。液体は14日間毎日更新されました。次に、サンプルを脱水し、ユニバーサルプロトコルに従ってパラフィンに包埋しました。矢状面スライスは切片化されることになっているため、頬側または舌側は下向きでなければなりません。最後に、サンプルを試料クランプに固定する場合、顆とクラウンの側面を5°〜20°突き出している必要があります。略語:POM =パラホルムアルデヒド;EDTA = エチレンジアミン四酢酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス下顎第一大臼歯と抽出ソケットの立体像。 (a)右下顎第一大臼歯の立体像、黄色矢印で示す。(B)黄色の矢印で示された術後最初の右下顎大臼歯の抽出ソケット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:H&E染色。 術後(A)1週間および(B)4週間での抽出ソケットのH&E染色。黄色の矢印は、第一大臼歯抽出ソケット治癒の近くにある下顎第二大臼歯を示す。破線の長方形の線は、治癒する第一大臼歯抽出ソケット領域を示す。スケールバー:500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:IF染色 による Sp7の検出。 この画像は、術後1週間と4週間のマウス下顎骨汁細胞と周囲の小柱骨梁の恒常性状態(健常対照)におけるSp7発現の分布を示しています。白い破線は、骨梁の推定スケールの輪郭を描いていました。黄色の矢印は典型的なSp7発現細胞を示す。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスソケット治癒モデルは、骨の治癒と再生の根底にあるメカニズムを解明し、最終的に臨床上の課題を解決するための重要な方法です。既存の研究では、切歯抽出モデルと上顎大臼歯抽出モデルの可能性が実証されていますが、研究では下顎第一大臼歯モデルを使用していません13,17,18。ただし、切歯はげっ歯類の生活に不可欠であり、その障害は致命的となる可能性があります。さらに、上顎骨の骨は下顎骨よりも海綿状であるため、治癒過程で根底にあるメカニズムにいくつかの相違点がある可能性があります。したがって、実行可能な下顎第一大臼歯抽出モデルを確立する必要があります。
抜歯における最も重要な考慮事項は、根の切れを避けることです19。マウスの大臼歯は小さくて傷つきやすく、下顎骨の残留根は抽出できません。ただし、このプロトコルでは、手術全体を通して根を壊すリスクが存在します。したがって、大臼歯をしっかりと保持し、力を厳密に制御することが重要です。具体的には、遠位抵抗を排除するときは、クラウンをくしゃくしゃにしないように注意する必要があります。近心抵抗を排除するときは、針がルートフォークから急上昇しないように注意する必要があります。針を使用して間隔をレンダリングする場合、間隔は根と肺胞突起の間にあると想定されているため、根が折れるリスクが高くなる可能性があるため、回転力をあまり加えないでください。
マウス下顎第一大臼歯の抽出は困難であり、習得するには十分なトレーニングが必要です。手術中、以下を含むがこれらに限定されない緊急事態が発生する可能性があります:(1)抜歯器具は、下顎骨と舌の可動性のために軟組織を滑らせて刺す傾向があり、軽度から重度の出血を引き起こす可能性があります。この場合、清潔な乾いた綿球を口に入れ、輪ゴムを外して、しばらく自然に閉じます。出血を止めるための圧迫は、より広い裂傷や出血を引き起こす可能性があるため、推奨されていません。(2)オペレーターは、第一大臼歯が下顎骨としっかりと結合しているため、歯槽骨プレートの予約または大臼歯根の予約に関する二者択一に直面することがよくあります。この結合力を緩和するために、オペレーターは舌骨または頬骨プレートを破壊する可能性があります。そうしないと、ソケット内の猛烈な回転力により、ルートが壊れます。骨プレートを保存するかどうかは、研究目的によって異なります。(3)下顎第一大臼歯の摘出は、上顎第一大臼歯や切歯よりも外傷性が高い場合があります。手術後にマウスが目覚めるまで、精査して見ることをお勧めします。(4)下顎第二大臼歯の近心根は、頬側の手術室が限られているため脆弱です。時には、第二大臼歯の冠さえ破壊することができます。第二大臼歯がなくても第一大臼歯抽出ソケット治癒の観察に影響しないため、この事故は無視できます。(5)抜歯中はマウスの麻酔深度を注意深く監視しますが、これは人間とげっ歯類の両方にとって痛みを伴う手順です。抽出が完了するまで麻酔の手術面を維持するために、必要に応じて麻酔薬を投与します。.さらに、輪ゴムからの長時間の圧力は、淡い膜を特徴とする舌の酸素欠乏を引き起こす可能性があります。このような場合は、マウスが回復するまでの時間を確保するために、機器を取り外して操作を直ちに停止する必要があります。
まとめると、ポイント1にリストされているように、熟練していないオペレーターがマウスに意図しない怪我を負わせる可能性があります。すべての実験動物の安全と幸福を確保するために、このスキルを習得し、実際のマウスでライブ手順を実行する前に、マウスの死体で十分な練習を行うことが強く提唱されています。
このプロトコルは、顎骨の治癒と再生に焦点を当てた研究者に代替方法を提供しますが、いくつかの欠点があります。(1)下顎骨は固定できず、幅広い柔軟性があります。その結果、エレベーターは歯槽骨に定常作用点を保持することが困難であり、いくつかの緊急事態を引き起こします。(2)成体のオスのマウスは下顎骨が強まっているので、近心抵抗を排除するのは難しいかもしれません。(3)このプロトコルは、左下顎第一大臼歯抽出には適用されません。
結論として、このプロトコルはマウス下顎第一大臼歯の抽出の詳細を示していますが、手術を成功させるには、オペレーターはまだ多くの練習と注意が必要です。
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Disclosures
この論文には、すべての元のデータと画像が含まれています。著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会81825005(L.Y.)、82201045(F.Y.)、および82100982(F.L.)、および四川省科学技術プログラム2021JDRC0144(F.L.)、2022JDRC0130(F.Y.)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23/25/26 G needle | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | |
| C57/B6J | Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China | C57/B6J | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | Cat#C1005 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST Scientific | 80106-1100-16 | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Biosharp | BL700B | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Pentobarbital Sodium | Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd | 2018042001 | |
| Rabbit polyclonal | anti-Sp7 | Abcam Cat# ab22552 | |
| Tweezers | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB2-115 |
References
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